Vi hóa sinh kỹ thuật môi trường

cần tìm nguyên nhân và biết rõ bệnh dịch xảy ra do bón ruộng bằng phân người hay phân súc vật, hoặc do nước thải? Muốn vậy ngoài chỉ tiêu Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 75 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG E.coli người ta phải phân tích xác định lượng vi khuẩn ưa nóng, nhưng phân súc vật phân chuồng thì chứa rất nhiều. Như thế thì người ta sẽ xác định được nguyên nhân của sự nhiễm bẩn đất và nước thải do phân bón laọi nào? Muốn vậy ngoài chỉ tiêu E.coli người ta phải phân tích xác định lượng vi khuẩn ưa nóng, nhưng phân súc vật phân chuồng thì chứa rất nhiều. Như thế thì người ta sẽ xác định được nguyên nhân của sự nhiễm bẩn đất và nước thải do phân bón loại nào. Ý nghĩa chỉ tiêu vệ sinh về thực khuẩn thể Như đã biết, thực khuẩn thể (phage) sống kí sinh vào vi khuẩn. Khi vắng mặt vi khuẩn tương ứng của thực khuẩn thể thì thực khuẩn thể vẫn tồn tại được khá lâu trong nước. Chúng chỉ chết khi không nhận được thức ăn mà thôi. VÌ vậy, nếu phát hiện thực khuẩn thể (ứng với loại sinh vật gây bệnh nào) trong nước thì chắc chắn có vi sinh vật đã hay đang tồn tại. Ý nghĩa chỉ tiêu vệ sinh về giun sán Có hai loại giun sán là: giun sán địa chất và giun sán sinh học. Giun sán là loại giun mà trong quá trình phát triển không nhờ vật chủ trung gian. Giun sán sinh học là loại phải sống nhờ hai đến ba vật chủ trung gian. Giun địa chất gồm: Giun đũa, giun kim, giun tóc… Giun sinh học gồm giun búi, sán chỉ, sán xơ mít, giun xoắn… Môi trường bên ngoài (đất, nước) bị nhiễm bẩn bởi giun sán là do nhiễm phân chứa giun sán . Con người bị nhiễm giun sán là do ăn phải trứng giun hoặc bọ ở trong nước, trái cây, thức ăn tươi sống. Trong nước thải sinh hoạt và do đó, nước sông hồ bị nhiễm bẩn bởi nước thải nên cũng chứa nhiều loại giun như giun đũa, giun kim…Giun đũa có màu trắng, dài 15 cm. Trong ruột người, động vật chứa nhiều loại trứng giun, có khoảng 245 ngàn trứng giun do 1 người thải ra trong 1 ngày đêm. Trứng giun này theo phân ra môi trường bên ngoài – lẩn vào trong nước, đất, trái cây, rau tươi… từ đó chúng lại xâm nhập vào cơ thể người, động vật và gây ra không ít bệnh hiểm nghèo. 2.2 Đánh giá nước dùng để ăn uống Đáp ứng yêu cầu về chất lượng nước ăn uống là một vấn đề khó và phức tạp. Nước dùng để ăn phải đáp ứng được yêu cầu sau: • Không nguy hại đối với cơ thể người, hợp khẩu vị • Tiện cho việc nấu thức ăn • Tiện cho việc rữa, giặt giủ quần áo… Ở đây chủ yếu chỉ xét yêu cầu đầu tiên: nước dùng để ăn uống phải được đánh giá theo các mặt: vi trùng học, sinh học, lý, hoá học, giác quan, vệ sinh địa hình… Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 76 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Đánh giá về vi trùng học Như hai mục trên của chương này đã nói, nước dùng để ăn uống không chứa bất kì loại vi khuẩn gây bệnh nào. Nhưng đồng thời có rất nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, không thể xác định được sự có mặt của từng loại trong một mẫu nước, tức là không thể phân tích chỉ tiêu trực tiếp. Vì vậy chỉ tiêu vi trùng học được đánh giá một cách gián tiếp, bằng trực khuẩn đường ruột, và tổng số vi khuẩn (MPN – Most Probable Number) Đánh giá về sinh học Trong nước để ăn uống không chứa giun sán, động thực vật phù du. Những loại động thực vật phù du này không có độc hại nhưng có trong nước cũng làm người dùng nước thấy ghê sợ, và chắc chắn cũng mang theo vi khuẩn. Trong các nguồn nước mặt, nhất là hồ đầm thường có hiện tượng phú dưỡng nở hoa (Eutrofication). Do đó trong nước sẽ chứa các sản phẩm trao đổi hoạc các sản phẩm phân huỷ tế bào rêu làm cho nước có mùi vị khác thường: tanh, hôi, thối… Chẳng những tảo mà cả xạ khuẩn cũng làm cho nước có mùi vị khó chịu Đánh giá về vật lý Nước dùng để ăn uống phải trong sạch, không màu, mùi, vị, pH và nhiệt độ phải nằm trong giới hạn quy định theo quy phạm. Đánh giá về hoá học Trong thành phần nước thiên nhiên chứa nhiều tạp chất hoá học khác nhau kể cả các chất phóng xạ. Các chất khoáng chứa rất nhiều trong nước thiên nhiên. Trong đó có nhiều hợp chất cần cho cơ thể người. Tuy nhiên, những hợp chất đó (anion, cation) được bổ sung chủ yếu từ thức ăn chứ không phải từ nước (trừ iod và fluor). Như vậy sự có mặt của những ion đó làm cho nước có cảm giác hợp khẩu vị là chính. Ngoài ra nếu người ta uống nước cất thì sẽ làm cho giác mạc bị mất muối và sẽ gây hiện tượng trương nguyên sinh của tế bào. Đặc biệt, đối với iod và fluor thì rất cần đối với cơ thể người. Iod cần thiết cho sự hoạt động bình thường của tuyến giáp – họng con người (mổi ngày con người cần 300µg iod). Nếu thiếu tuyến giáp thì cổ họng kém phát triển, bề ngoài gọi là bệnh bướu cổ, khả năng tư duy kém con người trở nên đần độn kém thông minh. Nguồn chính bổ sung iod cho cơ thể người là nước, nhất là nước biển. Từ nước biển iod theo hơi nước bay vào khí quyển rồi theo mưa bay vào đất liền, sông, hồ, đất. Càng ở những vùng cao xa nước biển lượng iod trong khí quyển càng ít. Do đó nước ở vùng cao nguyên chứa ít iod và bệnh bướu cổ phát sinh nhiều (chẳng hạn ở vùng núi Hymalaya, Anpơ..) để chống bệnh bướu cổ người ta phải iodua hoá nước, bổ sung muối ăn vào thức ăn. Fluor cũng là một nguyên tố phổ biến trong thiên nhiên. Nước mặt chứa ít fluor hơn so với nước ngầm. Nếu nồng độ Fluor trong nước quá thấp (dưới 0,5 -0,7mg/l) thì sẽ làm loãng xương răng (bị rụng răng). Nếu nồng độ Flour quá cao (trên1,5mg/l) sẻ làm người ta nhiễm độc Fluor. Do vậy nồng độ Flour tối thích trong nước là 0,7- 1mg/l. Nếu nguồn nước không đủ Fluor thì người ta phải thêm vào. Nhiều nguồn nước ở Anh, Mỹ bị thiếu Fluor. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 77 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG z Những chất phống xạ cũng có trong thiên nhiên và không khí xung quanh ta với lượng rất ít. Tổng lượng chất phóng xạ trong cơ thể người không đáng kể. Sự có mặt các chất phóng xạ trong cơ thể người với một lượng đáng kể trong cơ thể người sẽ dẩn đến hậu quả là cơ thể thường xuyên bị tác động của các tia α, β, γ z Sự phát triển của công nghiệp hiện đại sẽ làm cho nước thải chứa nhiều chất phóng xạ và do đó cả nước thiên nhiên, ngay cả động thực vật, thức ăn con người, cũng chứa nhiều chất phóng xạ. z Nitrate: đó là muối của axit nitric, chứa nhiều trong nước mặt và nước ngầm. Có nitrat trong nước chứng tỏ có các muối hoà tan và chứng tỏ có các quá trình khoáng hoá chất hữu cơ bẩn diển ra. Nitrat quá nhiều trong nước uống (trên 10mg/l) gây nguy hiểm đối với trẻ sơ sinh 2-3 tháng, vì nó gây ra bệnh thiếu máu methemoglobine. z Những chất hữu cơ: trong nước thiên nhiên, theo nguồn nước, những tạp chất hữu cơ có thet chia ra: • Các chất hữu cơ sống • Các chất hữu cơ chết (cặn bã hữu cơ) • Sản phẩm trao đổi của các VSV sống lẫn vào nước • Các chất hữu cơ cùng với nước thải sinh hoạt, công nghiệp xã vào nguồn nước. Theo mức độ phân huỷ người ta chia ra : các chất hữu cơ dễ phân huỷ, khó phân huỷ, và chất độc. Chỉ tiêu COD (nhu cầu oxy hoá học) định lượng tổng cộng tất cả các chất hữu cơ trong nước nhưng không xác định được lượng các chất dễ hoặc khó phân huỷ. Khi đó tốt nhất là xác định chỉ tiêu BOD – là đại lượng phản ánh các chất hữu cơ có thể phân huỷ bởi VSV hiếu khí. Đó chính là những chất hữu cơ dễ phân huỷ. Nước dùng để cấp nước sinh hoạt có BOD =2 - 3mg/l, đôi khi hơn một chút nhưng không được quá 4mg/l. Đánh giá theo giác quan Đối với nước dùng để ăn uống, khi nồng độ các tạp chất rất thấp, đôi khi các phương pháp phân tích hoá học không đủ chính xác thì người ta dùng giác quan để thử nghiệm. Có thể dùng 3 trong 5 giác quan của con người (vị, khứu, thị giác) để đánh giá chất lượng nước uống. Tất nhiên khi nước đục có màu, mùi, vị khác thường, thì con người sẽ cảm thấy được. Đó là phản xạ tự vệ tự nhiên của con người. • Màu: nếu nước trong sạch thì nước không màu. Nếu có màu chứng tỏ nước thiên nhiên có các tạp chấp như humic, tamin, muối sắt… • Mùi: Nước dùng để ăn uống không được có mùi. Nếu có mùi chứng tỏ nước bị nhiễm bẩn và nguyên nhân có thể là: do tạo thành H2S, sản phẩm của sự phân huỷ các chất hữu cơ chứa S hoặc do có FeS, chất này tác dụng vói acid carbonic rồi tạo Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 78 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ra H2S. Có thể do có sản phẩm thối rữa hay do các VSV phù du phát triển trong nước. • Vị: Nước dùng để uống có vị “ngon” đặc biệt . Tất nhiên ở đây có sai lệch do cảm giác chủ quan của từng người, của dân cư từng địa phương. Thường nước có chứa CO2 thì làm cho nước có chứa vị tươi mát. Nếu nước chứa các loại muối khoáng người ta cũng dễ thấy: muối NaCl thấy mặn, các loại muối khác có thể chát, các acid hữu cơ thấy chua. Đánh giá theo trạng thái vệ sinh địa hình Tất cả các biện pháp đánh giá trong phòng thí nghiệm trên chỉ đặc trưng cho một mẫu nước nhỏ để phân tích (1- 2 lít). Trong khi đó như ta đã biết, các loại vi khuẩn, các chất hữu cơ phân bổ không điều ở toàn khối nguồn nước. Thậm chí, dù tất cả các phương pháp phân tích thực nghiệm đánh giá đúng, chính xác về chất lượng nước chăng nữa cũng chỉ đúng cho “hôm nay” khi phân tích mà thôi. Trong khi đó ta cần đánh giá cho cả tương lai ngày mai! Vì vậy ta cần tiến hành đánh giá về trạng thái vệ sinh địa hình. Nội dung công việc bao gồm: Nghiên cứu bản đồ địa lý, địa chất khu vực xung quanh nguồn nước. Ở đây ta sẽ xác định được những hồ, nháng sông chảy tới bổ cập, những vùng dân cư, công nghiệp có khả năng gây nhiễm bẩn nguồn nước….Và mặt cắt địa chất, tính chất của hai bờ, đáy sông, đáy hồ. Quan sát nguồn cấp nước các điểm gây nhiễm bẩn nguồn nước. Nước thải sinh hoạt, công nghiệp, nhà tắm, giặt công cộng, lược sử tình hình dịch bệnh vùng dân cư… Nếu nguồn cấp nước là nước ngầm thì song song với mặt cắt địa chất phải xét trữ nguồn nước, vị trí và biện pháp khai thác nước, tình hình mạng lưới thoát nước vùng dân cư lân cận. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 79 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG CHƯƠNG 6 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG TRONG XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG 1. PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG BẰNG NHIỆT Phương pháp khử trùng bằng nhiệt đã được biết và sử dụng tử năm 178. Như đã trình bày ở các phần trên, mỗi vi sinh vật thích hợp với một nhiệt độ thích hợp nhất định. Nếu nhiệt độ môi trường nằm dưới hoặc nằm trên nhiệt độ tối ưu thì tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật sẽ chậm lại. Nếu nhiệt độ nằm ngoài ngưỡng giới hạn thì vi sinh vật sẽ chết hoặc tạo bào tử Tốc độ khử trùng bằng nhiệt là một hàm số phụ thuộc vào thời gian và nhiệt độ. Ví dụ Tuberclebacilli bị tiêu diệt trong 30 phút ở 580C, nhưng chỉ mất 2 phút ở 650C và một vài giây ử 720C. Mỗi VSV có một thời gian chết ở một nhiệt độ nhất định. 1.1 Khử trùng trực tiếp bằng ngọn lửa Có thể nói đây là phương pháp khử trùng nhanh nhất, khử trùng trực tiếp bằng ngọn lửa. Phương pháp này được sử dụng trong quá trình nuôi cấy và phân lập vi sinh vật. Phương pháp này chỉ có thể áp dụng với những vật liệu chịu nhiệt độ cao. Trước đây, cách khử trùng này được áp dụng để thiêu những xác người bị bệnh truyền nhiễm để tránh lây lan. Hiện nay phương pháp này vẫn còn áp dụng với nhữmg thú nuôi mắc bệnh lây lan như bệnh than. 1.2 Khử trùng bằng nhiệt khô Dạng năng lượng này không thâm nhập dễ dàng vào một vật liệu cần khử trùng do đó cần nhiệt độ khử trùng cao và thời gian khử trùng dài. Ví dụ nhiệt độ khử trùng là 150C, thời gian khử trùng là 2 giờ thì có thể phá vỡ hoàn toàn bào tử của VSV. Tăng nhiệt độ cao hơn nữa không tốt cho giấy gói dụng cụ khử trùng sẽ bị cháy ở 1800C. Phương pháp khử trùng bằng nhiệt khô được áp dụng để khử trùng những nhiên liệu khô như bột cũng như những dụng cụ thí nghiệm như: ống đong, pipet, phễu thủy tinh, beker...Nhiệt độ không làm mất hình dạng của dụng cụ khử trùng như trong trường hợp hơi nước và không ăn mòn đáy của các vật liệu như beker. 1.3 Khử trùng bằng nước sôi Khử trùng bằng cách nhấn chìm vật liệu trong nước sôi là một trong các phương pháp khử trùng ẩm đã được sử dụng. Khử trùng bằng nhiệt ẩm hơi nóng ngấm vào vật liệu khử trùng nhanh hơn nhiều so với khử trùng bằng nhiệt khô do nước dẫn nhiệt tốt hơn nhiều so với không khí. Do đó nhiệt khử trùng và thời gian khử trùng thấp hơn so với khử trùng bằng nhiệt khô. Nhiệt ẩm giết VSV bằng cách làm biến tính protein của chúng. Biến tính có nghĩa là làm thay đổi tính chất vật lí hay hóa học của protein bao gồm thay đổi cấu trúc của protein do sự phá vỡ các liên kết hóa học giúp cho protein có cấu trúc 3 chiều. Khi protein bị biến đổ thành cấu trúc 2 chiều chúng có thể kết tủa và Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 80 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG trở nên bất hoạt. Ví dụ protein của trứng khi bị luộc trong nước sôi. Việc kết tủa hay phá vỡ cấu trúc protein cần ít năng lượng hơn quá trình oxy hóa do đó nhiệt sử dụng ít hơn. Nước sôi không thể xem như là một nhân tố khử trùng triệt để vì nó không luôn luôn có thể giết chết bào tử của vi khuẩn và những virut không hoạt động. Ở điều kiện bình thường, với nồng độ VSV nhỏ hơn 1 triệu/ml. Hầu hết VSV có thể bị khử trong 10 phút. Tuy nhiên bào tử của nấm, Protozoa cần trên 30 phút. Bào tử của vi khuần cần 2 giờ hoặc hơn nữa. Do khả năng chịu nhiệt khác nhau của VSV, nước sôi không được sử dụng trong mục đích khử trùng. Nếu trong trường hợp phải khử trùng bằng nước sôi, vật liệu phải rữa thật sạch các vết bẩn, vết máu. Thời gian khử trùng tối thiểu 30 phút, ngoại trừ những vùng có độ cao lớn phải gia tăng thời gian khử trùng để bù đắp cho nhiệt độ sôi của nước thấp hơn. Tất cả các vật liệu phải được gói kỹ, có thể thêm soda 2% để tăng hiệu quả của quá trình. 1.4 Khử trùng bằng Autoclave áp suất, nhiệt độ Phương pháp khử trùng bằng áp suất hơi là một trong các phương pháp khử trùng linh động có khả năng khử tất cả các mầm sống bao gồm cả bào tử vi khuẩn. Phương pháp này khử trùng bằng một thiết bị đặc biệt gọi là Autoclave. Hơn 100 năm về trước, các nhà vi sinh vật học người Pháp và Đức đã sử dụng Autoclave như là một thiết bị không thể thiếu trong phòng thí nghiệm của họ. Hình 6. 1: Autoclave Một tính chất cơ bản trong hóa học khi áp suất của khí tăng thì nhiệt độ của khí cũng tăng tỉ lệ. Do hơi nước là gia tăng áp suất trong hệ kín nên nhiệt độ của nó Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 81 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG cũng gia tăng. Khi đó phân tử hơi nước trở nên mạnh mẽ hơn, khả năng thấm gia tăng. Nguyên tắc này giảm thời gian nấu bằng nồi áp suất và giảm thời gian khử trùng bằng Autoclove. Lưu ý rằng tác nhân khử trùng là nhiệt ẩm chứ không phải là áp suất. Autoclove khử trùng cho hầu hết các bào tử vi khuẩn ở 1250C và thời gian là 15 phút. Trong một vài trường hợp đặc biệt thì thời gian khử trùng là 30 phút. Hình 6. 2: Autoclave công nghiệp Autoclove được sử dụng trong bệnh viện cũng như phòng thí nghiệm. Nó dùng để khử trùng ga trải giường, mền, thiết bị… Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm sử dụng nó để khử trùng môi trường nuôi cấy VSV, diệt những VSV gây bệnh. Autoclove cũng gặp một số vấn đề hạn chế ví dụ một số vật liệu bằng nhựa có thể bị chảy ở nhiệt độ cao, hình dạng của thiết bị có thể bị biến dạng. Hơn nửa nhiều hóa chất bị biến tính trong quá trình khử trùng và những cơ chất dầu không được xử lý khi chúng không hòa trộn trong nước. Thời gian khử trùng phải được phân biệt ở các vật liệu khử trùng và từng dạng vật liệu khử trùng khác nhau nên khử trùng riêng lẻ. Gần đây đã xây dựng một số dạng Autoclove mới gọi là prevacuum Autoclove. Thiết bị này hút khí ra khỏi buồng khử trùng ngay khi khởi động, dòng hơi nước bảo hòa trong buồng khử trùng được giữ ở nhiệt độ 132 - 1340C ở áp suất 28 - 30lb/in Thời gian khử trùng giảm xuống còn 4 phút. Sau khi việc khử trùng hoàn tất, khởi động cột bơm hút nước ra khỏi buồng khử trùng và làm khô vật khử trùng. Tiện lợi của thiết bị mới này là tiết kiệm thời gian khử trùng và giảm thời gian hoàn tất toàn bộ quá trình (thời gian để thiết bị giảm áp suất, nhiêt độ…). Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 82 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG 1.5 Phương pháp khử trùng Fraction Trước khi có phát minh về Autoclove, người ta khử trùng những thiết bị và dụng cụ khác bằng hơi nước ở 1000C và 30 phút trong 3 ngày liên tiếp. Phương pháp này gọi là Fractional sterilization. Ở ngày đầu tiên của quá trình khử trùng bằng phương pháp Fraction, các VSV sẽ bị giết chết ngoại trừ các bào tử. Sau một ngày ở nhiệt độ thích hợp các bào tử sẽ phát triển thành VSV và sẽ bị khử ở ngày thứ hai. Một lần nữa vật liệu khử trùng sẽ được làm sạch và một vài bào tử còn sót lại sẽ bị giết chết vào ngày thứ Phương pháp này cũng cho hiệu quả khử trùng tuy nhiên một số bào tử mọc chậm không nảy mầm trong một vài ngày nên hiệu quả khử trùng sẽ không đạt. Phương pháp này đòi hỏi bào tử phải được phát triển trên môi trường thích hợp, ví dụ môi trường broth. 1.6 Phương pháp khử trùng Pasteur Khử trùng Pasteur không có nghĩa chính xác là khử trùng vì mục đích của phương pháp này là làm giảm số lượng của VSV trong dung dịch. Bào tử không bị khử bằng phương pháp này. Phương pháp này được áp dụng để khử trùng các dung dịch nhạy cảm với nhiệt độ, ví dụ sữa. Một dạng khử trùng của Pasteur được gọi là holding method có điều kiện khử trùng là 62,90C trong 30 phút. Cho dù phương pháp này không thể giết vi khuẩn thermophylic (chỉ có khả năng giết mesophylic và spychrophylic) nhưng loại vi khuẩn này không có khả năng sống ở nhiệt độ cơ thể. Dạng khử trùng Pasteur thứ hai là Flash Pasteurization ở 71,60 C trong 15 giây và Ultrapasteurization ở 820C trong 30 giây. Hai dạng này dùng để khử trùng thực phẩm. 1.7 Khử trùng bằng dầu nóng Một số nha sĩ và nhà vật lý sử dụng dầu nóng ở 1600C trong khoảng một giờ để khử trùng thiết bị . Phương pháp này có ưu điểm là dầu không làm rỉ kim loại do đó giảm khả năng ăn mòn. Tuy nhiên sau khi khử trùng thiết bị phải được lau sạch và sấy khô hai bước này có khả năng tái nhiễm VSV. Silicone đôi khi được thay thế dầu. 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG VẬT LÝ 2.1 Phương pháp lọc (Filtration) Phương pháp lọc đã được sử dụng từ những năm 1890. Ban đầu được sử dụng để hấp thu những VSV trong không khí và khử trùng môi trường nuôi cấy nhưng ngày nay phương pháp dược sử dụng chủ yếu để tách virut ra khỏi những VSV khác. Lọc là một kỹ thuật để tách vi khuẩn khỏi dung dịch. Dung dịch đi ngang qua lớp vật liệu lọc, VSV sẽ được giữ lại trên lớp vật liệu lọc, dung dịch nước đi qua vật liệu sẽ được khử trùng hoặc giảm ô nhiễm. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 83 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Có nhiều phương pháp lọc được ứng dụng trong công nghệ vi sinh. Lọc vô cơ sành sứ (thiết bị lọc nước uống), thủy tinh. Lọc hữu cơ có ưu điểm là những phân tử hữu cơ của vật liệu lọc lôi cuốn (attach) những thành phần hữu cơ của VSV. Ví dụ lọc Berkefeld sử dụng vật liệu lọc chế tạo từ tảo biển có tên gọi là tảo cát (Diatom). Tảo cát là tảo đơn bào có rất nhiều ở biển là một thành phần quan trọng trong chuỗi thực phẩm. Hình 6. 3: Máy lọc Lọc menbrane là phương pháp sử dụng rất rộng rãi. Được cấu tạo từ những chất hữu cơ như cellose acetate, pholycarbonate. Phương pháp này có giá trị cao vì ta có thể xác định được số lượng VSV trong dung dịch do vật liệu sau lọc có thể đặt trên môi trường nuôi cấy, VSV sẽ phát triển thành những khuẩn lạc trên lớp vật liệu lọc và ta có thể đếm được. Nếu lọc 100ml mẫu và thu được 59 khuẩn lạc, ta có thể kết luận là số lượng VSV = 59/100ml. Không khí cũng có thể được lọc sạch vi khuẩn nhờ phương pháp này. 2.2 Khử trùng bằng tia cực tím (Ultraviolet Light) Ánh sáng thấy được là dạng radian năng lượng được phát hiện nhờ những tế bào nhạy cảm của mắt. Chiều dài sóng của dạng năng lượng này là 400 - 800nm. Các dạng radian khác có chiều dài sống dài hơn hoặc ngắn hơn khoảng thấy được do đó chúng không được cảm nhận bằng mắt. Hình 6. 4: Máy sản xuất tia cực tím Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 84 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Một dạng radian năng lượng là tia cực tím, tia cực tím được sử dụng khử trùng một cách hữu hiệu. Tia cực tím có chiều dài sóng 100 - 400nm, với năng lượng bước sóng khoảng 265nm khử hầu hết vi khuẩn . Tia cực tím được sử dụng để làm giảm số lượng VSV ở những nguồn gây ô nhiễm: bệnh viện, toilet, nhà ăn…Tia cực tím từ ánh sáng mặt trời là một nhân tố quan trọng kiểm soát VSV trong không khí và trong lớp đất mặt nhưng không có khả năng loại trừ bào tử. Bất lợi của tia cực tím là không có khả năng thâm nhập vào chất lỏng hay chất rắn và chúng cũng là nguyên nhân gây bệnh về da của con người. 2.3 Các dạng tia khử trùng khác (Other Type of Radiaton) Tia X và gamma là hai loại tia khử trùng. Cả hai đều có độ dài bước sóng ngắn hơn tia cực tím. Các tia này khi chiếu vào VSV sẽ phá hủy protein và acid nucleic như AND. Những vi khuẩn gram dương nhạy cảm hơn với các tia ion hóa này so với vi khuẩn gram âm. Tia ion hóa được sử dụng để khử trùng các dược liệu nhạy cảm với nhiệt như vitamin, hormon, các chất kháng sinh (antibiotic) cũng như plastic và chỉ khâu vết thương. Một dạng tia năng lượng khác là vi sóng (microwave) có bước sóng dài hơn tia cực tím. Trong lò vi sóng, các vi sóng được hấp thu bởi phân tử nước. Các phân tử này được thiết lập ở một tốc độ va chạm cao và nhiệt ma sát được đưa vào trong thực phẩm làm thực phẩm nóng lên nhanh chóng. Một dạng khử trùng nữa là tia ánh sáng gọi là tia lazer. Gần đây một số thực nghiệm cho thấy rằng tia lazer có khả năng khử trùng thiết bị và không khí trong phòng mổ cũng như VSV trên các vết thương. VSV có thể bị khử trong vài giây tuy nhiên để đạt hiệu quả tia lazer phải chiếu lên toàn bộ vật liệu khử trùng. 2.4 Sóng siêu âm Ultrasonic Vibbration (U.V) Ultrasonic Vibbration là một dạng sóng siêu âm có tần số cao hơn giới hạn nghe được của con người. Khi sóng siêu âm chiếu thẳng xuống bề mặt của môi trường thì chúng tạo ra một ít ảnh hưởng do tác động lên không khí và làm chúng võng xuống và làm phân tán các rung động. Tuy nhiên khi chúng truyền trong chất lỏng, tia sóng là các nguyên nhân tạo nên các bong bóng cực nhỏ làm cho nước có trạng thái sôi. Một số nhà quan sát gọi hiện tựong này là “sôi lạnh”. Các bong bóng này nhanh chóng bị vỡ và tạo nên dạng sóng va chạm mạnh. VSV tồn tại trong dung dịch bị ảnh hưởng bởi áp suất bên ngoài từ sự va chạm này. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 85 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Hình 6. 5: Máy phát sóng siêu âm Sóng siêu âm được sử dụng để phá vỡ mô tế bào và giữ một vai trò trong nghiên cứu. Sóng siêu âm không được sử dụng nhiều để khử trùng vì chúng chỉ có khả năng khử trùng chất lỏng. Tuy nhiên bệnh viện sử dụng sóng siêu âm để khử trùng máy móc thiết bị. 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN Một số phương pháp vật lý khác không có mục đích khử trùng nhưng có mục đích kiểm soát số lượng VSV trong thực phẩm. 3.1 Phương pháp làm khô Sử dụng trong chế biến cá, thịt, thực phẩm…Như ta đã biết, nước là một nhân tố quan trọng trong đời sống của VSV, nơi nào không có nước thì nơi đó không có sự sống. Dựa vào nguyên tắc này để kiểm soát số lượng VSV bằng cách sấy khô thực phẩm. Bảo quản nhờ muối dựa trên nguyên tắc thẩm thấu. Khi thực phẩm được ướp muối. Nước từ trong tế bào VSV sẽ đi ra ngoài. Quá trình này gọi là quá trình thẩm thấu. VSV sẽ chết khô không trao đổi chất được. Nguyên tắc này cũng thích hợp cho môi trường chứa nồng độ đường cao. 3.2 Phương pháp hạ nhiệt độ Giảm nhiệt độ như trong tủ lạnh, tủ đá có mục đích làm giảm tốc độ trao đổi chất của VSV nghĩa là giảm tốc độ tăng trưởng của VSV. Tuy nhiên một số VSV vẫn có thể tồn tại ở nhiệt độ thấp thậm chí ở điểm đóng băng. Những VSV này sẽ phát triển nhanh chóng khi thực phẩm rã đông, do đó các thực phẩm này phải được nấu ngay sau khi rã đông. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 86 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Bảng 6. 1: Tóm tắt các tác nhân vật lý được sử dụng để kiểm soát VSV Phương pháp vật lý Điều kiện Thiết bị Mục đích kiểm soát Vật liệu khử trùng Lưu ý Sử dụng ngọn lửa trực tiết 1 vài giây Lửa Tất cả VSV Dụng cụ phòng thí nghiệp Vật khử trùng phải bền với nhiệt Khí nóng 160 0C trong 2 giờ Lò nướng Bào tử VK Dụng cụ thủy tinh, bột Không sử dụng cho vật liệu lỏng Nước sôi 1000C trong 10 phút hoặc 1000C trong 2 giờ VSV trong rau quả, bào tử VK Nhiều loại Phải ngâm toàn bộ vật khử trùng trong nước sôi. Cần phải làm sạch vật khử trùng trước khi luộc Áp suất hơi 121 0C,15 phút ở 15lb/in2 Autolave Bào tử VK Thiết bị, dung dịch, môi trường nuôi cẩytong ngành kỹ thuật VSV Khử trùng fraction 30 phút/ngày trong 3 ngày Thiết bị Arnold Bào tử VK Vật liệu không khử trùng bằng pp khác Thời gian dài Pasteur 62,90C trong 30 phút 71,60c trong 15 giây P_asteurizer VSV gây bệnh Sản phẩm bơ sữa Khử trùng không hoàn toàn Dầu nóng 160 0C trong 1 giờ Bào tử VK Dụng cụ Cần rữa sạch dầu Lọc VSV không qua được lổ lọc Màng lọc Berkefeld và membranc Tất cả VSV Dung dịch Nhiều thao tác Tia cực tím 265nm Đèn cực tím Một số VSV Phòng nước (mỏng) Không có khả năng thâm nhập vào chất lỏng và rắn 4. CÁC NHÂN TỐ HÓA HỌC KHỬ TRÙNG QUAN TRỌNG Các nhân tố hóa học dùng để khử trùng rất đa dạng, biến đổi từ một chất đơn giản như ion halogen đến những chất phức tạp như chất tẩy rữa tổng hợp. Có nhiều chất đã được sử dụng rộng rãi nhưng một số chất chỉ được sử dụng gần đây. Trong mục này chúng tôi trình bày nhiều nhóm hóa chất và trình bày cách thức ứng dụng chúng trong kiểm soát VSV. Hình 6. 6: Phun hóa chất khử trùng Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 87 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG 4.1 Halogen Halogen là một nhóm bao gồm các nguyên tố có hoạt tính cao, chúng có 7 điện tích ở lớp ngoài cùng. Có 2 halogen là chlorine và iodine thường được sử dụng để khử trùng . Chlorine tồn tại dưới dạng khí hoặc tồn tại trong các hợp chất hữu cơ, vô cơ. Nó được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước cấp để giữ cho số lượng VSV ở một mức giới hạn. Chlorine phản ứng với rất nhiều ion trong nước do đó khi cho chlorene vào trong nước phải đủ lượng để sau khi phản ứng với các ion trong nước, lượng chlorine còn lại đủ để dảm bảo khử trùng. Lượng chlorine còn dư sau khi khử trùng khoảng 0,2-1ppm. Chlorine cũng tồn tại dưới dạng sodium hypochlorine - NaOCl hay calcium hypochlorine Ca(OCl). Sau này Semmelweis sử dụng chlorinated lime. Hợp chất hypochlorite giải phóng chlorine trong dung dịch. Sodium hypochlorite 0,5% được sử dụng để khử trùng vết thương trong chiến tranh thế giới lần hai. Hợp chất này vẫn được sử dụng rộng rải ở Châu Âu để khử trùng vết thương của vận động viên. Sodium hypochlorite được sử dụng làm chất tẩy trắng trong công nghiệp Dệt. Để khử trùng nước cấp, trung tâm bảo vệ và phòng tránh bệnh dịch đã khuyến khích sử dụng nữa muỗng café sodium hypochlorite trong 2 gallon nước trong 30 phút trước khi sử dụng. Hypochlorite cũng rất hữu hiệu ở nồng độ pha loãng để khử trùng các hồ bơi. Và các thiết bị vệ sinh trong nhà máy. Chloramine như chloramine-T là chất hữu cơ chứa chlorine. Hợp chất này giải phóng Chlorine chậm hơn so với dung dịch chlorite nhưng ổn định hơn. Chúng được sử dụng khử trùng vết thương và trị bệnh. Chlorine tác động đến rất nhiều VSV bao gồm hầu hết các vi khuẩn gram âm và gram dương và nhiều virut, nấm, Protozoa. Tuy nhiên không khử được bào tử. Đối với VSV, halogen là nguyên nhân giải phóng nguyên tử oxy, oxy này kết hợp và làm bất hoạt cytoplasma của protein trong enzyme. Một giả thuyết khác cho rằng chlorinelamf thay đổi cấu trúc của màng membrane của tế bào. Nguyên tố iod có tác động mạnh hơn một chút so với chlorine, chúng có hoạt tính và sức diệt trùng cao hơn. Chúng có mặt rộng rãi trong tự nhiên, ví dụ các thực vật ở biển như rong biển, trong các thực vật này chúng tồn tại trong các hợp chất hóa học. Hợp chất iod hoạt động bằng cách halogen hóa phần tyrosine của phân tử protein. Cồn thuốc iod được sử dụng để khử trùng vết thương bao gồm 2% iodine và sidium iodine hòa tan trong ethyl alcohol. Để khử trùng nước cấp, dung dịch khử trùng nước cấp gồm 5 giọt cồn iodine trong 1 lít Anh (141) nước, trong 30 phút trước khi sử dụng. Hợp chất iod tồn tại dưới nhiều dạng dùng để khử trùng đồ dùng nhà bếp các khách sạn và khử trùng dụng cụ thiết bị. Iodphor là hợp chất tẩy rữa iodine chúng giải phóng iodine trong thời gian dài, chúng có ưu điểm là không làm biến màu giấy và các công trình xây dựng. Hợp chất tẩy rữa này có khả năng tách sinh vật ra khỏi bề mặt dính bám và sau đó halogen tiêu diệt chúng. Một số dạng iodphor là Wescodyne dùng để lau da trước khi mổ. Ioprep để khử dụng cụ mổ. Iosan để khử trùng hàng ngày và Betadine khử trùng vết thương. Iodphor có thể kết hợp với phân tử không phải chất tẩy rữa. Dạng chất mang được sử dụng nhiều là providone giúp ổn định iod và giải phóng iod từ từ. Tuy nhiên chính vật mang này lại không ổn định. Năm 1989, có 4 trường hợp bệnh do vi khuẩn ở màng bụng Pseudomonas cepasia gây ra do sự tích tụ của providone – iodine. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 88 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG 4.2 Phenol và các hợp chất phenol Phenol và các hợp chất của phenol giữ vai trò quan trọng trong lĩnh vực tẩy uế từ những năm 1860 do Joseph Lister phát minh. Phenol là chất khử trùng chuẩn để so sánh để so sánh với các chất khử trùng khác bằng hệ số phenol. Chúng tác động đến vi khuẩn gram dương nhưng hoạt tính của chúng giảm khi có mặt của chất hữu cơ. Các nhà sinh hóa cho rằng phenol làm kết tủa protein đặc biệt là màng tế bào. Phenol đặc, có mùi hăng cay và ăn da do đó vai trò là chất kháng sinh của phenol bị hạn chế. Tuy dẫn xuất của nó là cresol có hoạt tính cao hơn và ít độc hơn các hợp chất ban đầu của chúng. Hổn hợp ortho-, mata-, và para-cresol được dùng trong thương mại gỗ cho các đường ray xe lửa, trụ hàng rào và các cột điện thoại. Bisphenol là sự kết hợp của hai phần tử phenol dùng để khử trùng và tẩy uế. Ortholphenylphenol dùng trong Lysol, Osyl, Staphene và Amphyl. Một dạng Bisphenol khác là hexachlorophene được sử dụng rộng rãi vào những năm 1950 và 1960 trong sản phẩm kem đánh răng, chất khử mùi hôi nách và xà bông tắm. Một sản phẩm pHisoHex kết hợp với hexachlorophene ở pH trung tính là kem giặt. Bác sĩ nhi dùng nó để ngăn chặn sự phát triển của cầu khuẩn trên da đầu của trẻ sơ sinh. Tuy nhiên vào những năm cuối của thập niên 1960 một số nghiên cứu đã cho thấy rằng với lượng thừa chất này có thể hấp tụ vào da và làm phá hủy hệ thần kinh ở chuột và do đó hexachlorophene đã bị loại bỏ ra khỏi sản phẩm liên quan. pHisoHex vẫn tồn tại nhưng chỉ có trong đơn thuốc. Mata bisphenol quan trọng là chlorhexidine. Hợp chất này được tổng hợp vào năm 1976 bởi Bộ quản lí thực phẩm và dược phẩm dùng làm chất khử trùng da và rữa tay. Dung dịch chlorhexidine 4% trong alcohol trong thương mại có tên gọi Hibiclens. Hóa chất này tác động lên màng tế bào vi khuẩn (VK) gram dương và gram âm. Chlohexidine 0,2% được sử dụng rộng rãi giúp chống viêm lợi và viêm nướu răng. Tuy nhiên có một số dấu hiệu cho thấy VK có thể phát triển trong đó. Một dạng phenol khác là hexylresorcinol dùng làm chất súc miệng, chất khử trùng. Dạng này có ưu điểm là làm giảm sức căng bề mặt do đó vi khuẩn bị tách ra khỏi mô và giúp cho chất sát trùng dễ dàng thấm sâu vào. 4.3 Kim loại nặng Thuật ngữ oligodynamic có nghĩa là năng lực nhỏ dùng để giải thích về hoạt tính của kim loại nặng như mercury, silver và copper lên VSV. Những nguyên tố này gọi là kim loại nặng vì khối lượng nguyên tử của chúng lớn và cấu hình điện tử phức tạp. Thủy ngân là một loại chất khử trùng cổ truyền tồn tại dưới dạng mercury chloride (HgCl2) được sử dụng bởi người Hy Lạp và La Mã để chữa bệnh về da. Tuy nhiên thủy ngân rất độc đối với kí chủ và hoạt tính của mercury giảm khi có sự hiện diện của chất hữu cơ. Một số sản phẩm như Mercurochrome, Merthiolate, Methphen là do mercury kết hợp với vật liệu mang, những hợp chất này ít độc khi khử trùng da đặc biệt sau khi mổ. Merthiolate được sử dụng như chất bảo quản vaccin. Đồng tác động lên những vi sinh vật chứa chlorophyll và đặc biệt ảnh hưởng đến tảo. Copper sulphate (CuSO4) dùng để khử nước trong hồ bơi và trong nước cấp. CuSO4 kết hợp với vôi (CaCO3) để tạo thành bluish - white Bordeux mixture, hợp chất này được sử dụng từ năm 1882 dùng để khử nấm. Bạc tồn tại dưới dạng nitrate bạc (AgNO3) dùng làm chất khử trùng và diệt khuẩn. Ví dụ nhỏ một giọt nitrate bạc 1% vào mắt trẻ sơ sinh để tránh bị nhiểm bệnh do Neissria gonorrhoeae gây ra. Vi khuẩn gram âm Diplococcus có thể là nguyên nhân gây Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 89 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG bệnh mù mắt cho trẻ sơ sinh trong giai đoạn khi đi ngang qua cổ tử cung. Năm 1884, Karl S.F Crede sử dụng nitrate bạc để phòng tránh những bệnh về mắt. Với mục đích khử trùng , hợp chất bạc được sử dụng với mục đích khử trùng vết khâu khi mổ. Kim loại nặng rất nhạy với protein đặc biệt là nhóm sulfhydryl (-SH) và chúng làm kết dính các phần tử protein bằng các cầu nối . Do protein là những enzyme do đó quá trình chuyển hóa cellose bị bất hoạt và làm cho VSV chết. Tuy nhiên kim loại nặng không ảnh hưởng đến bào tử. 4.4 Alcohol (rượu) Rượu khử trùng da và có thể tẩy uế một số thiết bị y tế. Trong thực tế thường sử dụng ethyl alcohol. Ethy alcohol tác động lên các tế bào sinh trưởng của vi khuẩn gồm cả Tuber Bacilus nhưng không tác động đến bào tử. Nó làm biến tính protein và hòa tan lipid, tác động này có thể dẩn đến hiện tượng các tế bào của màng membrane không liên kết với nhau. Ethyialcohol cũng là một tác nhân khử nước mạnh. Do ethyl alcohol phản ứng ngay với bất kì chất hữu cơ nào do đó những thiết bị y tế hay những thiết bị đo nhiệt phải được làm sạch trước khi làm sạch bằng rượu. Người ta thường sử dụng dung dịch cồn 50 -80% để tránh bay hơi và đủ thời gian để thấm vào mô. Với dung dịch cồn 70% trong 10 phút đủ để khử trùng thiết bị. Cồn được sử dụng để bảo quản mỹ phẩm khử trùng da trước khi tiêm. Chúng có chức năng là tẩy vi khuẩn ra khỏi da và hòa tan lipid làm sạch da. Isopropyl alcoholcos hoạt tính cao ở 99%. Methyl alcohollaf chất độc cho mô tế bào nên ít được sử dụng. 5. CÁC NHÂN TỐ HÓA HỌC KHÁC 5.1 Formaldehyde Formaldehyde tồn tại ở dạng khí ở nhiệt độ cao và dưới dạng rắn ở nhiệt độ thấp. Hòa tan 37 gram formaldehyde trong 100ml nước ta được dung dich formalin. Qua nhiều thế kỹ formal dehyde được sử dụng bảo quản các mẫu xét nghiệm, tẩm liệm cũng như mục đích khử trùng. Đối với nghành VSV học, formaldehyde dùng để bất hoạt virus trong vaccine. Dưới dạng khí, formaldehyde được thổi vào các ngăn kín để khử trùng dụng cụ mổ, áo blue và thiết bị y khoa. Tuy nhiên do thấm không tốt nên thời gian khử trùng phải kéo dài 12 giờ để đảm bảo hiệu quả. Thiết bị có thể khử trùng bằng cách nhúng vào dung dịch formaldehyde 20% và alcohol 70% trong 18 giờ. Tuy nhiên formaldehyde còn dính lại trên thiết bị do đó cần phải làm khô trước khi sử dụng. Tiếp xúc với hợp chất này dể bị dị ứng. Formaldehyde là một ankal nó phản ứng với nhóm amino hay nhóm hydrocid của nhóm acid nucleic và protein với nhóm carbonxyl và sulfhydryl của protein bằng cách gắn thêm vào một sườn nhỏ carbon (nhóm ankyl) và hình thành một cầu nối giữa các nhóm. Sự thay đổi cấu trúc ảnh hưởng đến tính chất hóa học của chất hữu cơ do đó làm cho vi sinh vật chết. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 90 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG 5.2 Ethylene Oxyde (EtO) Sử dụng vật liệu bằng plastic trong thí nghiêm vi sinh cần phải chuẩn bị một phương pháp khử trùng thích hợp đối với những vật liệu nhạy cảm với nhiệt. Vào những năm 1950 các nhà khoa học đã phát hiện ra chất khử trùng ethylen oxyde (EtO) mà có thể sử dụng đĩa petry và ống tiêm plastic. Ethylen oxyde là một phân tử nhỏ có khả năng thấm tốt và có thể khử bào tử. Tuy nhiên, nó độc và dễ nổ. Khả năng nổ của nó sẽ giảm nếu trộn chung với frezon trong cryoxyde hoặc carbon dioxyde trong carboncide tuy nhiên nó vẫn độc đối với những người làm việc với nó. Khi được đưa vào buồng khử trùng kín và ở đó chúng di chuyển tuần hoàn trong 4 giờ với sự kiểm soát chặt chẽ ẩm độ. Sau đó buồng khử trùng phải được bơm khí trơ từ 8 - 12 giờ nhằm đuổi hoàn toàn EtO, nếu không nguyên tố này có thể làm cháy da người ta gọi là cháy “lạnh”. Ethylrn Oxyde được sử dụng để khử trùng giấy, da, len, kim loại, cao su và plastic. Trong bệnh viện Ethylen oxyde được khử trùng ống thông đường tiểu, van tim nhân tạo, thiết bị quang học. Cơ quan không gian NASA sử dụng khí này đầu mang khí cụ khoa học. Buồng khử trùng bằng ethylen oxyde trở thành bản sao của Autoclave. Thường được gọi là Autoclave khí. Một dạng liên quan là Beta – Propiolactone (BPL) ít gây nổ so với ethylen oxyde tuy nhiên khả năng thấm hạn chế. Dưới dạng lỏng chúng dùng để khử trùng vaccine, chai serume và chỉ khâu khi mổ. Tuy nhiên các nhà khoa học đã cho thấy rằng đây là một chất gây ung thư do đó nó chỉ được sử dụng trong một số trường hợp nhất định. 5.3 Glutaraldehyde Glutaraldehyde là một trong những chất lỏng có hiệu quả khử trùng cao nhất. Phân tử nhỏ này giết chết tế bào sinh dưỡng trong 10 – 30 phút và bào tử trong 10 giờ. Glutaraldehyde là một ankyl thường dùng dưới dạng dung dịch 2%. Nó dùng để khử trùng vật liệu được tiền làm sạch, ngâm vật liệu vào dung dịch 10 phút, rữa lại bằng nước vô trùng làm khô trong buồng làm khô bằng khí vô trùng và trữ trong buồng vô trùng để đảm bảo vật liệu được vô trùng. Nếu các bước thao tác này được thực hiện liên hoàn vật liệu có thể được tẩy uế chứ chưa có nghĩa là khử trùng. Do hoạt tính của Glutaraldehyde không bị giảm khi có sự hiện diện của chất hữu cơ. Hóa chất này thường được dùng khử thiết bị mổ nơi thường có sự hiện diện của máu. Hơn nữa Glutaraldehyde không phá vỡ những vật liệu mỏng do đó được dùng để khử trùng những thiết bị quang học. Tuy nhiên Glutaraldehyde bốc khói khó chụi và phải rữa lại vật khử trùng bằng nước tiệt trùng. Ở pH = 7,5 Glutaraldehyde giết S.aureus trong 5 phút và M.tuberculois trong 10 phút. 5.4 Hydrogen Peroxyde (H2O2) Hydrogen Peroxyde dùng để rữa vết thương, vết xước hoặc trầy da. Vùng nổi bọt và sùi bong bóng trong vết thương do Hydrogen Peroxyde bị bẻ gảy thành oxygen và nước. Dạng oxygen mới hình thành này rất độc với vi sinh vật. Vi khuẩn kỵ khí rất nhạy cảm với H2O2 vì oxygen ức chế sự phát triển của chúng. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 91 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Một dạng H2O2 mới là Super Hydrogen Peroxyde, dạng này nó ổn định hơn do đó nó không tự ý phân hủy. Nhưng nguyên tố vô sinh như tròng mắt contact lenses, đồ dùng nhà bếp, những dụng cụ nhựa nhạy cảm với nhiệt và dụng cụ chế biến thực phẩm có thể được khử trùng trong 30 phút. Sự khử trùng cũng đạt yêu cầu trong 6 giờ với dung dịch pha loãng 6%. Các nhà vi sinh vật học dùng H2O2 để khử trùng VSV trong sữa và các sản phẩm sữa 5.5 Xà bông và chất tẩy rữa Xà bông là hợp chất hóa học gồm các acid béo, kết hợp với potassium hoặc sodium hydroxyde. pH của hợp chất này khoảng 8 và sự phá vỡ cấu trúc của VSV là do tính kiềm được thiết lập trên da. Tuy nhiên hoạt động chính của xà phòng là tách vi khuẩn ra khỏi da như là một chất khủ trùng. Xà phòng là một nhân tố ướt, chúng chuyển thành dạng sữa và chúng hòa tan những hạt dính chắc trên da làm giảm sức căng bề mặt và làm tăng hoạt tính làm sạch. Chất tẩy rữa là một hóa chất tẩy rữa tổng hợp có hoạt tính cao. Và là nhân tố làm giảm sức căng bề mặt. Chúng hoạt động và bám lên nhóm phosphate của màng membrane. Chất tẩy rữa amonic tạo ra ion âm trong dung dịch. Chúng tác động lên vi khuẩn gram dương nhưng những vi khuẩn gram âm gây ảnh hưởng khả năng của chúng. Các chất tẩy rữa khác là cationic tạo ion dương. Các dẫn xuất của amonium chloride này chứa 4 gốc hữu cơ thay vì hydro và ít nhất một gốc là nhóm mạch dài alkyl. Nhóm amonium dương tính được cân bằng bởi các ion âm chloride. Các hợp chất này được gọi là hợp chất ammonium bậc. Những hợp chất tẩy rữa dương tính có tên dài và phức tạp như Benzalkonium Chloride trong Zephiran và Cetylpyridinium Chloride trong Ceepryn. Các chất tẩy rữa khác được sử dụng trong Phemerol và Diaparene. Chất tẩy rữa dương tính là chất kháng khuẩn trong phạm vi rộng, đặc biệt đối với vi khuẩn gram dương. Chúng được sử dụng như tác nhân khử trùng thiết bị công nghiệp và đồ dùng chế biến thực phẩm, khử trùng da, nước xúc miệng và dung dịch bảo quản Contact Lenses và khử trùng tường và sàn bệnh viện. Tuy nhiên, khi trộn với xà phòng nó bị giảm hoạt tính và một số loại vi khuẩn gram âm như Pseudomonas Aeruginosa có thể phát triển được. 5.6 Thuốc nhuộm Thuốc nhuộm được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh như một tác nhân nhuộm màu khi phân lập vi khuẩn từ một hổn hợp vi khuẩn. Nhóm thuốc Triphenylmethan cũng được sử dụng như một nhân tố kháng Bacillus và Staphylococcus. Nhóm này gồm: Malachite Green và Crystal Violet. Nhóm thuốc nhuộm Acridine gồm Acriflavine và Proflavine. Cả hai đều được xem như là chất kháng sinh được sử dụng để khử trùng vết thương. Chúng tác động trực tiếp đến ADN làm ngăn chặn sự tổng hợp ARN. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 92 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG 5.7 Acid Acid cũng được sử dụng như một chất khử trùng. Các loại phổ biến là: benzolic, salicylicvà undecylenic. Acid hữu cơ được sử dụng trong bảo quản thực phẩm ví dụ bảo quản những thực phẩm lên men như phômai, sốt mayonaire và những sản phẩm chua như dưa chua. Acid propionic được cho vào các sản phẩm bánh mì để giữ cho số lượng vi sinh vật ở mức thấp. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 93 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BÀI THỰC HÀNH VI SINH MÔI TRƯỜNG 2 1. Tổng số sinh viên:___; được chia thành __ nhóm; mỗi nhóm chia thành __ nhóm nhỏ; mỗi nhóm nhỏ có ___ sinh viên. 2. Thời gian thực tập: 3. Giáo viên hướng dẫn: Thiết Bị ¾ 1 Autoclave ¾ 2 tủ ấm ¾ 1 tủ sấy ¾ 1 phễu lọc ¾ 5 kính hiển vi ¾ 4 bếp điện + 4 ca nhôm chưng cất cách thuỷ ¾ 1 cân phân tích Dụng Cụ Mỗi Nhóm ¾ 2 đèn cồn ¾ 1 viết aceton ¾ 1 khăn lao ¾ 1 chai nước cất ¾ 1 giá đựng ống nghiệm ¾ 1 giá treo pipet ¾ 1 bóp cao su ¾ 2 que cấy vi khuẩn ¾ 1 kẹp giấy (dùng để gắp giấp lọc, quấn nút gòn) ¾ Giấy gói dụng cụ, gòn và thun, cồn, ống duham ¾ Nhắc sinh viên mang theo giấy vẽ (A4) và bút chì. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 94 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BÀI 1: GIỚI THIỆU 1. Mục đích - Quan sát các loại bùn xử lý nước thải - Pha chế môi trường nuôi cấy Vi sinh vật 2. Ý nghĩa: ¾ Nhận biết các loại bùn xử lý nước thải ¾ Nhận biết phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật. 3. Quan sát các loại bùn xử lý nước thải ¾ Bùn septic ¾ Bùn hạt ¾ Sử dụng mắt thường, kính hiển vi quan sát thô, kính hiển vi quan sát bùn nghiền với nước cất. 4. Pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật ¾ Pha chế môi trường PCA 9 300 ml 9 Berker 500 ml: 2 9 Ống đong 500 ml 9 Đũa thủy tinh: 2 9 Ống nghiệm: 30 9 Bông gòn, thun, giấy gói. 9 Thao tác • Cân bột agar PCA:___g • Đong nước cất: 300 ml • Khuấy cho bột tan đều • Đặt berker lên bếp điện, khuấy đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt. • Bắt berker khỏi bếp điện, để 10 phút • Chế môi trường vào các ống nghiệm: 10 ml • Đậy nút gòn, gói giấy. • Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, trong 15 phút ¾ Pha chế môi trường BGBL 9 300 ml 9 Berker 500 ml: 2 Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 95 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG 9 Ống đong 500 ml 9 Đũa thủy tinh: 2 9 Ống nghiệm: 30 9 Bông gòn, thun, giấy gói. 9 Thao tác • Cân bột agar PCA:___g • Đong nước cất: 300 ml • Khuấy cho bột tan đều • Đặt berker lên bếp điện, khuấy đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt. • Bắt berker khỏi bếp điện, để 10 phút • Chế môi trường vào các ống nghiệm: 10 ml • Đậy nút gòn, gói giấy. • Hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, trong 15 phút ¾ Pha chế môi trường Les Endo Agar 9 300 ml 9 Berker 500 ml: 2 9 Ống đong 500 ml 9 Đũa thủy tinh: 2 9 Ống nghiệm: 30 9 Bông gòn, thun, giấy gói. 9 Thao tác • Cân bột agar PCA:___g • Đong nước cất: 300 ml • Khuấy cho bột tan đều • Đặt berker lên bếp điện, khuấy đều tay cho đến khi dung dịch trong suốt. • Bắt berker khỏi bếp điện, để 10 phút • Chế môi trường vào các ống nghiệm: 10 ml • Đậy nút gòn, gói giấy. • Không hấp khử trùng. 5. Bài thu hoạch ¾ Nhận xét các loại bùn xử lý nước thải ¾ Nhận xét phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 96 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ VI KHUẨN 1. Mục Đích Xác định tổng số vi khuẩn trong mẫu nước sông Xác định tổng số coliform trong nước thải nhà máy Quan sát, vẽ hình và phân loại nguyên sinh động vật trong nước rửa rau xà lách. 2. Ý Nghĩa Biết được các phương pháp nuôi cấy Nhận xét các loại mẫu thí nghiệm: loại mẫu, mức ô nhiễm dự đoán suy ra từ cảm quan và từ vị trí lấy mẫu… 3. Kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu nước sông. ¾ Sử dụng phương pháp đếm đĩa ¾ Môi trường PCA: Plate Count Agar ¾ Dụng cụ và vật liệu (cho từng nhóm nhỏ): 9 Ống nghiệm pha loãng mẫu: 5 9 Pipet: 10 ml: 1 & 1 ml: 5 9 Đĩa petri lớn: 2 x 4 = 8 ¾ Thao tác 9 Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 9 Hút bằng pipet (10 ml) 9 ml nước cất cho vào mỗi (5) ống nghiệm. 9 Hút 1 ml mẫu nước cống cho vào ống nghiệm thứ nhất ta được mẫu pha loãng 10-1 9 Lắc đều ống nghiệm 10-1, hút 1 ml cho vào ống nghiệm 10-2 9 Tiếp tục như vậy ta được các mẫu pha loãng với tỉ lệ cần thiết. ¾ Đun cách thuỷ các ống nghiệm đựng môi trường đến khi môi trường chảy lỏng. ¾ Để nguội môi trường đến 450C: độ nóng có thể chấp nhận được khi dùng tay nắm pipet ¾ Hút 1 ml mẫu và nhỏ vào pipet, đặt nghiêng pipet 1 góc 450 so với phương ngang của pipet ¾ Đổ ống nghiệm chứa môi trường đã nguội ở 450C vào pipet ¾ Đóng nắp pipet, đặt xuống mặt bàn và xoay ngược và xuôi chiều kim đồng hồ: 5 vòng ¾ Chờ cho môi trường nguội và đông đặc Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 97 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ¾ Lật ngược petri, ghi chú thích: loại mẫu, pha loãng, ngày nuôi cấy, người nuôi cấy. ¾ Ủ trong 24 – 28 -72 giờ. 4. Kiểm tra tổng số Coliform trong mẫu nước thải nhà máy. ¾ Phương pháp MPN 9 Môi trường BGBL 9 Mỗi nhóm 18 ống môi trường 9 Ống nghiệm pha loãng: 5 9 Pipet: 10 ml:1 & 1 ml: 5 9 Thao tác • Thao tác pha loãng như trên • Môi trường gồm 9 ống nghiệm chứa BGBL (chứa ống duham) • Chia 9 ống môi trường thành 3 nhóm với kí hiệu 10-1, 10-2, 10-3 • Ở nhóm 10-1, hút 1 ml mẫu pha loãng 10-1 cho vào mỗi (3) ống nghiệm. Tương tự nhóm 10-2, 10-3 • Đậy nắp gòn, gói giấy mỗi 9 ống và đem vào tủ ấm. • Với nuôi cấy Coliorm: nhiệt độ là 370C • Với nuôi cấy Coliorm phân: nhiệt độ là 44 – 450C • Ủ trong 24 – 48 – 75 giờ. ¾ Phương pháp lọc 9 Giấy lọc: 4 miếng 9 Môi trường nuôi cấy Les Endo Agar: 4 ống nghiệm 9 Petri nhỏ: 4 9 Pipet sử dụng chung với bài PP.MPN 9 Mẫu pha loãng: sử dụng chung với bài PP.MPN 9 Thao tác: • Chưng cách thuỷ môi trường thạch Les Endo Agar • Để nguội 450C và đổ vào đĩa petri • Chờ cho môi trường nguội và đông đặc • Dùng giấy lọc đặt trên phuễ lọc, bề sạc hướng lên trên, bật máy bơm hút • Hút 1 ml mẫu, nhiễu từng giọt, đều, lên trên bề mặt của giấy lọc • Chờ cho giấy lọc khô • Dùng kẹp gắp tờ giấy lọc đặt lên trên mặt thạch, bề sọc hướng lên trên • Ghi chú lên trên đĩa petri Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 98 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG • Gói đĩa và đem đĩa vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 – 450C • Ủ trong 24 – 48 – 72 giờ 5. Quan sát, vẽ hình và phân loại nguyên sinh động vật trong nước rửa rau xà lách ¾ Kính hiển vi ¾ Lam, lammen ¾ Nước rửa rau xà lách ¾ Giấy vẽ (A4), bút chì ¾ Thao tác: 9 Dùng đũa thuỷ tinh lấy một giọt nước rau xà lách cho lên lam, đậy lammen lên trên giọt nước. 9 Xem mẫu dưới kính hiển vi, vật kính 10x 9 Nhận dạng và quan sát tất cả các dạng nguyên sinh động vật có trong mẫu nước 9 Vẽ hình và tra bảng xác định chủng loại nguyên sinh động vật 6. Bài thu hoạch ¾ Trình bày thao tác tiến hành các phương pháp nuôi cấy. ¾ Nêu nhận xét các loại mẫu thí nghiệm: loại mẫu, mức ô nhiễm dự đoán suy ra từ cảm quan và từ vị trí lấy mẫu… ¾ Trình bày các hiện tượng đã xảy ra trong quá trình phân tích để có thể giải thích kết quả. VD: ống BGBL có bọt hoặc ống duham có bọt, quên đóng nắp petri, bông gòn để xuống mặt bàn, quên ghi hiệu pipet, thao tác quá xa đèn cồn, cháy bông gòn… Vẽ hình và phân loại nguyên sinh động vật trong nước rửa rau xà lách. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 99 TLGD VI HÓA SINH KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG TÀI LIỆU THAM KHẢO Ross E Mckinney.1962..Microbiology for Sanitary Engineers.McGraw – Hill book company. Inc. Giáo trình.1994.Các quá trình vi sinh vật trong các công trình cấp thoát nước. Trường đại học xây dựng. Odum.1976.Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục. Anthony F Guady, Jr.1980.Microbiology for environmental scientists and engineer. McGraw – Hill book company, Inc. Hans G Schlegel.1997. General Microbilogy. Cambridge University Press. Nguyến Lâm Dũng .2002. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục. Christopher K mathews et all.2000.Biochemistry. Addison – Wesley Publishing Company. Biên soạn: Ths Nguyễn Trần Thiện Khánh 100