Xác định 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong bạch cầu cấp dòng tủy tại bệnh viện truyền máu huyết học thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 498 XÁC ĐỊNH 4 TỔ HỢP GEN AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 TRONG BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Phan Nguyễn Thanh Vân*, Nguyễn Tấn Bỉnh*, Nguyễn Thị Kim Định*, Phan Thị Xinh** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT). Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Sử dụng phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược với mồi thiết kế có thể phát hiện được tất cả các kiểu bản sao của mỗi tổ hợp gen. Nghiên cứu được tiến hành trên bệnh nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7 năm 2011. Kết quả: 19 bệnh nhân (BN) biểu hiện AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu hiện PML/RARA (6,8%), 7 BN biểu hiện CBFB/MYH11 (4,3%), và 4 BN biểu hiện MLL/AF9 (2,5%), trong số 162 BN BCCDT. Kết luận: Kỹ thuật RT-PCR đơn giản, có độ nhạy cao nên được triển khai tại các cơ sở chuyên khoa Huyết học tại Việt Nam để giúp phát hiện nhanh các chuyển vị NST thường gặp không những trong BCCDT mà còn trong các bệnh lý máu ác tính khác. Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT), Phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction). ABSTRACT DETECTION OF 4 FUSION GENES: AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HO CHI MINH CITY Phan Nguyen Thanh Van, Nguyen Tan Binh, Nguyen Thi Kim Dinh, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 498 - 502 Objective: To detect 4 fusion genes AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 in Acute Myeloid Leukemia (AML) patients. Method: Case series - descriptive research. Using RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) with primer sets that can amplify all possible transcripts of each fusion gene. From March 01, 2010 to July 31, 2011, we analysed Acute Myeloid Leukemia patients at Blood Transfusion Hematology Hospital. Results: 19 patients expressing AML1/ETO (11.7%), 11 patients expressing PML/RARA (6.8%), 7 patients expressing CBFB/MYH11 4.3%), and 8 patients expressing MLL/AF9 (2.5%), among 162 newly diagnosed patients with AML. Conclusion: RT-PCR is simple and highly sensitive technique that should apply to detect the frequent chromosome translocations not only in AML but also in other hematologic malignancies in hematology centers in Vietnam. * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. BS. Phan Nguyễn Thanh Vân ĐT: 0919.691.770 Email: vanntp@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 499 Keywords: Acute Myeloid Leukemia (AML), Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến nay, các bất thường về nhiễm sắc thể (NST) liên quan chặt chẽ với bệnh lý ác tính hệ tạo máu và là chỉ điểm quan trọng trong việc chẩn đoán và tiên lượng bệnh(11). Khảo sát những bất thường về NST và đột biến gen lúc chẩn đoán là yếu tố tiên lượng độc lập đối với đáp ứng điều trị và thời gian sống còn của bệnh nhân (BN). Việc phân nhóm nguy cơ theo di truyền tế bào khác nhau giữa nhóm BN trẻ tuổi và nhóm ≥ 60 tuổi và những bất thường NST mắc phải hiện diện trong tế bào ung thư máu của hầu hết bệnh nhân BCCDT. Một số chuyển vị NST tạo ra những tổ hợp gen đặc trưng trong bệnh BCCDT như AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 của 4 chuyển vị nhiễm sắc thể t(8;21)(q22;q22)(1,15,16,17), t(15;17)(q22;q11)(2,5,6,8), inv(16)(p13;q22)(4,7,13), và t(9;11)(p21-22;q23)(3,10,14), tương ứng. Từ đầu năm 2010 đến nay, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. HCM đã sử dụng phương pháp RT-PCR để khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp là AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trong BCCDT ngay lúc chẩn đoán. Với phương pháp này, kết quả sẽ được xác định trong vòng 1 tuần góp phần phân nhóm tiên lượng vào ngày thứ 8 của phác đồ điều trị, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả loạt ca. Đối tượng Nghiên cứu được tiến hành trên 162 bệnh nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7 năm 2011. Bệnh nhân mới được chẩn đoán xác định bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, dựa vào huyết đồ, tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào. Phương pháp Mẫu máu hoặc mẫu tủy được ly trích RNA sử dụng Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) theo qui trình kỹ thuật do công ty cung cấp. Sau khi ly trích RNA, cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng kít iScript cDNA synthesis (Công ty Biorad, Mỹ), tuân thủ qui trình kỹ thuật của công ty. Thành phần phản ứng PCR gồm có 1 μL cDNA được trộn với 0,1 μL (0,5 U) iTaq Polymerase (Biorad), 1 μL (10 pmol) cặp mồi xuôi và ngược trong 20 μL hỗn hợp. Để khuếch đại bộ 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9, 4 mồi cho mỗi tổ hợp gen được sử dụng. Riêng đối với những tổ hợp gen cần được khảo sát qua hai giai đoạn thì phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng 1 μL sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ nhất làm mạch khuôn. Nhiệt độ bắt cặp và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo từng loại tổ hợp gen, cặp mồi, tùy theo từng trường hợp cụ thể. Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng máy luân nhiệt iCycler (Công ty Biorad). Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên thạch 2% chứa 0,5 μg/mL ethidium bromide trong 0,5 x TBE, quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ (Công ty Biorad). Kết quả dương tính nếu như biểu hiện kích thước băng tương ứng các cặp mồi được mô tả trong bảng 1(18). Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excell và Medicalc. Bảng 1: Danh sách các đoạn mồi khảo sát 4 tổ hợp gen trong BCCDT STT Tên mồi Trình tự nucleotide Tên gen và kích thước sản phẩm 1 AML1-A 5' CTA CCG CAG CCA TGA AGA ACC 3' 2 ETO-B 5' AGA GGA AGG CCC ATT GCT GAA 3' AML1/ETO AML1 exon 5/ ETO exon 2: 395 bp 3 PML-C2 5' AGC GCG ACT ACG AGG AGA T 3' 4 RARA-D 5' CTG CTG CTC TGG GTC TCA AT 3' PML/RARA Type bcr1: 688 bp Type bcr2: 652 bp Type bcr3: 289 bp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 500 STT Tên mồi Trình tự nucleotide Tên gen và kích thước sản phẩm 5 CBFB-C 5' GGG CTG TCT GGA GTT TGA TG 3' 6 MYH11-D2 5' CTT GAG CGC CTG CAT GTT 3' CBFB/MYH11 Type A: 271 bp 7 MLL-F1 5' CCA GAG CAG AGC AAA CAG AAA A 3' 8 AF9-R1 5' CGA TCT GCT GCA GAA TGT GTC 3' 9 MLL-F2 5' CCG CCC AAG TAT CCC TGT A 3' 10 AF9-R2 5' GTA TGC CTT GTC ACA TTC ACC A 3' MLL/AF9 MLL exon 9/ AF9 exon 5: 468bp MLL exon 10/ AF9 exon 4: 645 bp KẾT QUẢ Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, 162 bệnh nhân BCCDT đã được chọn vào nhóm nghiên cứu, để xác định 4 tổ hợp gen nêu trên. Tuổi trung vị là 35,5 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) là 16 và giá trị bách phân thứ 75 (75%) là 46. Trong đó, tuổi trung vị của giới nam là 39, của giới nữ là 31,5. Sự phân bố tuổi được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT theo tuổi Nhóm tuổi Số lượng Tỉ lệ% Dưới 15 tuổi 36 22,2% Từ 15 đến dưới 30 tuổi 35 21,6% Từ 30 đến dưới 45 tuổi 39 24,1% Từ 45 đến dưới 60 tuổi 40 24,7% Từ 60 tuổi trở lên 12 7,4% Tổng số 162 100,0% Tỉ lệ nam (51,9%) và nữ (48,1%) gần như tương đồng nhau. Chẩn đoán tủy đồ chiếm đa số là M2 (61,1%); kế tiếp, M3 (14,2%), M4 (12,3%) (Bảng 3). Bảng 3: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDT theo chẩn đoán tủy đồ Chẩn đoán Số lượng Tỉ lệ% M0 3 1,9% M1 5 3,1% M2 99 61,1% M3 23 14,2% M4 20 12,3% M5 3 1,9% M6 7 4,3% M7 2 1,2% Tổng số 162 100,0% Kết quả xác định gen được mô tả trong bảng 4. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, nhóm còn lại chiếm tỉ lệ 77,2%. Bảng 4: Kết quả 4 tổ hợp gen trong BCCDT Loại gen Số lượng Tỉ lệ% AML1/ETO 19 11,7% PML/RARA 11 6,8% CBFB/MYH11 7 4,3% MLL/AF9 4 2,5% Không biểu hiện gen 121 74,7% Tổng số 162 100,0% Chẩn đoán tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào có liên quan với tổ hợp gen (Bảng 5, 6, 7 và 8). Bảng 5: Phân phối nhóm bệnh BCCDT theo chẩn đoán tủy đồ và tổ hợp gen (P < 0,0001) Loại gen Chẩn đoán AML1/ ETO PML/RARA CBFB/M YH11 MLL/A F9 Không biểu hiện gen Tổng số M0 0 0 0 0 3 3 (1,9%) M1 0 0 0 0 5 5 (3,1%) M2 17 0 4 1 77 99 (61,1%) M3 0 11 0 1 11 23 (14,2%) M4 2 0 3 0 15 20 (12,3%) M5 0 0 0 2 1 3 (1,9%) M6 0 0 0 0 7 7 (4,3%) M7 0 0 0 0 2 2 (1,2%) Tổng số 19 (11,7% ) 11 (6,8%) 7 (4,3%) 4 (2,5%) 121 (74,7%) 162 Bảng 6: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M2 và tổ hợp gen AML1/ETO (P = 0,0143) Chẩn đoán Tổ hợp gen M2 Không phải M2 Tổng số AML1/ETO + 17 2 19 (11,7%) AML1/ETO - 82 61 143 (88,3%) Tổng số 99 (61,1%) 63 (38,9%) 162 Bảng 7: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M2 và tổ hợp gen PML/RARA (P = 0,0001) Chẩn đoán Tổ hợp gen M2 Không phải M2 Tổng số PML/RARA + 0 11 11 (6,8%) PML/RARA - 99 52 151 (93,2%) Tổng số 99 (61,1%) 63 (38,9%) 162 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 501 Bảng 8: Phân phối nhóm bệnh BCCDT, thể M3 và tổ hợp gen PML/RARA (P < 0,0001) Tổ hợp gen Chẩn đoán M3 Không phải M3 Tổng số PML/RARA + 11 0 11 (6,8%) PML/RARA - 12 139 151 (93,2%) Tổng số 23 (14,2%) 139 (85,8%) 162 BÀN LUẬN Đối với BCCDT, những bất thường NST lúc chẩn đoán có ý nghĩa tiên lượng rất rõ ràng. Có 4 kiểu chuyển vị NST thường gặp trong BCCDT là t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), inv(16)(p13;q22), và t(9;11)(p21-22;q23) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gen là AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 tương ứng. Trong 4 chuyển vị NST trên, thì t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), inv(16)(p13;q22) thuộc nhóm tiên lượng tốt, và t(9;11)(p21-22;q23) hay không có chuyển vị NST thuộc nhóm tiên lượng trung bình. Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, khảo sát 162 bệnh nhân (BN) BCCDT mới chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi phát hiện 19 BN biểu hiện AML1/ETO (11,7%), 11 BN biểu hiện PML/RARA (6,8%), 7 BN biểu hiện CBFB/MYH11 (4,3%), và 4 BN biểu hiện MLL/AF9 (2,5%) (Bảng 4). Trong nghiên cứu này, chỉ với kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi đã phát hiện được 41 bệnh nhân có mang 4 kiểu tổ hợp gen thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,3% giúp phân nhóm tiên lượng được bệnh nhân BCCDT. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11) chiếm tỉ lệ 22,8%, tỉ lệ này tương đương với nghiên cứu của United Kingdom Medical Research Council (MRC-10). Nhóm còn lại chiếm tỉ lệ 77,2% có biểu hiện MLL/AF9 hay không biểu hiện tổ hợp gen nào trong số 4 tổ hợp gen khảo sát, tuy nhiên chúng ta chưa thể loại trừ bất thường nhiễm sắc thể (NST) khác nên không xếp vào nhóm tiên lượng trung bình được. Điều đó cho chúng ta thấy được vai trò quan trọng của NST đồ trong phân nhóm tiên lượng BCCDT, các kỹ thuật di truyền phân tử hiện đại như FISH hoặc RT-PCR cũng chỉ hỗ trợ chứ không thể thay thế hoàn toàn NST đồ. Tuy nhiên, kỹ thuật RT-PCR có nhiều ưu điểm trong việc khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp của BCCDT, trong thời gian ngắn nhất (trong vòng 24 giờ), có ý nghĩa tiên lượng cũng như định hướng điều trị. Tiêu biểu như phát hiện t(15;17) và tổ hợp gen PML/RARA đóng góp rất lớn trong việc quyết định điều trị bằng ATRA; cũng như là cơ sở cho chẩn đoán, theo dõi điều trị và tiên lượng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có mối liên quan giữa chẩn đoán tủy đồ và tổ hợp gen (P < 0,0001 - Bảng 5), cụ thể liên quan có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) giữa chẩn đoán BCCDT thể M2 và gen AML1/ETO (Bảng 6), thể M2 và gen PML/RARA (Bảng 7), thể M3 và gen PML/RARA (Bảng 8). Nói cách khác, tổ hợp gen PML/RARA thường gặp ở BCCDT thể M3 và không gặp ở BCCDT thể M2 cũng như các thể khác; trong khi đó tổ hợp gen AML1/ETO thường gặp ở BCCDT thể M2. Điều này góp phần cho hướng chẩn đoán chính xác các thể bệnh BCCDT. Gần đây, có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng do sự xuất hiện những đột biến gen hoặc những thay đổi về biểu hiện của một gen nào đó đã ảnh hưởng trực tiếp đến tiên lượng của bệnh nhân. Điều này được ghi nhận trên cả bệnh nhân BCCDT người lớn lẫn trẻ em(9,12). Có mối tương quan giữa kiểu gen được quy định bởi các đột biến trên với dự hậu điều trị hay nguy cơ tái phát ở BN được chẩn đoán BCCDT có kết quả di truyền học bình thường. Trong tương lai, ngoài các kỹ thuật NST đồ, FISH và RT-PCR đã thiết lập điều kiện và ứng dụng thành công vào chẩn đoán các bất thường NST, chúng ta cần triển khai khảo sát các đột biến gen trên để phân nhóm tiên lượng chính xác hơn nữa cho nhóm bệnh nhân có NST đồ bình thường hoặc những bệnh nhân cấy NST không mọc. Đồng thời, cũng cần triển khai RQ-PCR để định lượng số bản sao của những tổ hợp gen để theo dõi đáp ứng chính xác hơn trong quá trình điều trị. Đó là một công việc lớn cần nhiều thời gian và kinh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 502 phí vì liên quan đến nhiều gen và nhiều tổ hợp gen. Đây là nghiên cứu đầu tiên khảo sát bộ 4 tổ hợp gen AML1/ETO, PML/RARA, CBFB/MYH11, MLL/AF9 trên người Việt Nam. Chúng tôi đã chuẩn hóa thành công và đang sử dụng các kỹ thuật trên một cách thường quy trong khảo sát những bất thường NST và gen cho những bệnh nhân BCCDT tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh. KẾT LUẬN Kỹ thuật RT-PCR phát hiện 4 tổ hợp gen thường gặp trong BCCDT một cách nhanh chóng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, góp phần cho hướng chẩn đoán chính xác các thể bệnh BCCDT, giúp phân nhóm tiên lượng chính xác góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị. Kỹ thuật đơn giản nên có thể dễ dàng triển khai trong những phòng xét nghiệm sinh học phân tử của chuyên ngành Huyết học. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Asou H, Tashiro S, Hamamoto K, et al. (1991). Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21 chromosome translocation. Blood, 77 (9): 2031-2036. 2. Borrow J, Goddard AD, Sheer D, et al. (1990). Molecular analysis of acute promyelocytic leukemia breakpoint cluster region on chromosome 17. Science, 249 (4976): 1577-1656. 3. Cavazzini F, Bardi A, Tammiso E, et al. (2006). Validation of an interphase fluorescence in situ hybridization approach for the detection of MLL gene rearrangements and of the MLL/AF9 fusion in acute myeloid leukemia. Haematologica, 91 (3): 381- 385. 4. Claxton DF, Liu P, Hsu HB, et al. (1994). Detection of fusion transcripts generated by the inversion 16 chromosome in acute myelogenous leukemia. Blood, 83 (7): 1750-1755. 5. de Thé H, Chomienne C (1990). The t(15;17) translocation of acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor α gene to a novel transcribed locus. Nature, 347: 558-561. 6. Lemons RS, Eilander D (1990). Cloning and characterization of the t(15;17) translocation breakpoint region in acute promyelocytic leukemia. Genes Chromosome Cancer, 2: 79-87. 7. Liu PP, Tarle SA, Hajra A (1993). Fusion between transcription factor CBFβ/PEBP2β and a myosin heavy chain in acute myeloid leukemia. Science, 261: 1041-1044. 8. Longo L, Pandolfi PP (1990). Rearrangements and aberrant expression of the RARa gene in acute promyelocytic leukemias. J Exp Med, 172: 1571-1575. 9. Mrozek K, Marcucci G, Paschka P, et al. (2007). Clinical relevance of mutations and gene-expression changes in adult acute myeloid leukemia with normal cytogenetics: are we ready for a prognostically prioritized molecular classification? Blood, 109 (2): 431-478. 10. Muller CI, Trepel M, Kunzmann R, et al. (2004). Hematologic and molecular spontaneous remission following sepsis in acute monoblastic leukemia with translocation (9;11): a case report and review of the literature. Eur J Haematol, 73 (1): 62-67. 11. Raimondi CS (2006). Cytogenetics of acute leukemias. In: PUI (Eds.). Childhood Leukemias, 2nd edition: 235-237. Cambrigde University Press, UK. 12. Shimada A, Taki T, Tabuchi K, et al. (2008). Tandem duplications of MLL and FLT3 are correlated with poor prognoses in pediatric acute myeloid leukemia: a study of the Japanese childhood AML Cooperative Study Group. Pediatr Blood Cancer, 50 (2): 264-272. 13. Shurtleff SA, Meyers S, Hiebert SW, et al. (1995). Heterogeneity in CBF beta/MYH11 fusion messages encoded by the inv(16)(p13q22) and the t(16;16)(p13;q22) in acute myelogenous leukemia. Blood, 85 (12): 3695-4397. 14. Strissel PL, Strick R, Tomek RJ, et al. (2000). DNA structural properties of AF9 are similar to MLL and could act as recombination hot spots resulting in MLL/AF9 translocations and leukemogenesis. Hum Mol Genet, 9 (11): 1671-1679. 15. Tighe JE, Calabi F (1994). Alternative, out-of-frame runt/MTG8 transcripts are encoded by the derivative (8) chromosome in the t(8;21) of acute myeloid leukemia M2. Blood, 84 (7): 2115-2135. 16. Tighe JE, Daga A, Calabi F (1993). Translocation breakpoints are clustered on both chromosome 8 and chromosome 21 in the t(8;21) of acute myeloid leukemia. Blood, 81 (3): 592-597. 17. van de Locht L. T., Smetsers T. F., Wittebol S., et al. (1994). Molecular diversity in AML1/ETO fusion transcripts in patients with t(8;21) positive acute myeloid leukaemia. Leukemia, 8 (10): 1780-1783. 18. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. (1999). Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia, 13 (12): 1901-1928. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 503 KHẢO SÁT SỰ MẤT ĐOẠN 13q14 VÀ 17p13 TRÊN BỆNH NHÂN BẠCH CẦU MẠN DÒNG LYMPHÔ Trần Thị Trúc Thanh*, Lê Nguyễn Kim Dung*, Phan Thị Xinh** TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát sự mất đoạn nhiễm sắc thể (NST) 13q14 và 17p13 trên bệnh nhân bệnh bạch cầu mạn dòng lymphô (BCMDL). Phương pháp: Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) được sử dụng để phát hiện những bất thường NST này. Kết quả: Trong 5 ca được khảo sát, chúng tôi phát hiện 3 ca có sự mất đoạn 13q14 và 1 ca có sự mất đoạn 17p13. Trong đó 1 ca vừa có mất đoạn 13q14, vừa có mất đoạn 17p13. Kết luận: Kỹ thuật FISH thực hiện trên những tế bào bạch cầu ở kỳ trung gian có khả năng phát hiện sự mất đoạn NST 13q14 và 17p13 một cách chính xác và nhanh chóng so với kỹ thuật phân tích NST đồ. Đây là một trong những yếu tố tiên lượng quan trọng giúp dự đoán thời gian diễn tiến bệnh và thời gian sống toàn bộ ở bệnh BCMDL. Từ khóa: Bạch cầu mạn dòng lymphô, mất đoạn 13q14, mất đoạn 17p13. ABSTRACT DETERMINING THE DELETION OF 13q14 AND 17p13 IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA Tran Thi Truc Thanh, Le Nguyen Kim Dung, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 503 - 506 Objective: To detect the deletion of 13q14 and 17p13 in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL). Methods: Florescence in situ hybridiztion (FISH) technique was used to identify these chromosomal abnormalities. Results: There are 5 cases which were examined. The deletion in chromosome band 13q14 was detected in 3 of 5 cases. There is 1 case which has the deletion of both 13q14 and 17p13. Conclusion: In comparision with metaphase karyotyping, the interphase FISH can detect the deletion in chromosome band 13q14 and 17p13 more accurately and quickly. These chromosomal abnormalities are significant prognostic factors which are useful for predicting time to progression and overall survival in CLL. Keywords: chronic lymphocytic leukemia (CLL), deletion of 13q14, deletion of 17p13. ĐẶT VẤN ĐỀ BCMDL đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ những tế bào lymphô trong máu, tủy xương, hạch bạch huyết, và lách. Bệnh thường gặp ở những bệnh nhân (BN) có độ tuổi trung bình là 65, chỉ có 10 - 15% BN dưới 50 tuổi(7). Diễn biến lâm sàng của bệnh BCMDL rất đa dạng. Có những BN tử vong chỉ vài tháng sau chẩn đoán, trái lại có bệnh nhân sống đến 20 năm hoặc hơn(2,7). Cho đến nay, hệ thống của Rai và Binet vẫn được sử dụng như những phương pháp * Bệnh viện truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932728115 Email: phanthixinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 504 hữu dụng cho việc phân chia giai đoạn lâm sàng để tiên đoán thời gian sống của những BN BCMDL(1,6). Tuy nhiên, đối với hầu hết BN lần đầu được chẩn đoán bệnh, những hệ thống này không thể tiên đoán được nguy cơ tiến triển bệnh cũng như thời gian sống trên từng cá nhân ở giai đoạn sớm của bệnh (giai đoạn A của hệ thống Binet hoặc giai đoạn 0 đến 2 của hệ thống Rai)(2). Và việc xác định những bất thường về NST đã giúp khắc phục hạn chế của hai hệ thống trên. Những bất thường NST được xem là những yếu tố tiên lượng độc lập quan trọng và là chỉ điểm cho việc lựa chọn các chiến lược điều trị(4). Sự mất đoạn NST 6q21, 11q22-23, 13q14, 17p13; 3 NST số 3, 8, 12; và những chuyển đoạn liên quan đến NST 14q32 là những bất thường thường gặp và có ý nghĩa tiên lượng trong bệnh BCMDL(2,3,5,8). Những bất thường di truyền tế bào này có thể được phát hiện bằng kỹ thuật phân tích NST đồ hoặc bằng kỹ thuật FISH. Tuy nhiên, do khả năng phân bào của những tế bào BCMDL rất kém nên dòng tế bào bất thường chỉ được phát hiện trên 40% đến 50% tổng số ca BCMDL khi sử dụng kỹ thuật phân tích NST đồ(5). Vì vậy, kỹ thuật FISH với những đoạn dò được thiết kế đặc hiệu, và không đòi hỏi phải thu nhận được tế bào phân chia có khả năng phát hiện những bất thường NST đến 80% tổng số ca BCMDL(5) một cách nhanh chóng, chính xác đang ngày càng được sử dụng rộng rãi. Trong số những bất thường NST thường gặp trên thì mất đoạn NST 13q và 17p có ý nghĩa tiên lượng đặc biệt nhất. Theo nghiên cứu của Döhner Hartmut và cộng sự (2000) trên 325 BN BCMDT, mất đoạn NST 13q chiếm tỉ lệ cao nhất đến 55%, còn mất đoạn 17p chiếm 7%(2). Những BN có bất thường 13q được xếp vào nhóm có tiên lượng tốt với thời gian sống trung bình, và thời gian sống trung bình không điều trị dài nhất tương ứng là 133 tháng và 92 tháng. Trái lại, những BN có mất đoạn 17p lại có tiên lượng kém nhất so với những BN có mang bất thường NST khác với thời gian sống trung bình và thời gian sống trung bình không điều trị tương ứng là 32 tháng và 9 tháng(2). Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật FISH tập trung khảo sát hai bất thường này nhằm hỗ trợ việc phân nhóm tiên lượng sớm và chính xác ở giai đoạn chẩn đoán qua đó giúp lựa chọn phát đồ điều trị phù hợp. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu 13qter 13q14 CA 13qter control B Hình 1: Cấu trúc các đoạn dò và kết quả FISH khảo sát trên tế bào không phân chia. Đoạn dò tại vùng 13q14 trải dài 220kb gắn chất phát huỳnh quang màu đỏ, trong khi đó đoạn dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm ở vùng đầu tận (13qter) dùng để kiểm tra sự hiện diện NST 13 (A). Để phát hiện mất đoạn 17p13, đoạn dò phát huỳnh quang màu đỏ dài 330 kb phủ toàn bộ gen p53 được thiết kế, còn đoạn dò để kiểm tra sự hiện diện NST 17 gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm ở vùng tâm động NST 17 (B). Bình thường sẽ quan sát được 2 tín hiệu màu xanh và 2 tín hiệu màu đỏ trên 1 tế bào. Trong trường hợp mất đoạn 13q14 xảy ra, chúng ta chỉ quan sát được 1 tín hiệu màu đỏ và 2 tín hiệu màu xanh trên 1 tế bào (C). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 505 - 2 mL tủy xương được thu nhận từ 5 BN BCMDL tại Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) Thành phố Hồ Chí Minh. - Đoạn dò Poseidon™ DLEU (13q14) & 13qter Control probe – KBI-10102 (hãng Kreatech) dùng để khảo sát sự mất đoạn 13q14 (hình 1A). - Đoạn dò Poseidon™ p53 (17p13) & SE17 Control probe – KBI-10112 (hãng Kreatech) dùng để khảo sát sự mất đoạn 17p13 (hình 1B). Phương pháp nghiên cứu - Tiến hành thu nhận tế bào bạch cầu từ mẫu tủy xương bằng phương pháp thu hoạch trực tiếp, cố định tế bào trên lam. - Biến tính và lai hóa với đoạn dò đặc hiệu. Bước này được thực hiện trên máy ThermoBrite của hãng Abbott. Ủ ở 37oC trong 16 đến 18 giờ. - Rửa để loại bỏ những mẫu dò không bắt cặp đặc hiệu bằng dung dịch 4 x SSC / 0,3% NP- 40, và dung dịch 4 x SSC / 0,1% NP-40. - Đọc kết quả trên 200 tế bào để tìm bất thường dưới kính hiển vi huỳnh quang. KẾT QUẢ Về mặt kỹ thuật, chúng tôi đã chuẩn hóa được kỹ thuật FISH với nhiệt độ và thời gian biến tính tối ưu là 77oC trong 6 phút. Kết quả của 5 BN được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Kết quả FISH của 5 BN BCMDL Giới tính Tỉ lệ% tế bào dương tính (%) STT Năm sinh Nam Nữ Mất đoạn 13q14 Mất đoạn 17p13 1 1940 X 18 0 2 1926 X 51,5 0 3 1939 X 0 0 4 1960 X - 0 5 1953 X 7 9,5 Trong 5 BN BCMDL được phân tích, chúng tôi nhận thấy đa số là nam. Trong đó BN có độ tuổi cao nhất là 85 tuổi, và thấp nhất là 51 tuổi. Kết quả khảo sát cho thấy trong 4 BN được khảo sát sự mất đoạn 13q14 thì có đến 3 BN cho kết quả dương tính (hình 1C); và chỉ có 1 BN có mất đoạn 17p13 trong 5 BN được khảo sát. Trong đó, 1 BN có mất đoạn NST 17p13 đồng thời có mất đoạn NST 13q14. Chỉ có 1 BN không tìm thấy mất đoạn NST 13q14 và 17p13. BÀN LUẬN Từ năm 2006 kỹ thuật FISH đã trở thành xét nghiệm thường quy tại BVTMHH Thành phố Hồ Chí Minh. Cho đến nay, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật FISH để khảo sát trên 20 bất thường NST thường gặp trong các thể bệnh ung thư máu, trong đó có những đoạn dò có khả năng phát hiện những bất thường NST thường gặp trên bệnh BCMDL như 13q14, 17p13, 11q23, 3q26, 8q24, và t(14;18). Trong thời gian gần đây, chúng tôi bắt đầu triển khai khảo sát mất đoạn 13q và 17p thường quy trên BN BCMDL tại BVTMHH. Tuy chỉ có 5 BN được khảo sát, nhưng kết quả cho thấy sự mất đoạn 13q rất thường gặp (3 trong 4 BN), kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trên thế giới là mất đoạn 13q chiếm tỉ lệ cao nhất trong số những bất thường NST thường gặp ở bệnh BCMDL(2). Với kỹ thuật FISH, chúng tôi có thể phát hiện được 14 tế bào bất thường trong 200 tế bào (7%) giúp hạn chế bỏ sót những dòng tế bào bất thường so với kỹ thuật NST đồ kinh điển (chỉ phân tích 20-30 tế bào phân chia). Đây là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, và với trang thiết bị sẵn có chúng tôi có thể khảo sát tất cả những bất thường di truyền trên bệnh BCMDL, giúp phân nhóm tiên lượng và lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho BN BCMDL. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Binet JL, Auquier A, Dighiero G, et al. (1981). A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer, 48: 198-206. 2. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. (2000). Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 343: 1910-1915. 3. Döhner H, Stilgenbauer S, Döhner K, Bentz M, Lichter P. (1999). Chromosome aberrations in B-cell chronic lymphocytic leukemia: reassessment based on molecular cytogenetic analysis. J Mol Med, 77: 266-346. 4. Juliusson G, Merup M. (1998). Cytogenetics in chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol, 25: 19-26. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 506 5. Juliusson G, Oscier DG, Fitchett M, et al. (1990). Prognostic subgroups in B-cell chronic lymphocytic leukemia defined by specific chromosomal abnormalities. N Engl J Med, 323: 720-723. 6. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, et al. (1975). Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 46: 219-252. 7. Rozman C, Montserrat E. (1995). Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med, 333: 1052-1058. 8. Zenz T, Dohner H, Stilgenbauer S (2007). Genetics and risk- stratified approach to therapy in chronic lymphocytic leukemia. Best Pract Res Clin Haematol, 20: 439-491.