Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất cồn

1,1-1,6 laàn. Xeùt veà hình thaùi thì caû 4 chuûng ñeàu coù hình oval nhöng chuûng XII coù kích thöôùc lôùn vaø maäp hôn so vôùi caùc chuûng khaùc. Soá löôïng teá baøo trong 1 ml laø moät trong nhöõng chæ tieâu quan troïng ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng men gioáng. Tuy nhieân, khi duøng caùc chuûng men khaùc nhau ñeå leân men dòch ñöôøng, chuùng ta khoâng neân chæ döøng laïi ôû soá teá baø trong 1 ml maø phaûi caên cöù theâm vaøo caùc chæ soá cuûa dòch leân men cuoái cuøng nhö ñoä coàn, haøm löôïng ñöôøng vaø tinh boät soùt trong giaám chín… Ñeå xeùt xem chuûng naøo coù khaû naêng cho hieäu suaát leân men cao, ngöôøi ta tieán haønh thí nghieäm tieáp baèng caùch nuoâi caáy 4 chuûng men gioáng trong nhöõng ñieàu kieän nhö nhau, sau 20 giôø ñem laøm men gioáng vôùi soá löôïng 10% so vôùi dòch ñöôøng leân men. Sau 72 giôø leân men, ngöôøi ta ñem phaân tích caùc chæ tieâu cuûa giaám chín vaø tính löôïng CO2 thoaùt ra trong quaù trình leân men. Keát quaû trung bình cuûa ñôït thí nghieäm cuûa 1 soá chuûng naám men Caùc chæ tieâu Chuûng naám men XII MTB T 33 Noàng ñoä ñöôøng hoùa , %khoái löôïng Chaát khöû tính theo Glucose, g/l Ñoä chua, g H2SO4/l pH dòch ñöôøng hoùa Löôïng CO2 thoaùt ra sau 72 giôø, g/200ml Ñoä chua giaám chín, g H2SO4/l pH giaám chín Chaát khöû soùt trong giaám chín, g/l Noàng ñoä röôïu, %V 14,0 30,3 1,06 4,95 12,69 1,51 4,66 9,21 7,12 14,0 30,3 1,06 4,95 11,85 1,67 4,50 10,6 6.73 14,0 30,3 1,06 4,95 11,21 1,85 4,55 11,27 6,45 14,0 30,3 1,06 4,95 10,89 1,92 4,42 11,55 6.30 Theo doõi quaù trình leân men vaø caên cöù vaøo soá lieäu thu ñöôïc, ta thaáy chuûng XII cho hieäu suaát keân men cao hôn so vôùi caùc chuûng ñem so saùnh. Trong saûn xuaát coàn etylic, muoán ñaït hieäu suaát cao tröôùc tieân phaûi tuyeån choïn chuûng naám men coù hoaït löïc leân men maïnh. Trong ñieàu kieän nöôùc ta hieän nay, ta coù theå duøng chuûng XII ñeå leân men dòch ñöôøng tinh boät vaø chuûng IA ñeå leân men ræ ñöôøng. Caàn chuù yù : moät chuûng toát ôû nôi naøy chöa haún thích nghi ngay ôû moät nôi khaùc vì vaäy tröôùc khi aùp duïng caàn nghieân cöùu kó ñaëc tính sinh lí vaø khaû naêng sinh saûn cuõng nhö saûn löôïng saûn phaåm taïo thaønh. Trong saûn xuaát coù nhöõng tröôøng hôïp ngaãu nhieân ngöôøi ta tìm ñöôïc chuûng toât hôn baèng caùch phaân laäp töø caùc thuøng leân men. Chuûng XII vaø IA nhaän ñöôïc baèng con ñöôøng keå treân. 4- Điều kiện lên men: Cơ chất (nguồn C): tinh bột, rỉ đường Nồng độ đường: 10 – 16% pH: 4 – 5 Nhiệt độ: 28 – 300C Nhu cầu về oxy: Giai đoạn đầu của lên men cần cung cấp một lượng nhỏ O2 vì đây là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và lipid. Áp suất của O2 vào khoảng 0,05 – 0,10 mmHg. Đến giai đoạn sau không cung cấp oxy nữa. Nhu cầu dinh dưỡng: + Cần một lượng tương đối các chất dinh dưỡng dùng trong sự tổng hợp ethanol, gồm C, H, O, N. Nó tỉ lệ thuận với thành phần chính của tế bào nấm men. + Các nguyên tố P, S, K, Mg cần một lượng ít hơn, dùng để tổng hợp các thành phần thứ yếu. + Các muối vô cơ ( Mn, Co, Cu, Zn) và các nhân tố sinh trưởng hữu cơ ( acid amin, acid nucleic, vitamine…) được yêu cầu dưới dạng vết. Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế của ethanol. Với nồng độ cồn 1 – 2% (khối lượng/thể tích) đã làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ở nồng độ 10% (khối lượng/thể tích) thì tốc độ sinh trưởng của nấm men gần như ngừng hẳn. 5-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae a.Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ tối ưu của nấm men saccharomyces là khoảng 28 – 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Mặt khác làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Sau 8 – 10 giờ, nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28 – 300C, tiếp đó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu. Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men giảm nhanh, chủ yếu là dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 300C men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 -380C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần. Khi lên men ở 29,50C, tổn thất do tạo men là 7,37 %, ở 17,50C tổn thất do tạo men là 5,32 % và nếu lên men dịch đường ở 100C thì tổn thất do tạo men chỉ chiếm 4,42 % lượng đường có trong dung dịch. Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều esther, aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. b.Ảnh hưởng của pH Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH nhất định. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo alcohol ethylic là 4,5 – 5,0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8 – 5,2; nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hóa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Tăng pH sẽ dễ bị nhiễm khuẩn; glyxerin tạo nhiều hơn và giảm hiệu suất lên men. Vì vậy, khi gây men giống trong điều kiện sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,8 – 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Ở pH 4,2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH = 4,5 – 5,0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển. Tới lúc nào đó nấm men phát triển nhiều và đủ mạnh ta tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã nhiều và đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn cũng khó gây tác hại cho lên men. Phương pháp này được áp dụng để gây men trong điều kiện sản xuất và gọi là nuôi cấy nấm men thuần khiết tự nhiên. Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng sẽ không ở dạng tự do mà liên kết hóa học với các muối và giải phóng acid hữu cơ, phosphoric tự do, chủ yếu ở dạng KH2SO4 và NaH2PO4. Giữa ion H + và lượng acid có tương quan nhất định đối với mỗi dung dịch nào đó, ví dụ cùng một pH nhưng độ chua của dịch đường hóa từ ngô bao giờ cũng lớn hơn từ sắn . Trong thực tế sản xuất không phải cơ sở nào cũng có điều kiện đo pH, mà thường chỉ xác định độ chua. Đối với mỗi dung dịch nào đó thì pH có thể xem như gần ổn định còn độ chua lại thay đổi nhiều phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn của nguyên liệu và dịch lên men. Khi nhiễm khuẩn sẽ tạo acid hữu cơ có độ phân ly thấp nên ít làm thay đổi pH. Vì vậy trong sản xuất rượu không chỉ xác định pH mà còn xác định độ chua. Độ chua có thể biểu diễn theo độ hay theo gam acid / lít. Một độ chua được biểu diễn bằng 1ml dung dịch NaOH 2N vừa đủ để trung hòa acid tự do chứa trong 20 ml dịch hoặc biểu diễn độ chua bằng gam H2SO4/lít dịch, 10 chua = 2,45 g /l. c.Ảnh hưởng của nồng độ lên dịch men Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là cồn nhiều sẽ ức chế không những tạp khuẩn mà cả nấm men, dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men. Nồng độ dịch đường thấp làm giảm năng suất thiết bị lên men, tốn hơi khi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải. Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16 – 18 % ( tùy theo mức độ thuần khiết), tương đương 13 – 15% đường, để sau khi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 – 9,5 % V. d.Ảnh hưởng của một số hóa chất và chất sát trùng Trong điều kiện sản xuất, dù có vệ sinh sạch đến mấy cũng khó đảm bảo vô trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. Có thể dùng hóa chất khác nhau như clorua vôi, formalin, fluosilicat natri. Tùy theo chất lượng của hóa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chế được phát triển của tạp khuẩn nhưng không làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nấm men. Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ không vượt quá 0,02% so với dịch lên men. Ảnh hưởng của một số acid tới nấm men: Acid Nồng độ Thời gian tiêu diệt, giờ Làm ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men % Mol/l % Mol/l HCl 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46 H2SO4 0,39 0,039 1,30 0,123 2,04 H3PO4 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28 CH3COOH 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25 Acid lactic 0,90 0,100 3,00 0,333 1,27 Tùy theo tính chất và mức độ phân ly của mỗi acid mà tác hại của chúng lên nấm men sẽ không giống nhau. Ngoài ra, trong dịch đường lên men luôn chứa một lượng furfurol, melanoidin, cũng gây ảnh hưởng tới nấm men. Furfurol hạn chế khả năng nảy chồi và kích thước tế bào, tạo ra các hạt trong không bào. Furfurol chứa nhiều trong mật rỉ có thể làm giảm khả năng tạo rượu và tăng các tạp chất, giảm hoạt độ của maltase và zymase của nấm men. Khi dịch chứa 4 – 6 triệu tế bào/ml thì 0,002% furfurol sẽ ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và sinh lý của dịch lên men; khi dịch lên men chứa 90 triệu / ml thì 0,006% furfurol mới ảnh hưởng tới sinh lý nấm men. Hàm lượng furfurol trong mật rỉ thường vào khoảng 6 đến 8 g / 100 g chất khô. Nếu mật rỉ pha loãng tới 20 – 22% thì nồng độ sẽ khoảng 1,5 – 2,0 mg / 100ml (0,0015 – 0,002%). Trong điều kiện lên men với tỉ lệ men giống lớm hơn 10%, ảnh hưởng của furfurol xem như không đáng kể. Melanoidin có ảnh hưởng không giống nhau đối với các chủng men. Nó ảnh hưởng xấu đến sinh sản của chủng B và IA, chỉ trong 12 giờ đầu đối với chủng r-176 và r-202, melanoidin ảnh hưởng suốt trong thời gian 24 giờ, số tế bào ít hơn 1,3 – 2 lần so với môi trường chứa 0,005 – 0,3g/100 ml. Caramela không bị hấp thụ trên bề mặt nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ làm nhiều tế bào bị chết đi. e.Ảnh hưởng của sục khí Sục khí để hòa tan oxy vào dịch đường, giúp cho nấm men phát triển nhanh hơn. Tuy nhiên, sục khí không cần thiết đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột. Sục khí sẽ làm tăng lượng đường bay hơi. Mặt khác nếu dư dẫn đến tạo nhiều sinh khối và aldehyde, do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu. Thực tế thì không cần sục khí vào dịch đường. Một lượng nhỏ oxy sẽ được hòa tan trong thời gian khuấy và làm lạnh, đủ đảm bảo cho sinh trưởng phát triển và lên men. Với tỉ lệ men giống 10%, sau 50 giờ lên men nồng độ biểu kiến của dịch đã giảm tới số lượng không đổi với hầu hết thùng lên men. Sau 70 – 72 giờ nồng độ rượu trong giấm chín đạt trung bình 9% V, đường sót chỉ vào khoảng 0,3 – 0,5 %. f.Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung Ở nước ta, cồn được sản xuất chủ yếu từ nguyên liệu sắn. Do trong sắn chứa ít protid nên lượng nitơ trong dịch đường hóa không đảm bảo cho phát triển của nấm men. Bổ sung nitơ vào dịch lên men Các chỉ tiêu Mẫu kiểm chứng không bổ sung nitơ Nguồn nitơ từ (NH4)2SO4 (NH2)2CO - Nồng độ chất khô dịch đường , % 16,5 16,5 16,5 - Đường khử tính theo maltose g/ 100ml 4,09 4,09 4,09 - pH dịch đường hóa 5,26 5,26 5,26 - pH giấm chín 4,55 4,00 4,93 - Tăng độ chua 0,31 0,42 0,12 - Độ khô biểu kiến giấm chín -0,35 -0,40 -0,77 - Chất khử sót, % 0,43 0,34 0,14 - Tinh bột sót, % 0,05 0,046 0,042 - Nồng độ rượu trong giấm chín, %V 9,66 9,78 10,04 - Hiệu suất rượu so với lý thuyết, % 91,21 92,35 94,80 Bổ sung nitơ với số lượng 30 mg/100ml sẽ rút ngắn thời gian từ 84 giờ xuống 60 giờ, đồng thời lên men cũng tốt và đạt hiệu quả cao hơn mẫu đối chứng. Trong đó nguồn nitơ từ ure cho kết quả tốt hơn. II- CƠ CHẾ LÊN MEN RƯỢU: Dịch men gồm rất nhiều tế bào men riêng biệt, 1 gam men ướt có độ ẩm khoảng 70-75 % chứa tới 14 tỉ tế bào. Bề mặt của mỗi tế bào chiếm 5.10-5mm2. Như vậy một gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7000 cm2. Nhờ có bề mặt lớn này nên nấm men hấp thụ đường và các chất dinh dưỡng rất nhanh. Ñöôøng hoùa xong, dòch ñöôøng ñöôïc laøm laïnh tôùi 28-32oC vaø bôm vaøo thuøng leân men. Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào bên trong. Ở đó, các enzyme sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo sản phẩm chính là rượu và khí carbonic. Hai chất này đều khuyếch tán và tan vào môi trường xung quanh. Rượu do rất linh động nên hòa tan nhanh trong dịch lên men, còn khí cacbonic hòa tan kém và khuếch tán chậm. Lúc đầu hòa tan hoàn toàn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào men và lớn dần tới mức lực đẩy Archimede lớn hơn khối lượng tế bào men cộng bọt khí. Lúc đó tế bào cùng bọt khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ tan vỡ và hợp thành tiếng rào rào (men ăn). Bọt khí tan, tế bào men sẽ chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp thụ và lên men rồi lại sản sinh ra rượu và khí carbonic Như vậy, tế bào nấm men từ chỗ là vi sinh vật không chuyển động đã biến thành tế bào luôn chuyển động trong quá trình lên men. Nhờ đó mà tăng nhanh tốc độ chuyển hóa đường thành rượu. Khi đường và các chất dinh dưỡng trong canh trường còn ít, một lượng lớn tế bào nấm men sẽ lắng xuống đáy thùng, dịch lên men sẽ trong dần. 1- Cơ chế hóa sinh học của quá trình lên men 1. Do xúc tác của glucokinase, glucose kết hợp với gốc phosphat của phân tử ATP (adenoxintriphosphat) trong tế bào nấm men để tạo thành glucose-6-phosphat và ADP: glucokinase C6H12O6 +ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO + ADP 2. Gluco-6-phosphat do tác dụng của enzyme đồng phân gluco phosphat isomerase sẽ biến thành fructo phosphat: CH2O(H2PO3)(CHOH)4CHO CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2OH 3. Dưới tác dụng của enzime phosphofructokinase, phân tử ATP thứ hai sẽ đính thêm một gốc phosphat nữa vào fructo-6-phosphat để tạo thành fructo-1,6-diphosphat và phân tử ADP thứ hai: CH2O(H2PO3) (CHOH)3COCH2OH + ATP CH2O(H2PO3)(CHOH)3COCH2O(H2PO3) +ADP [Giai đoạn thực hiện các nối liên kết cao năng thành dạng dễ biến đổi dưới tác dụng của các enzime]. 4. Mạch cacbon của fructodiphosphat thành hai phân tử triose: aldehyde phosphoglyceric và phosphodioxyacetone (xúc tác: aldolase): CH2O(H2PO3)CO(CHOH)3CH2O(H2PO3) CH2O(H2PO3)COCH2OH +CH2O(H2PO3)CHOHCHO 5. Sản phẩm của quá trình trước là aldehyde phosphoglyceric nhưng trong dịch lên men chúng chứa rất ít do hiện tượng đồng phân dưới tác dụng của enzime triphosphat isomerase: CH2O(H2PO3)COCH2OH CH2O(H2PO3)CHOHCHO 6. Hai phân tử aldehyde phosphoglyceric bị oxi hóa. Phản ứng này có sự tham gia của acid phosphoric trong canh trường nhờ xúc tác của enzyme triphosphatdehydronase, coenzime của nó là NAD (Nicotinamid-Adenin-dinucleotid). Phân tử 3-phosphoglyceroaldehyde kết hợp với phosphat, còn hidro chuyển sang coenzime NAD: 2CH2O(H2PO3)CHOHCHO + 2H3PO4 +2NAD 2CH2O(H2PO3)CHOHCOO~H2PO3 + 2NADH2 [Năng lượng được giải phóng do oxy hóa 3-phosphoglyceroaldehyde sễ tióch tụ trong liên kết cao năng của acid 1,3-diphosphoglyceric mới tạo thành]. 7. Với sự tham gia của phosphoglyceratkinase, gốc phosphat chứa cao năng của acid 1,3-diphosphoglyceric sẽ chuyển vào phân tử. Kết quả 3-phosphoglyceric được tạo thành , còn Adp nhận thêm năng lượng và biến thành, còn ADP nhận thêm năng lượng và biến thành ATP: 2CH2(H2PO3)CHOHCOO~(H2PO3) + 2ADP 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH + 2ATP 8. Dưới tác dụng của enzime phosphoglyceromutase, gốc acid phosphoric sẽ chuyển từ vị trí cacbon thứ ba sang cacbon thứ hai. Kết quả là 3-phosphoglyceric biến thành acid 2-phosphoglyceric theo phản ứng: 2CH2O(H2PO3)CHOHCOOH 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 9. Dưới tác dụngcủa enolase, acid 2-phosphoglyceric sẽ mất nước và biến thành acid phosphopyrovic: 2CH2OHCHO(H2PO3)COOH 2CH3CO(H2PO3)COOH + 2H2O 10. Acid phosphopyrovic rất không bền nên dễ bị mất gốc acid phosphoric do enzime pyrovatkinase và do đó acid pyrovic được tạo thành: 2CH2=CO~(H2PO3)COOH + 2ADP 2CH3CO-COOH + 2ATP 11. Acid pyrovic bị decacbocyl để tạo thành aldehyde acetic: 2CH3CO-COOH 2CO2 + 2CH3CHO 12. Aldehyde acetic bị khử bởi NADH2: 2CH3CHO + 2NADH2 2CH3CH2OH + 2NAD Tóm lại, Phương trình tổng quát của quá trình lên men như sau: Enzyme zymase C6H12O6 2CO2 + 2CH3CH2OH Trong quá trình lên men rượu, mỗi phân tử gam glucose sẽ giải phóng ra khoảng 50 kcal. Năng lượng này được nấm men sử dụng chừng 20 kcal. Số còn lại sẽ thải ra canh trường do đó làm tăng nhiêt độ dịch lên men. Theo Euler, nhiệt này chiếm 28 kcal/ trên phân tử glucose. 2- Tiến hành lên men rượu a. Động học của quá trình lên men Tốc độ của quá trình lên men có thể xác định trực tiếp bằng lượng đường lên men, hoặc gián tiếp tính được lượng rượu tạo thành và lượng CO2 thoát ra trong một đơn vị thời gian. Cũng có thể xác định nhanh bằng cách đo nồng độ biểu kiến của dịch lên men. Lên men được chia thành 3 giai đoạn: lên men sơ bộ, lên men chính và lên men phụ. Trong giai đoạn đầu, thời gian kéo dài gần 60 giờ, đặc trưng cho thời kì tiềm phát, lượng đường được lên men rất ít. Giai đoạn thứ hai kéo dài từ khoảng giờ thứ 60 đến giờ thứ 120, sinh trưởng của nấm men và lên men tăng nhanh, đạt tới cực đại- đặc trưng cho thời kì lên men chính. Giai đoạn ba đăc trưng cho lên men phụ kéo dài, tốc độ lên men rất chậm vì lượng đường trong dịch còn rất ít, các dextrin chưa kịp biến thành đường. Trong điều kiện sản xuất, lượng men giống đưa vào nhiều (8-10%) nên tốc độ lên men xảy ra rất nhanh. Trung bình mỗi giờ ở giai đoạn lên men chính, nồng độ đường giảm 1%. Thời gian tiềm phát phụ thuộc vào lượng men giống đưa vào, thường chỉ từ 5-8 giờ. Tiếp đó chuyển sang lên men chính, cuối cùng là lên men phụ. Thời gian lên men phụ dài hay ngắn phụ thuộc chủ yéu vào lượng enzime có khả năng phân cắt nối α-1,6 glucoside. Vì rằng dextrin chỉ có thể lên men sau khi đã thủy phân thành glucose hoặc maltose (điều này không xảy ra với lên men rỉ đường). Tốc độ lên men chính phụ thuộc vào lượng men giống, còn tốc độ lên men phụ thuộc vào số α-1,6 glucoside và hoạt độ enzime thủy phân nó. b. Phöông phaùp lên men Lên men có thể tiến hành theo sơ đồ gián đoạn, bán liên tục hoặc liên tục. Lên men gián đoạn Thùng phải được vệ sinh sạch sẽ các đường ống và van phải được sát trùng thường xuyên. Sau đó toàn bộ được thanh trùng bằng hơi nước. Thời gian giữ ở 95- 1000C kéo dài 50-60 phút. Thanh trùng xong thùng được làm lạnh đến 300C, tháo hết nước ngưng rồi đóng van đáy. Men giống và dịch đường ban đầu có thể bơm song song để nấm men được hòa đều ngay từ đầu. Lượng men giống thường chiếm 10 % so với thể tích thùng lên men, nhưng dịch đường không bơm đầy thùng ngay mà thời gian đổ đầy một thùng lên men kéo dài từ 6-8 giờ. Nhờ đó tỉ lệ men giống lúc đầu tăng và hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Sau khi đổ đầy thùng ta để cho lên men và cứ 8 giờ lấy đường lên men đem lọc để xác định độ chua. Đồng thời theo dõi nhiệt độ và luôn khống chế thấp hơn 330C. Về cuối nhiệt độ có thể giảm đến 280C. Lên men được xem là bình thường nếu sau 50 giờ, độ đường biểu kiến của dịch lên men đã xuống tới 0 (với rỉ đường sẽ khác), còn độ chua không tăng quá 0,8 gam H2SO4/lít so với độ chua của dịch đường trước khi lên men. Trường hơp độ chua khi lên men tăng nhanh, độ đường biểu kiến giảm chậm thì phải nghĩ ngay tới nhiễm khuẩn, cần kiểm tra vi sinh vật và xử lí kịp thời. Lên men được xem là kết thúc nếu sau 8 giờ độ đường biểu kiến không giảm hoặc chỉ giảm 0,1-0,2 %. Lên men gián đoạn ở các thùng riêng biệt có ưu điểm dễ làm, khi nhiễm dễ xử lí nhưng năng suất thu được từ 1 m3 thiết bị thấp. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn đang được áp dụng chủ yếu ở nước ta và cũng cho hiệu suất khá. Lên men liên tục Đặc điểm của lên men liên tục là dịch đường và men giống được cho vào thùng đầu (thùng lên men chính) luôn chứa một lượng lớn tế bào trong 1 ml dịch. Khi đầy thùng đầu thì dịch men sẽ chảy tiếp sang các thùng bên cạnh và cuối cùng là thùng chứa giấm chín. Ưu điểm nổi bật của sơ đồ lên men liên tục là dùng một lượng lớn men giống nên lên men xảy ra nhanh, hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn. Khác với lên men gián đoạn là lượng giống ban đầu chỉ 12-15 triệu tế bào/ml nên lên men xảy ra chậm. Nhiều men giống không những áp đảo được tạp khuẩn mà còn tạo rượu nhanh, hạn chế sự phát triển của chúng. Mặt khác do độ chua của dịch đường cao, pH thấp cũng là một yếu tố không thuận lợi cho vi khuẩn và nấm men hoang dại. Sau 24 giờ đã có 78 % đường được lên men, trong khi đó ở lên men gián đoạn mới chỉ đạt 42 %. Lên men liên tục là phương pháp tiến bộ và cho hiệu quả cao. Tuy nhiên khi áp dụng cần tính toán cẩn thận và có biện pháp công nghệ phù hợp, nếu không sẽ phản tác dụng, dễ nhiễm khuẩn hàng loạt dẫn đến giảm hiệu suất lên men. Lên men liên tục sẽ kết thúc sau 60-62 giờ, còn lên men gián đoạn vẫn phải kéo dài tới 72 giờ và hơn nữa. Lên men cải tiến – bán liên tục Để tăng cường tỉ lệ lên men giống mà không cần thêm thiết bị gây men, ta thực hiên dùng ngay lượng men ở các thùng đang lên men mạnh ở giai đoạn lên men chính, bằng cách dùng acid sulfuric đưa pH về 4,0-4,2; kết hợp với bơm tuần hoàn và làm lạnh. Sau 1-2 giờ tan bơm ½ dịch lên men sang thùng khác để làm men giống. Tiếp đó từ từ thêm dịch đường vào cả hai thùng cho tới đầy và để cho lên men tiếp. III- NHAÄN XEÙT, ÑAÙNH GIAÙ CAÙC PHÖÔNG PHAÙP LEÂN MEN: 1.Phương thức lên men giaùn ñoaïn Thông thường thời gian đòi hỏi cho việc sử dụng hòan tòan cơ chất là từ 36-48 giờ. Nhiệt độ được giữ ở 20- 30oC và pH ban đầu được điều chỉnh tới 4,5. Tùy thuộc vào bản chất của nguyên liệu hidrat C, hệ số chuyển hóa nằm vào khỏang 90- 95% con số lý thuyết với một nồng độ etanol cuối cùng đạt được là 10-16 % (w/v). Công nghệ lên men giaùn ñoaïn đã được vận hành nhiều trong quá khứ vì có thể vận hành dễ dàng, đòi hỏi thấp về khử trùng triệt để, không cần nhân công có tay nghề cao, không có nguy cơ tổn hại về tài chính và nguyên liệu dễ xử lý. Tuy nhiên những nhược điểm vốn có của hệ thống này như hiệu suất lên men thấp do thời gian quay vòng cao và độ dài của pha lag kéo dài đã dẫn đến yêu cầu phải có những cải tiến. Để tăng năng suất lên men song vẫn giữ tính đơn giản của quá trình lên men giaùn ñoaïn , trong nhiều trường hợp người ta đã sử dụng sự quay vòng tế bào. Kỹ thuật này không làm tăng chỉ số chuyển hóa của đường thành etanol, song thời gian yêu cầu từ lúc bắt đầu lên men đến khi kết thúc quá trình đã giảm tới 60- 70% so với các phương pháp lên men giaùn ñoaïn truyền thống. Theo 1 số tác giả việc cấy vào dịch thủy phân bã mía 1 dịch tế bào nấm men dậm đạc (23,6g/l) đã rút ngắn thời gian lên men hòan tòan 1 dung dịch glucoza có nồng độ ban đầu là 22% xuống còn 6 giờ. Độ sống sót của tế bào trong trường hợp lên men nhanh như vậy bị giảm nhanh vì nồng độ etanol cực kỳ cao trong tế bào. Hạ nhiệt độ lên men và tăng nồng độ oxi có thể hạn chế mức độ kìm hãm song lại hao hụt về năng suất lên men 2.Phương thức lên men liên tục Lên men liên tục loại bỏ được sự hao tốn thời gian trong lên men tĩnh. Đó là thời gian dành cho việc tẩy rửa và làm sạch thiết bị, tái nạp môi trường, thời gian tiêu tốn cho pha lag. Ngoài ra, vì vi sinh vật luôn được giữ trong pha sinh trưởng lũy thừa nên năng suất tính theo thời gian tổng số yêu cầu sẽ tăng lên. Hai nhược điểm chủ yếu trong các hệ thống liên tục là: Nhiễm tạp do đột biến xảy ra trong lòng dịch lên men hoặc do cơ thể lạ xâm nhập từ bên ngoài vào. Khó khăn trong việc giữ 1 tốc độ lên men cao. Sở dĩ tốc độ lên men trong các hệ thống này thường thấp là vì tế bào bị chết nhiều do thiếu oxi. Để khắc phục người ta thêm 1 số chất như tween 80, ecgosterol, hay axit linolenic vào môi trường lên men hoặc cho nấm men hoặc cho nấm men sinh trưởng trong đñieàu kiện hiếu khí trước khi giai đọan lên men kỵ khí. Hiệu suất etanol trong 1 nồi lên men liên tục đơn giản thường bị giới hạn do sự kìm hãm bởi etanol và bởi 1 nồng độ tế bào thấp. Khi nồng độ đường trong dung dịch nạp tăng, hiệu suất etanol sẽ giảm do hiệu quả kìm hãm bởi sản phẩm. Ở nồng độ hidrat C thấp, sự kìm hãm dường như giảm đi song nồng độ sinh khối tế bào cũng giảm. Do vậy năng suất lên men tối ưu sẽ đạt được ở nồng độ glucoza nạp khoảng 10% IV- HIEÄU SUAÁT QUAÙ TRÌNH LEÂN MEN TÖØ NAÁM MEN: Nấm men, dưới điều kiện kỵ khí chuyền hóa glucoza thành etanol trước hết bằng con đường Embden- Meyerhof. Phản ứng thật sự bao gồm sự tạo thành 2 mol etanol, 2 mol CO2 và 2 mol ATP trên mỗi mol glucoza được lên men. Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucoza về lý thuyết có thể tạo ra 0,51 g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong thực tế thường không vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là do 1 phần chất dinh dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra ( thường dẫn tới glyxerol va sucxinat) tiêu thụ tới 4-5 % cơ chất tổng số. Nếu loại trừ được các phản ứng này thì sản lượng etanol có thể tăng thêm được 2,7 %. B-VI KHUAÅN I-GIỚI THIỆU CHUNG Trong số những vi sinh vật có khả năng sản xuất ra ethanol, ngoài nấm men Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis là sinh vật có triển vọng nhất. Nó chuyển hoá phần lớn glucose thành CO2 và ethanol, phát triển nhanh hơn nấm men và thể hiện khả năng sản sinh ethanol rất cao trong suốt quá trình lên men. So với nấm men thì vi sinh vật này tạo ra được tỉ lệ ethanol cao hơn hẳn và điều này có ý nghĩa rất quan trọng. Zymomonas mobilis là một vi sinh vật kị khí và khác với nấm men,nó không cần đến sự bổ sung oxy để tồn tại và phát triển. Quá trình sả n xuất ethanol của Zymomonas mobilis ít tạo ra sản phẩm phụ hơn, đặc biệt là rượu tạp. Thao tác gen trên Zymomonas mobilis cũng đơn giản hơn hẳn nấm men. Điều này đã mang đến cơ hội mở rộng dãy nguyên liệu trong sản xuất ethanol: từ lignocellulose hay từ sự tiêu hoá trực tiếp tinh bột. Kỹ thuật lên men ethanol sử dụng Zymomonas mobilis sẽ được đặc biệt chú ý trong tương lai vì khả năng sản xuất của vi khuẩn này cao hơn hẳn so với nấm men. II-CÁC VI KHUẨN LÊN MEN CỒN Rất nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh ethanol. Tuy nhiên đa số tạo thành những sản phẩm phụ ngoài ethanol. Các sản phẩm phụ này bao gồm các loại rượu khác (butanol, isopropylalcol, 2,3-butandiol), các acid hữu cơ (acetic, butyric, formic, lactic), các poliol (arabitol, glicerol, xilitol), các keton (aceton) và các chất khí khác nhau (metan, cacbonic, hydro). Các vi sinh vật này tạo thành ethanol như một sản phẩm chủ yếu (ít nhất một mol ethanol trên một mol glucose được sử dụng). Tên vi khuẩn m mol Ethanol sản xuất được trên M mol Glucose được chuyển hoá Clostridium sporogenes up to 4.15 a) Clostridium indolis (pathogenic) 1.96 a) Clostridium sphenoides 1.8 a) (1.8) b) Clostridium sordelli (pathogenic) 1.7 Zymomonas mobilis 1.9 (syn. Anaerobica) (anaerobe) Zymomonas mobilis Ssp. Pomaceas 1.7 Spirochaeta aurantia 1.5 (0.8) Spirochaeta stenostrepta 0.84 (1.46) Spirochaeta litoralis 1.1 (1.4) Erwinia amylovora 1.2 Leuconostoc mesenteroides 1.1 Streptococcus lactis 1.0 Sarcina ventriculi Một số vi khuẩn ( ví dụ: Enterobacteriaceas, Spirochaeta, Bacteroides ) chuyển hoá glucose theo con đường EM (Embden-Meyerhof ), trong một thời gian ngắn, nó sử dụng 1 mol gluose sinh ra 2 mol pyruvat sau đó bị mất cacbon thành acetaldehyde và khử thành rượu. Bên cạnh đó, con đường ED (Entner-Doudoroff) là con đường len men rượu từ glucose nhờ một số vi khuẩn khác. Nghiên cứu của Naim Kosaric chỉ ra rằng lượng đường hấp thu và lượng ethanol sinh ra là cao nhất khi dùng môi trường glucose. 1..ZYMOMONAS MOBILIS Zymomonas mobilis là vi khuẩn thuộc giống Zymomonas nó có khả năng sản xuất ethanol vượt trội hơn cả nấm men về một số mặt. Nó được phân lập lần đầu tiên từ đồ uống có chứa cồn, như rượu cọ (palm wine) của châu Phi hay một loại rượu của Mehico : rượu thùa (pulque), ngoài ra còn từ chất lấy từ rượu táo hay bia của người châu Âu. a.Đặc điểm: Zymomonas là vi khuẩn Gram (-),kỵ khí, hình que. Dài từ 2 -6 mm và rộng từ 1- 1.5mm, xuất hiện từng cái một nhưng hầu hết ở dạng cặp. Kích thước chiều rộng lớn của Zymomonas được thể hiện rõ qua kính hiển vi, hầu hết những vi khuẩn khác chiều rộng chỉ khoảng 0.5-0.75mm. Hầu hết các giống (70%) không di động được, phần ít (30%) di động được với 1-4 tiên mao phân cực.Khả năng di động bị mất ở 1 số giống. Hình dạng: 45% giống hình hoa thị, 33% dạng chuỗi, và 62% tế bào có những sợi nhỏ, có 1 số giống có chiều dài tới 28mm. Tế bào không có dạng bào tử, không có màng nhày vỏ bọc bên ngoài, không có lipid nội bào,không có glycogen. Thành phần của tế bào Thành phần Tỷ lệ (khối lượng khô) Protein Giai đoạn phát triển Giai đoạn tĩnh RNA DNA Carbohydrates Poly-b-hydroxybutyrate Polyphosphate Sulfur Ammonia Amino acids ATP Pha log Pha tử vong 65-69% 54% 17-22% 2.7% 4-5% 0% 0% 0.5% 0.1-0.5mmol/mg 0.02-0.2mmol/mg 1-5mg/mg 0-0.4mg/mgm b.Điều kiện phát triển: Sự phát triển ở các nhịêt độ khác nhau: Ở 30oC một số giống không phát triển, ở 40oC rất hiếm quan sát thấy sự phát triển.Vi khuẩn Z.mobilis có thể phát triển ở 36oC.Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự lên men của vi khuẩn. Ở nhiệt độ 14-18oC sự lên men xảy ra sau 4 ngày, tại nhiệt độ 16-26oC sự lên men xảy ra chỉ sau 2 ngày nhưng một số trường hợp khác nhiệt độ thuận lợi nhất cho quá trình lên men là 25-31oC. Ở nhiệt độ quá cao vi khuẩn sẽ bị tiêu diệt như ở 550C vi khuẩn bị chết sau 5 phút. Bảng: Sự phát triển của các giống Zymomonas ở điều kiện nhiệt độ khác nhau Nhiệt độ % giống phát triển 30 34 36 38 40 100 97 97 74 5 Sự phát triển ở các giá trị pH khác nhau pH % giống phát triển 3.05 3.5 3.7 3.85 5-7 7.5 8.0 0 43 71 90 100 87 0 Phát triển trong sự có mặt của ethanol: nó có thể xảy ra, Zymomonas chịu được rượu, nó được cô lập từ đồ uống có chứa 2 – 10% cồn, sự tập trung 5,5% ethanol trong chất lỏng khá vô hại với Zymomonas. tại 7.7 và 10% ethanol 73 và 47% các chủng Zymomonas vẫn phát triển. Phát triển trong sự tập trung cao glucose: Klyuver và Hoppenbrouwers qua sát rằng loài lên men rượu thùa(mehicô) có thể sống trong môi trường lên men với 25% glucose Kiểm tra vài môi trường lỏng có chứa 2% dịch chiết nấm men và sự tập trung khác nhau của glucose. với 20% glucose vi khuẩn có thể phát triển trong 34h, với 30% glucose 88% vi khuẩn có thể sống 2 – 5 ngày( chủng Z1 đến Z8 chỉ phát triển trong 1 ngày), với 40% glucose 54% loài này có thể phát triển ở sau pha lag 4 đến 29 ngày. Phát triển trong sự có mặt của KCN: sử dụng dung dịch chuẩn chứa 0,0075% KCN , chủng ATCC 29192, NCIB 8777, NCIB 10565, CP3, CP4, và Ag 11 không phát triển. chủng Zymomonas ATCC10988, 410, NCIN 8227 và 409 phát triển sau 5 ngày, 12 chủng khác bị ức chế bởi sự tập trung KCN và phát triển sau 1 – 2 ngày Phát triển trong môi trường chứa NaCl: trong dung dịch chuẩn chứa 0.5% NaCl chỉ Zymomonas mobilis là không phát triển, còn trong môi trường có 2% NaCl thì không có chủng Zymomonas nào phát triển được cả. c. Nuôi cấy Môi trường nuôi cấy có chứa glucose(50g/l),dịch chiết nấm men Difco(5g/l) và muối khoáng. Trong suốt quá trình phát triển, pH của môi trường thay đổi từ 5,6-5,7 lúc bắt đầu đến khoảng 4,5-4,8 lúc kết thúc sự nuôi cấy. Để nghiên cứu về hô hấp và tổng hợp ATP trong điểu kiện không lớn lên của vi khuẩn, tế bào phát triển kị khí theo hàm mũ đã được thu hoạch bởi máy li tâm, rửa và ngâm trong đệm kali phosphat 50mM (pH 6-9), bổ sung thêm 5mM magie sunfat, một lượng sinh khối từ 3-5 mg(khối lượng khô)/ml Tiếp tục nuôi cấy :Làm việc với 800ml, ở 30oC, bơm 1l/phút dung dịch, tốc dộ quay là 410 vòng/phút. Môi trường phát triển giống như cho quá trình nuôi cấy, trừ sự tập trung glucose 25g/l, pH được giữ ổn định ở 6.0, thêm vào 10% KOH hoà tan, kali cyanide hoà tan thêm vào riêng ( cyanide không bền trong môi trường acid yếu. d. Con đường lên men: Zymomonas mobilis chuyển hoá đường thành pyruvat qua con đường ED (Entner-Doudorolff). Pyruvat sau đó lên men tạo ra ethanol và CO2 là sản phẩm duy nhất ( tương tự nấm men ) Sự thuận lợi của Z. mobilis so với S. cerevisiae về mặt sản xuất bioethanol là: Đường hấp thu và sản lượng ethanol là cao hơn Khí tạo thành ít hơn Khả năng chịu ethanol cao hơn Không phụ thuộc vào sự điều chỉnh lượng oxi thêm vào trong suốt quá trình lên men. Tuân theo sự vận động gen. Mặc dù có những giới hạn khắt khe hơn so với nấm men: nó tận dụng được loại chất nền giới hạn glucose, fructose và sucrose. Sử dụng phương pháp trong công nghệ sinh học, các nhà khoa học hiện nay đang tìm cách khắc phục điều này. Cái khác của Z. mobilis là chắn chắn chúng có khả năng sử dụng pentose như là nguồn cacbon để phát triển. Con đường ED: Glucose bị phosphoryl hóa sau đó bị oxy hóa tới 6-P-gluconat. Tại điểm này, sự loại nước xảy ra tạo thành 2-keto-3-deoxy-6-P-gluconat (KDPG), chất này sau đó bị thuỷ phân nhờ KDPG-aldolase. Từ một mol glucose sẽ tạo thành 2 mol pyruvat và sinh ra một mol ATP. Các nghiên cứu nuôi chủng Zymomonas mobilis ZM4 trên các môi trường nhân tạo chứa glucose, fructose hoặc saccharose đã cho thấy rằng loài vi khuẩn này không có khả năng chuyển hoá các loại đường này theo bất kì một con đường nào khác ngoài con đường ED. Dẫn liệu động học sinh trưởng của loài vi khuẩn này được trình bày theo bảng sau: Bảng-Các thông số động học đối với sinh trưởng của chủng Zymomonas mobilis ZM4 trong môi trường nuôi cấy tĩnh với các nguồn carbon khác nhau (nồng độ ban đầu 250g/l-theo N. Kosaric và ctv., 1983) Thông số Cơ chất Glucose Fructose Saccharose Tốc độ sinh trưởng(h-1) 0,18 0,10 0,14 Tốc độ tiêu thụ cơ chất(g/g/h) 11,3 10,4 10,0 Tốc độ tạo thành etanol(g/g/h) 5,4 5,1 4,6 Tốc độ tạo thành etanol(g/g/h) 0,015 0,009 0,014 Sản lượng etanol(g/g) 0,48 0,48 0,46 Sản lượng etanol(% so với lí thuyết) 94,1 94,1 90,2 Nồng độ etanol cực đại(g/l) 117 119 89 Thời gian có tốc độ cực đại(h) 0-19 0-28 0-15 Theo bảng này tốc độ hấp thu đường và sự sản sinh ethanol đạt cực đại khi sử dụng môi trường chứa glucose. Sự kiềm hãm do cơ chất không biểu hiện nghiêm trọng ở loài vi khuẩn này vì sinh trưởng có thể ở nồng độ 40% glucose. Khi lên men nước mía, chủng Zymomonas mobilis Z7 có khả năng kết thúc sự lên men 100-200g/l saccharose với hiệu quả 59–88% trong vòng 20–29h. Tốc độ sản sinh etanol dao động từ 2,2–5,3 g/l/h trong các thí nghiệm loại một lít. Các kết quả này phù hợp với động học lên men trên các môi trường bán tổng hợp dưới các điều kiện tương tự. Điều này chỉ ra rằng các cofacto cần thiết, các ion kim loại cũng như các nồng độ C, N, P là đầy đủ cho quá trình lên men ethanol do vi khuẩn này thực hiện. Bảng _Các thông số động học đối với Z.mobils và Saccharomyces cerevisae trên các môi trường chứa 250g glucose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không thông khí (30oC, pH5,0 – theo N.Kosaric và ctv_1983) Các thông số động học Z. mobilis S. uvarum Tốc độ sinh trưởng riêng(l/h) 0,13 0,055 Tốc độ hấp thu glucose riêng(g/g/h) 5,5 2,1 Tốc độ tạo thành etanol riêng(g/g/h) 2,5 2,1 Sản lượng tế bào(g/g) 0,019 0,033 Sản lượng etanol (g/g) 0,47 0,44 Sản lượng etanol tương đối(%) 92,5 86 Nồng độ etanol cực đại(g/l) 102 108 Bảng trên cho thấy trong điều kiện nuôi tĩnh (giaùn ñoaïn), Zymomonas mobilis lên men hiệu quả hơn Saccharomyces uvarum. Các thông số động học thể hịên tính ưu thế này là tốc độ simh trưởng (2,4 lần cao hơn nấm men), tốc độ sinh ethanol riêng phần (2,9 lần cao hơn) và tốc độ hấp thu glucose riêng phần (2,6 lần cao hơn) Trong lên men nấm men, oxy cần thiết để tổng hợp thành tế bào, ổn định các cấu trúc lipid, và duy trì các quá trình trong tế bào nói chung. Tuy nhiên, điều kiện hiếu khí cũng dẫn đến việc giảm thu hoạch cồn và tăng nồng độ sinh khối do hiệu ứng Pasteur. Vì nhiều vi khuẩn là kỵ khí nên có thể đạt được những năng suất cồn cao hơn và sinh khối thấp hơn. Nồng độ tế bào vi khuẩn thấp hơn cũng là một hậu quả của việc năng lượng giành cho sinh trưởng đạt được thấp hơn (1ATP trên 1 glucose tiêu thụ theo con đường ED so với 2ATP theo con đường EM ở nấm men) Sơ đồ con đường ED e. Nguyên liệu và môi trường lên men Zymomonas mobilis được nuôi cấy trong môi trường glucose (glucose 80g/dm3,ph ần chi ết men 10 g/dm3, KH2PO4 1g/dm3, (NH4)2SO4 1g/dm3, và MgSO4.7H2O 0.5 g/dm3. Môi trường glucose ( glucose 80 đến 250 g/dm3, phần chiết men 10 g/dm3, KH2PO4 1g/dm3, (NH4)2SO4 1 g/dm3, v à MgSO4.7H2O 0.5 g/dm3 được sử dụng trong thí nghiệm. Quá trình lên men được thực hiện trong bình Erlenmeyer chứa 0.2 dm3 môi trường và 0.2 chất để chủng ( 80 g/dm3 môi trường glucose sau 24 giờ lên men ở 300C). f. Hiệu suất quá trình: Chay et al cho rằng giống sản xuất ethanol tốt nhất từ đường hóa những chất lỏng nhiều đường là những giống của vi khuẩn Z. mobilis và S. diastaticus. Toran-Diaz et al nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền thủy phân bằng acid và chất nền thủy phân bằng enzyme trong sản xuất ethanol bằng giống ZM4 và ZM4F của vi khuẩn Z. mobilis. Chúng đạt được khả năng sản xuất ethanol : 4,8 g/g/h với Z. mobilis phát triển trong dịch hoa hướng dương, cao hơn nấm men Kluyveromyces. Hơn nữa, họ quan sát rằng dịch của hoa hướng dương có thể lên men mà không cấn bất kì điều kiện dinh dưỡng nào. Gần đây, Lawford et al chứng tỏ rằng chất lỏng ngâm bắp, một sản phẩm của bắp, như là một chất nền có ảnh hưởng đáng kể cho việc sản xuất ethanol bằng vi khuẩn Z. mobilis CP4. Torres và Baratti nghiên cứu sự lên men bằng thủy phân bột lúa mì bằng Z. mobilis. Họ cho rằng trong sự lên men cùng một loạt , nộng độ đường cao 223 g/l có thể lên men đến 105 g/l trong 70 giờ. Phần trăm lượng lý thuyết là 92%. Mẫu lên men của Z. mobilis ATCC10988, ATCC 12526 và NRRL B4286 trong môi trường tổng hợp, dịch mía và mật đường cho ta giống NRRL B4286 sản xuất lượng ethanol lớn nhất trong môi trường tổng hợp, trong khi giống ATCC 12526 và ATCC 10988 tốt hơn trong dịch mía. Tuy nhiên, tất cả giống lên men mật đường thì rất kém. Chúng ta cũng có những báo cáo về sự lên men ethanol của thủy phân tinh bột sắn( CSH) bởi Z. mobilis. Nellaiah et al cho rằng giống NRRL B-4286 của vi khuẩn Z. mobilis tốt hơn là giống đã được sử dụng có hiệu quả ZM4, trong quá trình lên men glucose, fructose, và sucrose. NRRL B4286 cải tiến để trở nên giống tốt nhất cho sự lên men của tinh bột sắn thủy phân. Kết quả cho ta thấy rằng sự lắp các tế báo vào các loại đường có nồng độ cao trong CSH có thể sản xuất một lượng lớn ethanol trong một thời gian ngắn. Với sự nuôi cấy thích nghi nồng độ đường cao trong CSH, sự lên men được hoàn thành trong 28 giờ với tối đa 80,1 g/l ethanol. Ngược lại, một lượng tối đa cồn 78,5 g/l sau 40 giờ thu được ở sự lên men trong môi trường nuôi cấy không thích nghi. Chất bổ sung của CSH với những hoạt động khác nhau không có kết quả trong việc tập trung ethanol. Khi Z. mobilis và S. cerevisiae kết hợp khả năng của chúng để sản xuất ethanol từ glucose và tinh bột thuỷ phân, sinh ra cao hơn so với Z. mobilis.Chưng cất Z. mobolis cho thấy sản phẩm phụ không phải ethanol thấp hơn 5 lần so với S. cerevisiae khi lượng ethanol được sản xuất bởi lúa mạch đen. Một trong số những quy trình lên men rượu khác nhau, việc tiếp tục quá trình sử dụng AMG và cell là thuận lợi nhất, với hoạt động ổn định trong 40 ngày. Sản xuất ethanol từ cây hoa hướng dương sử dụng ZM4F của Z. mobilis được nghiên cứu bởi Allais et al. Kết quả của họ chỉ ra rằng thể tích xản suất được là 67.2g/l/h với lượng ethanol cuối cùng khi cô đặc là 42g/l từ 100g/l đường ban đầu. Doelle mô tả quy trình liên tục sản xuất ethanol từ tinh bột thuỷ phân. Quá trình này sử dụng Z.mobilis trong pha lên men cồn đơn giản. Ông ta nhận xác nhận rằng chất lượng tinh bột thuỷ phân không quuyết định đến sự thành công của quá trình lên men, và cho rằng năng suất của sự chuyển hoá là 92%. Một quá trình sản xuất ethanol c ông nghiệp từ tinh bột lúa mỳ thuỷ phân sử dụng Z. mobilis được mô tả bởi Sahm và Bringer-Meyer. Những khám phá đó cho thấy rằng chủng Z. mobilis sản xuất 60 g ethanol /l trong khoảng thời gian 39 ngày sử dụng. Biofiml reactor( một kỹ thuật của việc giử cố định những tế bào vi khuẩn thông thường là nhúng trong những polyme ngoải tế bào để chúng dính chặt vào bề mặt S và cùng nhau thành lập một cộng đồng vi khuẩn kháng cự cao đối với cả những tế bào thực khuẩn lẫn chất kháng sinh) cùng với polypropylene hoặc plastic susport được sử dụng để sản xuất ethanol, kết quả cho thấy rằng tỷ lệ ethanol được sản xuất ra và được cô cạn trong biofilm reactor cao hơn trong nuôi cấy trong dung dịch lỏng. Việc liên tục lên men sử dụng một hỗn hợp nuôi cấy gồm Z. mobilis và S. cerevisiae, sản xuất 54.3g/l ethanol 1.CLOSTRIDIUM a-Đặc điểm Clostridium được phát hiện từ năm 1893, là một loại vi khuẩn kỵ khí, tự dưỡng, sống tự do trong đất.Vi khuẩn G+, có hình que, khi còn non có khả năng di động nhờ tiên mao, khi già mất khả năng di động. Quá trình phát triển qua 5 giai đoạn: Giai đoạn 1: Các tế bào tạo thành những hình sợi kéo dài Giai đoạn 2: Giai đoạn tách các hình sợi này ra Giai đoạn 3: Giai đoạn có 1 tế bào hoạt động rất mạnh Giai đoạn 4: Giai đoạn tạo thành nha bào. Đây là giai đoạn phát dục không ổn định nên hình thành bào tử có tính đề kháng cao.Bào tử hình thành ở bên trong nên được gọi là nội bào tử. Bào tử có hình cầu, hình bầu dục hay hình oval, kích thước từ 0.2-2 m.Bào tử nằm ở 1 đầu hoặc ở giữa của tế bào. Do kích thước bào tử lớn nên làm biến dạng tế bào vi khuẩn.Bào tử trong suốt, được cấu tạo bới 1 màng bao bọc, 1 khối bào tương đặc.Tế bào vi khuẩn bọc ngoài bào tử trong vài giờ hoặc vài ngày, tuỳ điều kiện cụ thể mà chúng bị tan ra.Bào tử có sức đề kháng cao, có thể chịu được điều kiện môi trường bất lợi như chất dinh dưỡng cạn kiệt, chất độc hại nhiều, nhiệt độ cao hay có sự thay đổi điều kiện sinh trưởng… Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử phát triển thành vi khuẩn (bào tử nảy mầm).Bào tử dài ra, vi khuẩn non thoát ra ở 1 đầu hoặc giữa thân . Giai đo ạn 5: Giai đoạn sinh sản Clostridium có khả năng đồng hoá nhiều nguồn Cacbon khác nhau như đường, tinh bột…Nó thuộc vi sinh vật kị khí nên các sản phẩm trao đổi chất của nó thường là các loại axit hữu cơ, butanol, axeton. Đó là các sản phẩm chưa được oxy hoá hoàn toàn. b.Điều kiện phát triển: P và K là 2 nguyên tố rất cần thiết cho sự phát triển và cố định Nitơ của Clostridium. Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng khác như Mo, Co, Cu, Mn cũng rất cần thiết đối với Clostridium Clostridium có khả năng phát triển ở pH = 4.7 – 8.5. Bào tử của chúng có thể chịu đựng được nhiệt độ cao, có thể sống được 1 giờ ở 800C. Một số loài còn có thể chịu được nhiệt độ 1000C trong 30’ Trong các loài Clostridium, 1 loài được dùng trong sản xuất rượu là Clostridium ljungdahlii. Vi khuẩn này có tỉ lệ G + C khoảng 22-23%. Chúng phát triển trong khí tổng hợp để sản xuất acetate và ethanol từ chất nền ở thể khí. Chúng phát triển nhờ sự tổng hợp của CO và chất khí ở áp suất tuyệt đối khoảng 0.8 – 1.8 atm. Tỉ lệ tế bào và sản phẩm tạo thành là 0.015g tế bào/g CO và 0.41g acetate/g CO. Sự cô đặc ethanol được tăng cao bởi sự có mặt của H2 và CO2 ban đầu trong pha lỏng. Không có sự ức chế chất nền trong khi vi khuẩn này được nuôi dưỡng trong mẻ lên men, ngay cả ở áp suất cao 1.6 – 1.8 atm. Sự trao đổi chất cuûa vi khuaån PHAÀN 5: HIEÄU SUAÁT VAØ TOÅN THAÁT TRONG SAÛN XUAÁT Ñeå ñaùnh giaù hieäu quaû laøm vieäc cuûa toaøn boä caùc coâng ñoaïn trong quaù trình saûn xuaát, ngöôøi a duøng khaùi nieäm hieäu suaát toång thu hoài. Ñoù laø toaøn boä löôïng coàn nhaän ñöôïc trong saûn xuaát töø löôïng nguyeân lieäu xaùc ñònh (thöôøng tính theo 100kg ñöôøng hoaëc tinh boät ) chia cho löôïng coàn nhaän ñöôïc theo phöông trình lyù thuyeát vaø bieåu thò theo %. Tyû soá naøy coøn goïi laø hieäu suaát thöïc teá vaø kyù hieäu laø ηt . Hieäu suaát naøy goàm hieäu suaát naáu ñöôøng hoùa vaø leân men ( keå caû nghieàn nguyeân lieäu), kyù hieäu laø ηm vaø hieäu suaát chöng caát ηc ηt = ηc . ηm Löôïng coàn nhaän ñöôïc theo lyù thuyeát tính theo phöông trình Gaylussac: C6H12O6 2C2H5OH + 2 CO2 180,1 92,1 88 Töø phöông trình naøy suy ra, cöù 100 kg ñöôøng ñôn giaûn ( glucose, fructose, …) khi leân men seõ cho ta 51,14 kg coàn etylic vaø 48,66 kg CO2 . Ñem chia cho khoái löôïng rieâng cuûa coàn ôû 20o C, d204 = 0,78927, ta coù : 51,14/ 0,78927 = 64,794 l 100% Neáu tính cho 100kg ñöôøng ñoâi ( maltose, saccharose) thì caàn nhaân vôùi heä soá 1,0526, vôùi tinh boät thì nhaân 1,11104. keát quaû coù theå xem trong baûng sau Nguoàn glucid Löôïng coàn thu ñöôïc töø 100kg Theo lít Theo kg Tinh boät Ñöôøng ñoâi Ñöôøng ñôn 71,998 68,20 64,794 56,818 53,83 51,14 Thöïc teá löôïng coàn thu ñöôïc luoân ít hôn so vôùi lyù thuyeát. Tuøy theo nguyeân lieäu cuõng nhö sô ñoà coâng ngheä, hieäu suaát thöïc teá coù theå raát khaùc nhau, töø 75- 93%. Vôùi söï phaùt trieån cuûa khoa hoïc vaø coâng ngheä, hieäu thöïc teá ngaøy caøng tieäm caän vôùi lyù thuyeát nhöng khoâng bao giôø ñaït tôùi 100% Ñeå naâng cao traùch nhieäm cuûa ngöôøi vaän haønh vaø deã kieåm tra saûn xuaát, ngöôøi ta chia ra hieäu suaát leân men vaø hieäu suaát chöng caát caên cöù vaøo soá lieäu nguyeân lieäu vaø haøm löôïng ñöôøng hoaëc tinh boät ñöa vaøo saûn xuaát cuõng nhö löôïng giaám chín vaø noàng ñoä coàn sau khi leân men, ngöôøi ta tính hieäu suaát thu ñöôïc sau leân men roài giao cho phaân xöôûng chöng luyeän. Ví duï: Sau 1 ca ñöa vaøo saûn xuaát 10 taán nguyeân lieäu coù haøm löôïng tinh boät trung bình 65%. Löôïng giaám thu ñöôïc töông öùng 48 m3 vôùi noàng ñoä coàn 8,8% V. Hieäu suaát sau leân men laø : (48 000 x 8,8 = 4224) %= 90,27 % 10000kg x 0,65 x71,99l Töø 4224 lít coàn chöùa trong 48000 lít giaám, sau khi caát chæ thu ñöôïc 126 lít coàn ñaàu vôùi noàng ñoä 90% vaø 4050 lít coàn tinh cheá vôùi noàng ñoä 96%. Hieäu suaát chöng caát seõ laø ηc = 126 x 0,9 + 4050 x 0,96 % = 94,73% 4224 Hieäu suaát toång thu hoài thöïc teá seõ laø: ηt = ηc . ηm = 90,27 % x 94,73 % = 85,24 % Trong saûn xuaát nhieàu nôi khoâng tính hieäu suaát thöïc teá so vôùi lyù thuyeát maø tính tieâu hao nguyeân lieäu cho 1 lít coàn. Caùch tính naøy ñôn giaûn nhöng keùm chính xaùc. Vì chaát löôïng nguyeân lieäu nhieàu khi khoâng ñoàng nhaát theo thôøi gian vaø giöõa caùc nhaø maùy. Khi tính tieâu hao kg nguyeân lieäu cho 1 lít coàn caàn keøm theo: % tinh boät trong nguyeân lieäu ( neáu ñöôøng cuõng neân quy theo tinh boät hoaëc ngöôïc laïi). Noàng ñoä coàn cuõng caàn thoáng nhaát 100%. Ví duï cô sôû saûn xuaát A tieâu toán 4 kg maät ræ ñöôøng coù haøm löôïng ñöôøng tính theo glucose laø 50%;côû sôû saûn xuaát B tieâu toán 3,8kg maät ræ vôùi haøm löôïng ñöôøng 54%.Löôïng ñöôøng tieâu toán cho 1l coàn 100% V ôû côû sôû A laø 4kg x 0,5=2kg.Hieäu suaát toång thu hoài thöïc teá: 1 % = 77,16 % 2 x 0,6478 Tieâu toán ñöôøng cho 1l coàn ôû cô sôû B: 3,8 x 0,54 = 2,052 Hieäu suaát toång thu hoài: 1 % = 75,21 % 2,052 x 0,6457 Nhö vaäy môùi nhìn ta töôûng cô sôû saûn xuaát B laøm aên coù hieäu quaû nhöng thöïc chaát hieäu suaát toång thu hoài laïi keùm so vôùi cô sôû saûn xuaát A Hieâu suaát toång thu hoài coàn töø saén ôû nôi laøm aên coù hieäu quaû nhaát ôû nöôùc ta vaøo khoaûng 82 ñeán 85 %. Tieâu hao saén coù haøm löôïng tinh boät 62 ñeán 65 %, vaøo khoang 2,6 ñeán 2,8kg/l qui 100%. Trong quaù trong quaù trình saûn xuaát coù caùc daïng toån thaát sau: Toån thaát do nghieàn, vaän chuyeån noäi boä 0,2 ñeán 0,3%; Toån thaát do naáu, ñöôøng hoùa vaø leân men 6 ñeán 12% ( tinh boät soùt, ñöôøng soùt, taïo men) Toån thaát khoâng xaùc ñònh, ñoå ra ngoaøi, ñoïng laïi ôû thieát bò, ñöôøng oáng vaø bay theo CO2 töø 1 ñeán 2% Toån thaát do chöng caát, do bay hôi, coàn coøn soùt laïi trong baõ röôïu, nöôùc thaûi coù theå xaùc ñònh theo coâng thöùc sau: 100x n x A.m xV B = % M B- laø toån thaát coàn theo baõ röôïu vaø nöôùc thaûi, % A- haøm löôïng coàn trong baõ vaø nöôùc thaûi, kg/m3,thöôøng 0,015 ñeán 0,03% n- heä soá chuyeån % khoái löôïng röôïu thaønh tinh boät ( n= 1,8529) V- theå tích giaám ñem caát trong ca hoaëc trong ngaøy m3 m- heä soá pha loaõng cho hôi nöôùc ngöng tuï, thöôøng laø 1; 1,15;1,2. M- löôïng tinh boät öùng vôùi V m3 giaám caát, kg. Löôïng coàn toån thaát do chöng luyeän ôû caùc nöùôc tieân tieán chæ vaøo khoaûng 1 ñeán 2%, ôû ta toån thaát naøy coøn quaù lôùn, töø 5 ñeán 10% vaø coù nôi coøn cao hôn nöõa. ÔÛ treân ñaõ keå toån thaát chung cho leân men coù theå töø 6ñeán 12%. Rieâng toån thaát do nhieãm khuaån laøm taêng ñoä chua so vôùi bình thöôøng coù theå xaùc ñònh theo coâng thöùc sau: 4,5 x N x V x 100 D = % M 4,5- löôïng ñöôøng maát do taêng 10 chua (10 chua töông ñöông vôùi 2,45g H2SO4/l, kg/m3). N- soá ñoä chua taêng quaù möùc quy ñònh. Ví duï: Ñoä chua tröôùc leân men laø 0,3o, theo quy ñònh sau leân men ñoä chua chæ ñöôïc taêng 0,2, töùc tôùi 0,5o ( töông ñöông 1,23g/l); nhöng do dòch leân men bò nhieãm khuaån neân sau leân men ñoä chua taêng tôùi 0,8. Do ñoù löôïng ñöôøng maát do bò nhieãm baèng: D = 4,5( 0,8- 0,5) x 48 000 x 100 =1% 6500 (theo ví duï treân) Toång coäng löôïng tinh boät hoaëc ñöôøng toån thaát trong daây chuyeàn saûn xuaát ôû caùc nöôùc tieân tieán vaøo khoaûng 10%; ôû nöôùc ta hieän nay vaøo khoaûng 15-40 %. Giaûm toån thaát voâ hình vaø höõu hình nhaèm naâng cao daàn hieäu suaát toång thu hoài laø vieäc laøm coù yù nghóa kinh teá kyõ thuaät quan troïng. Ñaây laø vieäc phaûi laøm thöôøng xuyeân lieân tuïc ñoái vôùi moïi cô sôû saûn xuaát. Chæ coù treân cô sôû ñi saâu ñeå naém baét kyõ thuaät coâng ngheä, chuùng ta môùi naâng daàn hieäu suaát thu hoài cuõng nhö chaát löôïng saûn phaåm, ruùt ngaén khoûang caùch veà caùc maët giöõa caùc xí nghieäp cuûa nöôùc ta vôùi caùc nöôùc tieân tieán. Neáu chæ naâng cao hieäu suaát thöïc teá 2% so vôùi hieän taïi ôû 1 cô sôû saûn xuaát naøo ñoù thì öùng vôùi cô sôû coù naêng suaát 5000l coàn / ngaøy, moãi ngaøy cô sôû seõ thu theâm khoaûng 100 lít coàn. Moät naêm seõ thu theâm 30 000 lít maø khoâng toán keùm gì theâm. Vôùi giaù baùn coàn tinh boät hieän nay 15 000 ñ/lít haøng naêm nhaø maùy seõ thu theâmkhoaûng 450 trieäu ñoàng. Vôùi caùc cô sôû saûn xuaát lôùn nhö Röôïu Haø Noäi vaø Bình Taây thì hieäu quaû kinh teá coøn cao hôn nhieàu. Do ñoù ta caàn quan taâm hôn ñeàn hieäu kinh teá do taêng hieäu suaát toång thu hoài. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO 1- Coâng ngheä saûn xuaát & kieåm tra coàn etylic - NXB Khoa hoïc vaø kyõ thuaät-PGS TS Nguyeãn Ñình Thöôûng, TS Nguyeãn Thanh Haèng -Tröôøng ÑH Baùch Khoa Haø Noäi 2- Vi sinh vật học - Nguyễn Laân Dũng (chuû bieân) - NXB Giaùo Dục 3- Coâng nghệ leân men ứng dụng trong coâng nghệ thực phẩm - Buøi AÙi - ĐHQG TPHCM – ĐH Baùch Khoa 4- Coâng nghệ Vi sinh vật, Tập 3: Thực phẩm leân men truyền thống - Nguyễn Đức Lượng - Trường ĐH Kỹ Thuật TP HCM.