Kết luận
Qua nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime RTPCR để định lượng nồng độ mRNA của gene đích
SERPINE1 và gene chứng GAPDH trong huyết tương
của 180 thai phụ đã được sàng lọc có nguy cơ TSG – SG
cao, chúng tôi có những kết luận như sau:
5.1. Về quy trình định lượng mRNA của gene
SERPINE1 trong huyết tương thai phụ bằng kỹ
thuật Realtime RT-PCR:
Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình định
lượng SERPINE1 mRNA bằng kỹ thuật Realtime RTPCR, cụ thể là:
- Tỷ lệ mẫu có mRNA của gene chứng GAPDH cao,
lên đến 98,9% và nồng độ trung bình là 4,45 x 105 ±
1,40 x 106 copy/ml.
- Tỷ lệ mẫu có SERPINE1 mRNA dương tính là 21,9%
với nồng độ trung bình là 2,71 x 104 ± 4,57 x 104 copy/ml.
5.2. Về mối liên quan giữa sự biểu hiện gene
SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật – sản giật:
- Nguy cơ mắc TSG – SG khi có một thai phụ có
SERPINE1 mRNA dương tính cao gấp 4,8 lần (95%CI:
1,8 – 12,9) so với thai phụ có SERPINE1 mRNA âm tính.
Nếu xem xét thêm yếu tố nồng độ mRNA gene chứng
GAPDH cao từ 104 copy/ml trở lên thì nguy cơ này cao
gấp 4,9 lần (95%CI: 1,3 – 17,7).
- Tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm có TSG
– SG là 0,120 ± 0,125; cao hơn có ý nghĩa thống kê so với
nhóm không có TSG – SG (0,036 ± 0,029). Xác suất dự báo
đúng TSG – SG cho một thai phụ có tỷ số này cao là 81,5%
(95%CI: 65,8 – 92,1%), với điểm cắt của tỷ số này > 0,0596
thì độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 75% và 77,42%.
7 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 31 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Ứng dụng kỹ thuật realtime RT - PCR để định lượng serpine1 - mrna nguồn gốc nhau thai trong huyết tương của thai phụ và khảo sát mối liên quan với tiền sản giật - sản giật, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
79
TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 13(3), 79-85, 2015
Tác giả liên hệ (Corresponding author): Cao Ngọc Thành, email: thanhykhue@yahoo.com
Ngày nhận bài (received): 18/07/2015. Ngày phản biện đánh giá bài báo (revised): 01/08/2015. Ngày bài báo được chấp nhận đăng (accepted): 01/08/2015
Cao Ngọc Thành, Nguyễn Viết Nhân, Nguyễn Vũ Quốc Huy, Hà Thị Minh Thi, Lê Phan Tưởng Quỳnh, Đoàn Hữu Nhật Bình, Trần Thị Hạ Thi, Lê Tuấn Linh, Trần Mạnh Linh
Trường Đại học Y Dược Huế
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT - PCR
ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG SERPINE1 - MRNA NGUỒN GỐC
NHAU THAI TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA THAI PHỤ VÀ
KHẢO SÁT MỐI LIÊN QUAN VỚI TIỀN SẢN GIẬT - SẢN GIẬT
Tóm tắt
Đặt vấn đề: Khảo sát mRNA nhau thai trong
huyết tương thai phụ là một phương pháp không xâm
nhập, có giá trị dự báo nguy cơ tiền sản giật – sản giật.
Nghiên cứu này nhằm mục tiêu: (1) Bước đầu
áp dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR để định lượng
mRNA của gene SERPINE1 trong huyết tương của các
phụ nữ mang thai; (2) Khảo sát mối liên quan giữa sự
biểu hiện gene SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật
– sản giật. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 180
thai phụ có tuổi thai từ 16-24 tuần được theo dõi đến
lúc sinh và 6 tuần sau sinh. mRNA của gene SERPINE1
(gene đích) và gene GAPDH (gene chứng) được định
lượng bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR với RNA được
tách từ huyết tương của thai phụ.
Kết quả: 98,9% mẫu có GAPDH mRNA dương tính
với nồng độ trung bình 4,45 x 105 ± 1,40 x 106 copy/
ml; 21,9% mẫu có SERPINE1 mRNA dương tính, nồng
độ trung bình 2,71 x 104 ± 4,57 x 104 copy/ml. Thai phụ
có SERPINE1 mRNA dương tính có nguy cơ mắc TSG –
SG cao gấp 4,8 lần (95%CI: 1,8 – 12,9) so với thai phụ
có SERPINE1 mRNA âm tính. Nếu xem xét thêm yếu tố
nồng độ mRNA gene chứng GAPDH cao từ 104 copy/
ml trở lên thì nguy cơ này cao gấp 4,9 lần (95%CI: 1,3
– 17,7). Tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm
có TSG – SG là 0,120 ± 0,125; cao hơn có ý nghĩa thống
kê so với nhóm không có TSG – SG (0,036 ± 0,029), p =
0,0012. Xác suất dự báo đúng TSG – SG cho một thai
phụ có tỷ số này cao là 81,5% (95%CI: 65,8 – 92,1%),
với điểm cắt của tỷ số này > 0,0596 thì độ nhạy và độ
đặc hiệu lần lượt là 75% và 77,42%.
Kết luận: Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy
trình định lượng SERPINE1 mRNA bằng kỹ thuật Realtime
RT-PCR. Sự biểu hiện gene SERPINE1 ở mức mRNA có thể
là một yếu tố giúp dự báo nguy cơ TSG – SG.
Từ khoá: Tiền sản giật, SERPINE1 mRNA.
Abstract
APPLYING REALTIME RT-PCR FOR QUANTIFYING
PLACENTAL SERPINE1 – MRNA IN MATERNAL PLASMA
AND IDENTIFYING ASSOCIATION WITH PREECLAMPSIA
Background: Detection of placental mRNA
expression in maternal plasma seems noninvasive
method by which to predict the risk of preeclampsia.
This study aimed to: (1) Applying Realtime RT-PCR
to quantify SERPINE1 mRNA in maternal plasma; (2)
Survey the association between SERPINE1 mRNA
expression and preeclampsia.
Patients and methods: 180 pregnant women at
16-24 gestational weeks were followed until delivery
and 6 weeks after. mRNA expression of SERPINE1 gene
(target gene) and GAPDH gene (control gene) were
evaluated by Realtime RT-PCR in with mRNA extracted
from maternal plasma.
Results: 98.9% samples were GAPDH mRNA
positive, mean concentration was 4.45 x 105 ± 1.40 x
106 copies/ml; 21.9% samples were SERPINE1 mRNA
positive, mean concentration was 2.71 x 104 ± 4.57
x 104 copies/ml. The presence of SERPINE1 mRNA in
maternal plasma increased the risk of developing
preeclampsia (RR: 4.8, 95%CI: 1.8 – 12.9). In group
having GAPDH mRNA concentration higher than
104 copies/ml, the presence of SERPINE1 mRNA in
maternal plasma also increased the risk of developing
preeclampsia (RR: 4.9, 95%CI: 1.3 – 17.7). Ratio of
SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA in preeclamptic
pregnant women was significantly higher than
normal group, 0.120 ± 0.125 and 0.036 ± 0.029,
respectively (p = 0.0012). The preeclampsia-predictive
value was 81.5% (95%CI: 65.8 – 92.1%), the cut-off
value > 0.0596 gave a sensitivity of 75% and specificity
of 77.42%, respectively.
Conclusion: The procedure for quantifying
SERPINE1 mRNA by Realtime RT-PCR was
successfully applied. Increasing SERPINE1 mRNA
expression in maternal plasma could be a risk factor
of preeclampsia.
Keywords: Preeclampsia, SERPINE1 mRNA.
CAO NGỌC THÀNH, NGUYỄN VIẾT NHÂN, NGUYỄN VŨ QUỐC HUY, HÀ THỊ MINH THI,
LÊ PHAN TƯỞNG QUỲNH, ĐOÀN HỮU NHẬT BÌNH, TRẦN THỊ HẠ THI, LÊ TUẤN LINH, TRẦN MẠNH LINHSẢN KHOA VÀ SƠ SINH
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
80
1. Đặt vấn đề
Tiền sản giật – sản giật (TSG – SG) chiếm tỷ lệ
khoảng 3-7% các phụ nữ mang thai trên toàn thế giới
với nhiều biến chứng cho cả thai nhi và bà mẹ [12].
Biến chứng ở thai nhi bao gồm trọng lượng khi sinh
thấp, sinh non hoặc tử vong chu sinh. Biến chứng ở
thai phụ bao gồm suy thận, hội chứng HELLP (tan
máu, tăng enzyme gan, giảm tiểu cầu), suy gan, phù
não với triệu chứng co giật và có thể tử vong, đây là
nguyên nhân tử vong thứ hai ở các bà mẹ mang thai,
chỉ đứng sau băng huyết sau sinh. Ngoài ra, hậu quả
của tiền sản giật còn kéo dài dai dẳng sau khi sinh,
với biến chứng đáng lưu ý là rối loạn chức năng nội
mạc làm người mẹ có nguy cơ cao mắc các bệnh lý
tim mạch.
Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của tiền sản
giật – sản giật cho đến nay vẫn chưa được hiểu biết
một cách rõ ràng, vì vậy biện pháp điều trị và chiến
lược dự phòng đang còn hạn chế. Tuy nhiên, nhau
thai đã được xác nhận là đóng một vai trò rất quan
trọng trong cơ chế bệnh sinh vì những dấu hiệu của
tiền sản giật – sản giật vẫn có thể xảy ra trên một
thai trứng (không có thai) và bệnh lý này chỉ có thể
được giải quyết triệt để một khi đưa được nhau thai
ra ngoài. Sự phát triển của nhau thai tùy thuộc vào sự
xâm nhập thích hợp của lá nuôi phôi, sự tái tạo mạch
máu và luồng máu ở khoang giữa các nhung mao
[13]. Những người bị tiền sản giật – sản giật thường
biểu hiện tình trạng tăng đông máu bao gồm đông
máu nội mạch, vi huyết khối và suy giảm tuần hoàn tử
cung – nhau thai [6]. Những nghiên cứu gần đây cho
thấy trong quá trình mang thai bình thường, lá nuôi
phôi (trophoblast) tổng hợp và tiết ra một lượng lớn
các cytokine đóng vai trò quan trọng trong đông máu
và tiêu sợi huyết hệ thống cũng như của nhau thai
như các yếu tố hoạt hóa plasminogen (t-PA và u-PA).
Các yếu tố này làm biến đổi plasminogen bất hoạt trở
thành plasmin hoạt hóa có hoạt tính proteinase, do
đó làm tiêu fibrin. Để duy trì sự cân bằng hệ thống tiêu
sợi huyết và đông máu, nhau thai cũng tiết ra yếu tố
ức chế hoạt hóa plasminogen 1 (PAI-1: plasminogen
activator inhibitor 1). Sự quá biểu hiện PAI-1 có thể
làm ức chế giáng hóa fibrin, từ đó dẫn đến hiện
tượng tập trung fibrin quanh các nhung mao màng
đệm và giảm trao đổi chất dinh dưỡng trong nhau
thai, đây là những mắc xích quan trọng trong cơ chế
bệnh sinh tiền sản giật – sản giật [14]. Nhiều tác giả
như Estelles (1994) đã xác nhận một sự gia tăng có ý
nghĩa của nồng độ PAI-1 trong huyết tương của các
phụ nữ tiền sản giật – sản giật so với phụ nữ mang
thai bình thường [2]. PAI-1 là sản phẩm mã hóa của
gene SERPINE1 (serine peptidase inhibitor, clade E,
member 1) nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7
(7q22.1), gene dài 12,2 kb gồm 9 exon và 8 intron [7].
Năm 2000, Poon và cs đã phát hiện được những
sản phẩm phiên mã RNA đặc hiệu thai trong huyết
tương mẹ bằng kỹ thuật RT-PCR [10]. Năm 2003, Ng
và cộng sự đã thành công trong việc sử dụng kỹ thuật
Realtime PCR để định lượng các mRNA nguồn gốc
nhau thai lưu hành trong máu mẹ (các mRNA của các
gen hPL, βhCG) [9]. Các tác giả trên cũng đã chứng
minh được những mRNA này là mRNA tự do ngoài tế
bào (cell-free mRNA) thông qua việc sử dụng phương
pháp lọc, đồng thời các mRNA nhau thai này thanh
thải khỏi máu mẹ rất nhanh sau khi sinh. Như vậy,
việc khảo sát biểu hiện mRNA nhau thai trong huyết
tương mẹ được xem như là một phương pháp để
theo dõi chức năng nhau thai [11]. Purwosunu và cs
năm 2007 và 2009 đã định lượng nồng độ mRNA của
gene SERPINE1 trong huyết thanh của những phụ nữ
mang thai từ 15-20 tuần và nhận thấy có sự gia tăng
có ý nghĩa thống kê trong nhóm phụ nữ sau đó bị tiền
sản giật – sản giật, đồng thời mức biểu hiện mRNA
này có mối liên quan chặt chẽ với mức độ trầm trọng
của bệnh [11], [12].
Để góp phần tìm hiểu các yếu tố dự báo nguy cơ
tiền sản giật – sản giật ở mức độ phân tử, nhằm hỗ trợ
xây dựng chiến lược dự phòng bệnh lý này, chúng tôi
thực hiện đề tài này với các mục tiêu sau:
(1) Bước đầu áp dụng kỹ thuật Realtime RT – PCR
để định lượng mRNA của gene SERPINE1 có nguồn
gốc nhau thai trong huyết tương của các phụ nữ
mang thai.
(2) Khảo sát mối liên quan giữa sự biểu hiện gene
SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật – sản giật.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
180 thai phụ có tuổi thai từ 16-24 tuần đến khám
thai định kỳ và tham gia chương trình sàng lọc nguy cơ
tiền sản giật – sản giật tại bệnh viện Trường Đại học Y
Dược Huế trong thời gian từ tháng 11 năm 2013 đến
tháng 1 năm 2015.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu theo phương pháp tiến cứu:
180 thai phụ sau khi được khám thai và thu thập các
thông tin và xác định nguy cơ tiền sản giật – sản giật
đều được theo dõi đến lúc sinh và thêm 6 tuần sau đó
để xác định có hay không có tiền sản giật – sản giật.
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
81
TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 13(3), 79-85, 2015
2.2.2. Tiêu chuẩn chẩn đoán
Tiền sản giật – sản giật được chẩn đoán theo Hướng
dẫn chuẩn quốc gia về các dịch vụ chăm sóc sức khỏe
sinh sản như sau:
- Chẩn đoán tiền sản giật khi có các triệu chứng sau:
+ Huyết áp tâm thu > 140 mmHg hoặc huyết áp
tâm trương > 90 mmHg, đo ít nhất hai lần, khi tuổi thai
trên 20 tuần.
+ Protein niệu > 3 g/l.
- Tiền sản giật nặng khi có ít nhất một trong các
triệu chứng sau :
+ Huyết áp tâm thu > 160 mmHg hoặc huyết áp
tâm trương > 110 mmHg, đo ít nhất hai lần, khi tuổi
thai trên 20 tuần.
+ Protein niệu ≥ 5 g/24 giờ hoặc ≥ 3 g trên hai mẫu
nước tiểu được lấy cách nhau ít nhất 4 giờ.
Ngoài ra có thể có thêm các dấu hiệu: thiểu niệu
(lượng nước tiểu < 400 ml/24 giờ), đau đầu nhưng
không đáp ứng với các thuốc giảm đau thông thường,
rối loạn thị giác và tri giác, phù phổi hoặc xanh tím, đau
vùng thượng vị hoặc phần tư trên của hạ sườn phải.
- Sản giật: Có cơn giật với 4 giai đoạn điển hình
(xâm nhiễm, giật cứng, giật giãn cách và hôn mê), kèm
theo một số dấu hiệu tiền sản giật nặng.
2.2.3. Tiêu chuẩn loại trừ
- Các thai phụ từ chối tham gia nghiên cứu mRNA.
- Các thai phụ không theo dõi được đến hết 6 tuần
sau sinh để phân nhóm có và không có tiền sản giật
– sản giật.
- Các thai phụ được phát hiện có kèm chửa trứng.
2.2.4. Quy trình định lượng SERPINE1 mRNA
- Tách chiết RNA toàn phần: Lấy 7 ml máu tĩnh mạch
của các thai phụ, chống đông trong EDTA, tách lấy
huyết tương rồi quay ly tâm với vận tốc 1600g trong 10
phút ở 4oC. RNA toàn phần được tách từ 800 μl huyết
tương (được chia thành 4 phản ứng tách chiết) theo
phương pháp PHENOL/CHCL3. Nồng độ RNA và A260/
A280 của mẫu được đo bằng máy Nano drop.
- Tổng hợp cDNA: Phản ứng RT-PCR để tổng hợp
cDNA gồm 8 μl RT-Mix, 15 μl dịch chiết RNA toàn phần
cho vào ống có chứa sẵn 1 enzyme RT (kit cDNA-H
Synthesis). Cho ống phản ứng vào máy luân nhiệt
Sure Cycler 8800 (Agilent Technologies), với chu kỳ
nhiệt là 25°C trong 5 phút; 42°C trong 30 phút; 85°C
trong 5 phút; giữ ở 04°C. Mỗi lần đều có chạy kèm với
1 ống chứng dương và 1 ống chứng âm.
- Thực hiện phản ứng Realtime PCR: Mỗi ống phản
ứng gồm 12,5 µl iPremium qPCR Master Mix 2X; 1,2 µl
primer-probe(*) tương ứng, 11,3 µl dung dịch cDNA
đã được tổng hợp ở trên. Cho ống phản ứng vào máy
Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies), với chu
kỳ nhiệt là biến tính ở 95°C trong 15 giây, gắn mồi ở
60°C trong 1 phút (đọc kết quả tại bước này). Mỗi lần
chạy phản ứng đều có chạy kèm một bộ chuẩn với 3
nồng độ là 102, 104 và 106 copy/μl.
(*): Sử dụng TaqMan® Gene Expression Assays
(Applied Biosystems) gồm có PCR primer không đánh
dấu và TaqMan MGB probe đánh dấu FAM.
+ Đối với gene SERPINE1: Human assay ID là
Hs00167155_m1
+ Đối với gene GAPDH: Human assay ID là
Hs99999905_m1
- Đọc kết quả bằng phần mềm MxPro v4.10 được
tích hợp theo máy Realtime PCR. Nồng độ đo được
biểu thị theo đơn vị số copy/ml huyết tương, sau khi
đã hiệu chỉnh với hệ số pha loãng.
2.2.5. Xử lý số liệu
Các nồng độ mRNA của gene đích SERPINE1 và
gene chứng GAPDH được biểu thị theo số copy/ml.
Tính tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA để so sánh
giữa các nhóm có và không có TSG – SG. Sử dụng
phần mềm thống kê y học MedCalc v.12 để thực hiện
các kiểm định: t-test để so sánh trị trung bình, tính
nguy cơ tương đối (RR: Relative risk), vẽ đường cong
ROC cùng các trị số liên quan để đánh giá giá trị dự
báo của chỉ điểm.
3. Kết quả nghiên cứu
Trong 180 thai phụ được đưa vào nghiên cứu và
theo dõi đến hết thời kỳ hậu sản, đã có 14 trường hợp
xuất hiện TSG – SG, chiếm tỷ lệ 7,9%.
3.1. Đánh giá quy trình định lượng mRNA của
gene SERPINE1 trong huyết tương của các phụ nữ
mang thai bằng kỹ thuật Realtime PCR
3.1.1. Chất lượng RNA toàn phần được tách từ
huyết tương
Nhận xét: Nồng độ RNA toàn phần trong huyết
tương các thai phụ trung bình là 65,8 ng/ml với
100% số mẫu có A260/A280 trong khoảng 1,8 –
2,0, đạt tiêu chuẩn để thực hiện các kỹ thuật phân
tích RNA.
3.1.2. Kết quả định lượng GAPDH mRNA (gene
chứng) bằng kỹ thuật Realtime PCR
Nhận xét: Tỷ lệ mẫu định lượng được GAPDH mRNA
bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR rất cao, đến 98,9%
(178/180). Nồng độ GAPDH mRNA cũng rất cao.
Nồng độ RNA trung bình (ng/μl) Độ lệch chuẩn Tỷ lệ A260/A280 đạt tiêu chuẩn 1,8 – 2,0
65,8 79,8 100%
Bảng 3.1. Nồng độ RNA toàn phần được tách chiết (ng/μl)
= 3,1%; trong khi ở các mẫu nồng độ GAPDH mRNA từ
104 copy/ml trở lên, tỷ lệ SERPINE1 mRNA dương tính
đạt đến 37/114 = 32,5%. Nồng độ SERPINE1 mRNA của
các mẫu dương tính cũng khá cao, trung bình là 2,71
x 104 copy/ml.
3.1.3.2. Tương quan giữa nồng độ SERPINE1 mRNA và
nồng độ GAPDH mRNA
Hệ số tương quan r = 0,7152; p < 0,0001; 95%CI =
0,5162 – 0,8410
Nhận xét: Có mối tương quan thuận và chặt giữa
nồng độ SERPINE1 mRNA với nồng độ GAPDH mRNA.
3.2. Mối liên quan giữa sự biểu hiện gene
SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật – sản giật
3.2.1. Tỷ lệ các thai phụ được phát hiện TSG – SG trong
nhóm nguy cơ cao
Nhận xét: Sau khi theo dõi các thai phụ được sàng
lọc nguy cơ cao TSG – SG cho đến ngày sinh và kéo dài
thêm 6 tuần sau sinh, phát hiện có 14 bà mẹ bị TSG –
SG, chiếm tỷ lệ 7,9%.
3.2.2. Nguy cơ tương đối mắc TSG – SG theo chỉ điểm
SERPINE1 mRNA dương tính
Nhận xét: Phân tích nguy cơ tương đối (RR: relative
risk) cho thấy nguy cơ mắc TSG – SG khi có một thai phụ
3.1.3. Kết quả định lượng mRNA của gene
SERPINE1 (gene đích) bằng kỹ thuật Realtime PCR
Nồng độ SERPINE1 mRNA của nhóm các thai phụ
được trình bày trên 178 mẫu có kết quả định lượng
GAPDH mRNA.
3.1.3.1. Nồng độ SERPINE1 – mRNA
Nhận xét: Tỷ lệ mẫu đạt SERPINE1 mRNA dương tính
có xu hương tăng dần theo nồng độ GAPDH mRNA
tương ứng. Ở các mẫu nồng độ GAPDH mRNA dưới 104
copy/ml, tỷ lệ SERPINE1 mRNA dương tính chỉ đạt 2/64
CAO NGỌC THÀNH, NGUYỄN VIẾT NHÂN, NGUYỄN VŨ QUỐC HUY, HÀ THỊ MINH THI,
LÊ PHAN TƯỞNG QUỲNH, ĐOÀN HỮU NHẬT BÌNH, TRẦN THỊ HẠ THI, LÊ TUẤN LINH, TRẦN MẠNH LINHSẢN KHOA VÀ SƠ SINH
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
82
Hình 1: Hình ảnh kết quả định lượng GAPDH mRNA và SERPINE1 mRNA bằng kỹ thuật
Realtime RT-PCR (mẫu 56)
Nồng độ mRNA của gene GAPDH (copy/ml)
Nhóm thai phụ (n = 180)
Số mẫu Tỷ lệ %
0 2 1,1
Dưới 101 2 1,1
Từ 101 – dưới 102 8 4,4
Từ 102 – dưới 103 17 9,4
Từ 103 – dưới 104 37 20,6
Từ 104 – dưới 105 39 21,7
Từ 105 – dưới 106 61 33,9
Từ 106 – dưới 107 13 7,2
Từ 107 trở lên 1 0,6
X ± SD 4,45 x 105 ± 1,40 x 106
Bảng 3.2. Nồng độ GAPDH mRNA
Nồng độ GAPDH mRNA (copy/ml)
SERPINE1 – mRNA dương tính
Số mẫu Tỷ lệ %
Từ 100 – dưới 101 (n = 2) 0 0,0
Từ 101 – dưới 102 (n = 8) 0 0,0
Từ 102 – dưới 103 (n = 17) 1 5,9
Từ 103 – dưới 104 (n = 37) 1 2,7
Từ 104 – dưới 105 (n = 39) 5 12,8
Từ 105 – dưới 106 (n = 61) 24 39,3
Từ 106 – dưới 107 (n = 13) 8 61,5
Từ 107 trở lên (n = 1) 0 0,0
Tổng (n = 178) 39 21,9
Nồng độ SERPINE1 mRNA trung bình của 39 mẫu dương tính 2,71 x 104 ± 4,57 x 104
Bảng 3.3. Nồng độ SERPINE1 mRNA trung bình và tỷ lệ dương tính theo các mức nồng độ GAPDH mRNA
Hình 2: Đồ thị tương quan giữa nồng độ SERPINE1 mRNA và GAPDH mRNA
Phân nhóm theo nồng độ GAPDH mRNA (copy/ml)
Phát hiện tiền sản giật – sản giật
Số thai phụ Tỷ lệ %
Dưới 104 (n = 64) 4 6,3
Từ 104 trở lên (n = 114) 10 8,8
Tổng (n = 178) 14 7,9
Bảng 3.4. Tỷ lệ các thai phụ được phát hiện TSG - SG trong nhóm nguy cơ cao
Nồng độ GAPDH mRNA (copy/ml) của các thai phụ được khảo sát RR TSG – SG Không TSG -SG RR (95%CI)
Từ 104 trở lên (n = 114)
SERPINE1 mRNA (+) 7 30 4,9 (1,3 – 17,7)
p = 0,017SERPINE1 mRNA (-) 3 74
Từ 100 trở lên (n = 178)
SERPINE1 mRNA (+) 8 31 4,8 (1,8 – 12,9)
p = 0,002SERPINE1 mRNA (-) 6 133
Bảng 3.5. Nguy cơ tương đối mắc TSG – SG theo chỉ điểm SERPINE1 mRNA dương tính
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
83
TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 13(3), 79-85, 2015
có SERPINE1 mRNA dương tính cao gấp 4,9 lần so với thai
phụ có SERPINE1 mRNA âm tính, nếu chỉ xét khi kết quả
định lượng mRNA gene chứng GAPDH cao từ 104 copy/
ml trở lên. Nguy cơ này cũng cao gấp 4,8 lần nếu xét trên
toàn bộ thai phụ có mRNA gene chứng dương tính.
3.2.3. Tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm
có và không có TSG – SG
Nhận xét: Tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA
ở nhóm có TSG – SG cao hơn có ý nghĩa thống kê so
với nhóm không có TSG – SG (0,120 ± 0,125 so với
0,036 ± 0,029).
3.2.3. Khảo sát đường cong ROC đối với chỉ điểm là tỷ
SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA
- Diện tích dưới đường cong ROC (AUC) = 0,815
(95%CI: 0,658 – 0,921)
- Điểm cắt tối ưu: > 0,0596.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng tại điểm cắt
này lần lượt là 75% và 77,42%.
4. Bàn luận
4.1. Đánh giá quy trình định lượng mRNA của
gene SERPINE1 trong huyết tương của các phụ nữ
mang thai bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.
4.1.1. Chất lượng RNA toàn phần
Trong những năm đầu thế kỷ 21, nhiều nhà nghiên
cứu đã chứng minh được sự hiện diện của RNA trong
huyết tương của người [10]. Trước đây, phát hiện này
được ứng dụng chủ yếu trong chẩn đoán và theo dõi
bệnh lý ung thư. Về sau, nhiều tác giả đã chứng minh
mRNA nguồn gốc nhau thai cũng hiện diện trong huyết
thanh mẹ với sự ổn định đáng kể và nhanh chóng được
SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA TSG – SG (n = 8) Không TSG – SG (n = 31) p (t-test)
Trung bình 0,120 0,036
0,0012
Độ lệch chuẩn 0,125 0,029
Bảng 3.6. So sánh tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm có và không có TSG – SG
Hình 3: Đường cong ROC thể hiện giá trị của tỷ SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA trong dự báo TSG - SG
thanh thải sau khi sinh [9]. Điều này đã mở ra những hứa
hẹn chẩn đoán và theo dõi trước sinh không xâm nhập
cho nhiều tình trạng bệnh lý khác nhau, trong đó có TSG
– SG [3], [8], [11]. Trong phạm vi đề tài này, với mục đích
khảo sát mRNA của gene SERPINE1 (một gene được biểu
hiện ở nhau thai) trong huyết tương mẹ, bước đầu chúng
tôi đã tách RNA toàn phần trong huyết tương của 180
phụ nữ mang thai với tuổi thai từ 16 – 24 tuần tuổi. Kết
quả ở bảng 3.1 cho thấy nồng độ RNA được chiết tách
ở các mẫu là 65,8 ± 79,8 ng/μl. Giá trị nồng độ như vậy
là đủ để thực hiện các kỹ thuật phân tích RNA. Việc tách
RNA thường khó khăn hơn so với tách DNA vì RNA dễ bị
phân hủy bởi nhiều loại nuclease hơn so với DNA. Ngoài
ra, RNA tự do trong huyết tương có nồng độ thường rất
thấp nhưng chúng tôi đã chiết tách được với các nồng
độ trên là một thành tích khá khả quan, tạo điều kiện
cho việc phân tích biểu hiện gene ở mức RNA. Về chất
lượng RNA được tách chiết, chúng tôi đánh giá bằng tỷ
số A260/A280 (đo trên máy Nano drop), kết quả các mẫu
của chúng tôi có tỷ số này nằm trong giới hạn 1,8 – 2,0,
chứng tỏ mẫu rất tinh sạch, hầu như không lẫn protein.
4.1.2. Kết quả định lượng GAPDH mRNA (gene
chứng) bằng kỹ thuật Realtime PCR
Trong qui trình định lượng mRNA bằng kỹ thuật
Realtime RT-PCR, chúng tôi thực hiện song song các
phản ứng đặc hiệu với gene đích và gene GAPDH, trong
đó GAPDH được sử dụng làm chứng dương cho quy trình
này. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng gene GAPDH
để làm chứng dương [8], [11], [14]. Kết quả ở bảng 3.2
cho thấy tỷ lệ thành công của phản ứng Realtime RT-PCR
đối với gene GAPDH của chúng tôi là 98,9%. Tỷ lệ dương
tính với GAPDH mRNA trong các mẫu nghiên cứu rất
cao như vậy cho phép khẳng định độ tin cậy cao trong
việc ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại phòng thí
nghiệm của chúng tôi. Khi khảo sát nồng độ trung bình
của GAPDH mRNA trong các mẫu dương tính chúng tôi
thu được giá trị nồng độ X ± SD là 4,45 x 105 ± 1,40 x 106
copy/ml. Nồng độ GAPDH mRNA trong nghiên cứu của
chúng tôi khá cao, trong khi trong nghiên cứu của Ng
(2003) thì khá thấp, kết quả định lượng trên 6 mẫu huyết
tương thai phụ với tuổi thai từ 7-14 tuần chỉ đạt mức
1,08 x 102 copy/ml [9]. Sự khác biệt này là tuổi thai trong
nghiên cứu của Ng chỉ từ 7-14 tuần, trong khi đó tuổi thai
trong nghiên cứu của chúng tôi lớn hơn, từ 16-24 tuần.
4.1.3. Kết quả định lượng mRNA của gene SERPINE1
(gene đích) bằng kỹ thuật Realtime RT - PCR
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy trong 178 mẫu huyết
tương thai phụ được khảo sát có 39 mẫu có nồng độ
SERPINE1 mRNA dương tính, chiếm tỷ lệ 21,9%. Nghiên
cứu của Poon năm 2000 cho thấy tỷ lệ phát hiện RNA
CAO NGỌC THÀNH, NGUYỄN VIẾT NHÂN, NGUYỄN VŨ QUỐC HUY, HÀ THỊ MINH THI,
LÊ PHAN TƯỞNG QUỲNH, ĐOÀN HỮU NHẬT BÌNH, TRẦN THỊ HẠ THI, LÊ TUẤN LINH, TRẦN MẠNH LINHSẢN KHOA VÀ SƠ SINH
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
84
thai trong máu mẹ ở nhóm tuổi thai 11-19 tuần là
22% và ở nhóm 26-40 tuần là 63% [10]. Nghiên cứu
của chúng tôi thực hiện với mRNA của gene SERPINE1
có nguồn gốc nhau thai ở nhóm thai phụ có tuổi thai
16-24 tuần với tỷ lệ phát hiện 21,9% là phù hợp. Trong
nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy ở các mẫu có nồng
độ GAPDH mRNA thấp dưới 104 copy/ml thì hầu như
không phát hiện được SERPINE1, chỉ 2/54 mẫu. Trong
khi đó tỷ lệ phát hiện ở nhóm có nồng độ GAPDH mRNA
cao trên 104 copy/ml thì tỷ lệ phát hiện cao hơn nhiều
đến 37/124 mẫu (32,5%). Đồ thị tương quan giữa hai
nồng độ SERPINE1 mRNA và GAPDH mRNA cũng cho
thấy mối tương quan thuận và chặt, với r = 0,7152, p <
0,0001. Từ kết quả này, chúng tôi cho rằng muốn khảo
sát mối liên quan giữa SERPINE1 mRNA với TSG – SG thì
không thể sử dụng nồng độ tuyệt đối mà phải xem xét
trong mối liên quan với tỷ SERPINE1 mRNA / GAPDH
mRNA. Tác giả Teng và Farina cũng sử dụng một khái
niệm tương tự và biểu thị dưới dạng “–ΔΔCt” (Ct: số chu
kỳ ngưỡng) [14] và nồng độ tương đối [3].
4.2. Mối liên quan giữa sự biểu hiện gene
SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật – sản giật
Chúng tôi đã theo dõi các thai phụ được sàng lọc
nguy cơ cao TSG – SG cho đến ngày sinh và kéo dài
thêm 6 tuần sau sinh, phát hiện có 14 bà mẹ bị TSG – SG,
chiếm tỷ lệ 7,9%; trong đó có 4 bà mẹ TSG – SG thuộc
nhóm nồng độ GAPDH mRNA dưới 104 copy/ml và 10
bà mẹ TSG – SG thuộc nhóm nồng độ GAPDH mRNA
từ 104 copy/ml trở lên. Như vậy, chúng tôi sẽ sử dụng
nhóm 14 bà mẹ TSG – SG và 164 không mắc TSG – SG để
phân tích nguy cơ. Ngoài ra chúng tôi xét thêm yếu tố có
nồng độ mRNA gene chứng GAPDH được định lượng ở
mức cao từ 104 copy/ml trở lên, khi đó nhóm có TSG –SG
là 10 người và nhóm không có TSG –SG là 104 người.
Kết quả phân tích nguy cơ tương đối (RR: relative risk)
ở bảng 3.5 cho thấy nguy cơ mắc TSG – SG khi có một
thai phụ có SERPINE1 mRNA dương tính cao gấp 4,8 lần
(95%CI: 1,8 – 12,9) so với thai phụ có SERPINE1 mRNA
âm tính. Nếu xem xét thêm yếu tố nồng độ mRNA gene
chứng GAPDH cao từ 104 copy/ml trở lên thì nguy cơ này
cao gấp 4,9 lần (95%CI: 1,3 – 17,7). Như vậy, nghiên cứu
của chúng tôi cho thấy SERPINE1 mRNA là một yếu tố
giúp dự báo nguy cơ mắc TSG – SG rất có giá trị.
Như đã phân tích ở phần 4.1.3, chúng tôi nhận thấy
nồng độ SERPINE1 mRNA tương quan chặt và thuận với
nồng độ GAPDH mRNA (gene chứng) nên chúng tôi
không so sánh nồng độ tuyệt đối của SERPINE1 mRNA
giữa hai nhóm có và không có TSG – SG. Thay vào đó,
chúng tôi sử dụng tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA
để so sánh. Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy tỷ số SERPINE1
mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm có TSG – SG là 0,120 ±
0,125; cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm không
có TSG – SG (chỉ 0,036 ± 0,029) với p = 0,0012. Một nghiên
cứu của Purwosunu (Nhật Bản, 2007) thực hiện trên 43
thai phụ TSG – SG và 41 thai phụ bình thường có tuổi
thai từ 35 – 41 tuần cho thấy MoM của SERPINE1 mRNA
(còn gọi là PAI-1 mRNA) ở nhóm TSG – SG cao gấp 2,48
lần so với nhóm bình thường, p < 0,001 [11]. Nghiên cứu
khác của Purwosunu và cs năm 2009 trên 372 thai phụ
có tuổi thai từ 15 – 20 tuần cho thấy trung bình của nồng
độ SERPINE1 mRNA (tác giả sử dụng log10 scale của số
copy/ml) ở nhóm TSG – SG (n = 62) là 2,66 ± 0,57, cao
hơn có ý nghĩa thống kê so với ở nhóm không TSG – SG
(n = 310) là 2,27 ± 0,39, với p = 0,001 [12]. Bên cạnh đó,
vẫn có một nghiên cứu của Farina (2006) theo dõi trên
36 phụ nữ mang thai có 6 người TSG – SG và 30 người
bình thường, kết quả nồng độ tương đối (RC: relative
concentration) của SERPINE1 mRNA ở nhóm TSG – SG
thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường,
giá trị trung bình của RC là 2.257.443 so với 3.071.068, p <
0,05 [3]. Tuy nhiên, sau đó cũng chính Farina đã tham gia
trong các nghiên cứu của Porwosunu năm 2007, 2009 và
cũng có nhận định tương tự chúng tôi.
Trước đây, nhiều nghiên cứu ở mức biểu hiện protein
cũng có nhận định protein PAI-1 (sản phẩm mã hóa của
gene SERPINE1 ở nhau thai) tăng cao ở nhóm TSG – SG
so với nhóm bình thường. Năm 1989, Feinberg đã tìm
thấy PAI-1 trong lá nuôi phôi người [4]. Từ đó mở ra hàng
loạt các nghiên cứu về protein này trong các bệnh lý
liên quan nhau thai mà đặc biệt là TSG – SG. Đầu tiên là
nghiên cứu của Halligan năm 1994 [5] và sau đó Estelles
khẳng định lại vào năm 1998 [2] về nồng độ PAI-1 huyết
tương mẹ tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê ở nhóm TSG
– SG so với nhóm bình thường. Năm 2009, Teng và cs đã
định lượng SERPINE1 mRNA trong tổ chức nhau thai và
nhận thấy nồng độ của nhóm TSG – SG cao hơn nhóm
bình thường có ý nghĩa thống kê, giá trị –ΔΔCt của hai
nhóm lần lượt là 66,15 ± 27,70 và 59,52 ± 47,29, p < 0,05
[14]. Những nghiên cứu này đã cho thấy kết quả nghiên
cứu của chúng tôi là phù hợp. Có nhiều giả thuyết có thể
giải thích cho sự thay đổi của RNA trong huyết tương mẹ
này. Sự biến đổi liên quan apoptosis trong lá nuôi của
nhung mao nhau thai trong các phụ nữ TSG – SG là một
nguyên nhân làm phóng thích các acid nucleic trong
máu mẹ [1]. Hiện tượng nhồi máu lan rộng trong nhau
thai của bệnh nhân TSG – SG cũng liên quan với hoạt
tính miễn dịch có tính chỉ điểm cho hệ thống hoạt hóa
plasminogen (PA) [2], [4].
Ngoài ra, trong nghiên cứu này chúng tôi còn khảo
sát đường cong ROC dựa trên kết quả tỷ số SERPINE1
Tập 13, số 03
Tháng 08-2015
Tạp chí PHỤ SẢN
85
TẠP CHÍ PHỤ SẢN - 13(3), 79-85, 2015
mRNA / GAPDH mRNA của 39 thai phụ, kết quả cho
thấy diện tích dưới đường cong ROC (AUC) là 0,815,
chứng tỏ tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA có giá
trị dự báo TSG – SG tốt, xác suất đúng là 81,5%. Theo
chương trình thống kê MedCalc mà chúng tôi sử dụng,
điểm cắt tối ưu được gợi ý cho dự báo là > 0,0596, với
độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng lần lượt là 75% và
77,42%. Kết quả này một lần nữa khẳng định nồng độ
tăng cao của SERPINE1 mRNA trong máu mẹ là một
yếu tố dự báo TSG – SG.
5. Kết luận
Qua nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật Realtime RT-
PCR để định lượng nồng độ mRNA của gene đích
SERPINE1 và gene chứng GAPDH trong huyết tương
của 180 thai phụ đã được sàng lọc có nguy cơ TSG – SG
cao, chúng tôi có những kết luận như sau:
5.1. Về quy trình định lượng mRNA của gene
SERPINE1 trong huyết tương thai phụ bằng kỹ
thuật Realtime RT-PCR:
Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình định
lượng SERPINE1 mRNA bằng kỹ thuật Realtime RT-
PCR, cụ thể là:
- Tỷ lệ mẫu có mRNA của gene chứng GAPDH cao,
lên đến 98,9% và nồng độ trung bình là 4,45 x 105 ±
1,40 x 106 copy/ml.
- Tỷ lệ mẫu có SERPINE1 mRNA dương tính là 21,9%
với nồng độ trung bình là 2,71 x 104 ± 4,57 x 104 copy/ml.
5.2. Về mối liên quan giữa sự biểu hiện gene
SERPINE1 ở mức mRNA với tiền sản giật – sản giật:
- Nguy cơ mắc TSG – SG khi có một thai phụ có
SERPINE1 mRNA dương tính cao gấp 4,8 lần (95%CI:
1,8 – 12,9) so với thai phụ có SERPINE1 mRNA âm tính.
Nếu xem xét thêm yếu tố nồng độ mRNA gene chứng
GAPDH cao từ 104 copy/ml trở lên thì nguy cơ này cao
gấp 4,9 lần (95%CI: 1,3 – 17,7).
- Tỷ số SERPINE1 mRNA / GAPDH mRNA ở nhóm có TSG
– SG là 0,120 ± 0,125; cao hơn có ý nghĩa thống kê so với
nhóm không có TSG – SG (0,036 ± 0,029). Xác suất dự báo
đúng TSG – SG cho một thai phụ có tỷ số này cao là 81,5%
(95%CI: 65,8 – 92,1%), với điểm cắt của tỷ số này > 0,0596
thì độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 75% và 77,42%.
Tài liệu tham khảo
1. DiFederico E., Genbacev O.,Fisher S. J. (1999),
“Preeclampsia is associated with widespread apoptosis
of placental cytotrophoblasts within the uterine wall”, The
American journal of pathology, 155(1), pp. 293-301.
2. Estelles A., Gilabert J., Keeton M., Eguchi Y., Aznar J.,
Grancha S., Espna F., Loskutoff D.,Schleef R. (1994), “Altered
expression of plasminogen activator inhibitor type 1 in
placentas from pregnant women with preeclampsia and/or
intrauterine fetal growth retardation”, 84(1), pp. 143-150.
3. Farina A., Sekizawa A., Purwosunu Y., Rizzo N., Banzola
I., Concu M., Morano D., Giommi F., Bevini M.,Mabrook M.
(2006), “Quantitative distribution of a panel of circulating
mRNA in preeclampsia versus controls”, Prenatal
diagnosis, 26(12), pp. 1115-1120.
4. Feinberg R., Kao L.-C., Haimowitz J., Queenan Jr J., Wun
T., Strauss 3rd J.,Kliman H. (1989), “Plasminogen activator
inhibitor types 1 and 2 in human trophoblasts. PAI-1 is an
immunocytochemical marker of invading trophoblasts”,
Laboratory investigation; a journal of technical methods
and pathology, 61(1), pp. 20-26.
5. Halligan A., Bonnar J., Sheppard B., Darling M.,Walshe J.
(1994), “Haemostatic, fibrinolytic and endothelial variables in
normal pregnancies and pre‐eclampsia”, BJOG: An International
Journal of Obstetrics & Gynaecology, 101(6), pp. 488-492.
6. Lanir N., Aharon A.,Brenner B. (2003), “Haemostatic
mechanisms in human placenta”, Best Practice & Research
Clinical Haematology, 16(2), pp. 183-195.
7. Loskutoff D. J., Linders M., Keijer J., Veerman H., Van
Heerikhuizen H.,Pannekoek H. (1987), “Structure of the
human plasminogen activator inhibitor 1 gene: nonrandom
distribution of introns”, Biochemistry, 26(13), pp. 3763-3768.
8. Ng E. K., Leung T. N., Tsui N. B., Lau T. K., Panesar N. S.,
Chiu R. W.,Lo Y. D. (2003), “The concentration of circulating
corticotropin-releasing hormone mRNA in maternal plasma
is increased in preeclampsia”, Clinical Chemistry, 49(5), pp.
727-731.
9. Ng E. K., Tsui N. B., Lau T. K., Leung T. N., Chiu R. W.,
Panesar N. S., Lit L. C., Chan K.-W.,Lo Y. D. (2003), “mRNA of
placental origin is readily detectable in maternal plasma”,
Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(8),
pp. 4748-4753.
10. Poon L. L., Leung T. N., Lau T. K.,Lo Y. D. (2000),
“Presence of fetal RNA in maternal plasma”, Clinical
Chemistry, 46(11), pp. 1832-1834.
11. Purwosunu Y., Sekizawa A., Koide K., Farina A.,
Wibowo N., Wiknjosastro G. H., Okazaki S., Chiba H.,Okai
T. (2007), “Cell-free mRNA concentrations of plasminogen
activator inhibitor-1 and tissue-type plasminogen activator
are increased in the plasma of pregnant women with
preeclampsia”, Clinical chemistry, 53(3), pp. 399-404.
12. Purwosunu Y., Sekizawa A., Okazaki S., Farina
A., Wibowo N., Nakamura M., Rizzo N., Saito H.,Okai T.
(2009), “Prediction of preeclampsia by analysis of cell-free
messenger RNA in maternal plasma”, American Journal of
Obstetrics and Gynecology, 200(4), pp. 386.e1-386.e7.
13. Redman C. W.,Sargent I. L. (2005), “Latest advances
in understanding preeclampsia”, Science, 308(5728), pp.
1592-1594.
14. Teng Y.-C., Lin Q.-D., Lin J.-H., Ding C.-W.,Zuo Y. (2009),
“Coagulation and fibrinolysis related cytokine imbalance in
preeclampsia: the role of placental trophoblasts”, Journal of
perinatal medicine, 37(4), pp. 343-348.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
ung_dung_ky_thuat_realtime_rt_pcr_de_dinh_luong_serpine1_mrn.pdf