Xác định 4 tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 trong bạch cầu cấp dòng lymphô tại bệnh viện truyền máu huyết học thành phố Hồ Chí Minh

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 493 XÁC ĐỊNH 4 TỔ HỢP GEN TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 TRONG BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHÔ TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP. HỒ CHÍ MINH Phan Nguyễn Thanh Vân* Nguyễn Tấn Bỉnh* Nguyễn Thị Kim Định* Phan Thị Xinh** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định 4 tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 trong bạch cầu cấp dòng lymphô (BCCDL). Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. Sử dụng phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược với mồi thiết kế có thể phát hiện được tất cả các kiểu bản sao của mỗi tổ hợp gen. Nghiên cứu được tiến hành trên bệnh nhân BCCDL tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7 năm 2011. Kết quả: 17 BN biểu hiện TEL/AML1(9,5%), 16 BN biểu hiện BCR/ABL (8,9%), 5 BN biểu hiện MLL/AF4 (2,8%), và 8 BN biểu hiện E2A/PBX1 (4,5%), trong số 179 BN BCCDL. Kết luận: Kỹ thuật RT-PCR đơn giản, có độ nhạy cao nên được triển khai tại các cơ sở chuyên khoa Huyết học tại Việt Nam để giúp phát hiện nhanh các chuyển vị NST thường gặp không những trong BCCDL mà còn trong các bệnh lý máu ác tính khác. Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng lymphô (BCCDL), Phản ứng khuếch đại gen phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction). ABSTRACT DETECTION OF 4 FUSION GENES TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA PATIENTS AT BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HO CHI MINH CITY Phan Nguyen Thanh Van, Nguyen Tan Binh, Nguyen Thi Kim Dinh, Phan Thi Xinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 493 - 497 Objective: To detect 4 fusion genes TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 in Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) patients. Method: Case series - descriptive research. Using RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) with primer sets that can amplify all possible transcripts of each fusion gene. From March 01, 2010 to July 31, 2011, we analysed Acute Lymphoblastic Leukemia patients at Blood Transfusion Hematology Hospital. Results: 17 patients expressing TEL/AML1(9.5%), 16 patients expressing BCR/ABL (8.9%), 5 patients expressing MLL/AF4 (2.8%), và 8 patients expressing E2A/PBX1 (4.5%) among 179 newly diagnosed patients with ALL. Conclusion: RT-PCR is simple and highly sensitive technique that should apply to detect the frequent chromosome translocations not only in ALL but also in other hematologic malignancies in hematology centers in * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. BS. Phan Nguyễn Thanh Vân ĐT: 0919 691 770 Email: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 494 Vietnam. Keywords: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL), Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT- PCR). ĐẶT VẤN ĐỀ BCCDL là một rối loạn ác tính của tế bào đầu dòng lymphô B và T, đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong tủy xương gây ra suy giảm các dòng tế bào máu bình thường. Cũng giống như các bệnh máu ác tính khác, khảo sát những bất thường NST và gen tại thời điểm chẩn đoán rất quan trọng cho phân nhóm tiên lượng, giúp lựa chọn phác đồ điều trị thích hợp và là dấu ấn để theo dõi tồn lưu tế bào ác tính trong quá trình điều trị BCCDL(5). Một số chuyển vị NST tạo ra những tổ hợp gen đặc trưng trong bệnh BCCDL như t(9;22) tạo ra tổ hợp gen BCR/ABL; t(1;19), t(4;11), t(12;21) tạo ra tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4 và TEL/AML1 tương ứng. Từ đầu năm 2010 đến nay, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. HCM đã sử dụng phương pháp RT-PCR để khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp là TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1 trong BCCDL ngay lúc chẩn đoán. Với phương pháp này, kết quả sẽ được xác định trong vòng 1 tuần góp phần phân nhóm tiên lượng vào ngày thứ 8 của phác đồ điều trị, giúp lựa chọn hướng điều trị phù hợp cho từng bệnh nhân. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả loạt ca. Đối tượng Nghiên cứu được tiến hành trên 179 bệnh nhân BCCDL tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM từ ngày 01 tháng 03 năm 2010 đến 31 tháng 7 năm 2011. Bệnh nhân mới được chẩn đoán xác định bệnh bạch cầu cấp dòng lympho, dựa vào huyết đồ, tủy đồ và dấu ấn miễn dịch tế bào. Phương pháp Toàn bộ RNA được ly trích bằng cách sử dụng Sepazol-I (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản) theo qui trình kỹ thuật do công ty cung cấp. Sau khi ly trích RNA, cDNA được tổng hợp bằng cách sử dụng kít iScript cDNA synthesis (Công ty Biorad, Mỹ), tuân thủ qui trình kỹ thuật của công ty. Thành phần phản ứng PCR gồm có 1 μL cDNA được trộn với 0,1 μL (0,5 U) iTaq Polymerase (Biorad), 1 μL (10 pmol) cặp mồi xuôi và ngược trong 20 μL hỗn hợp. Để khuếch đại bộ 4 tổ hợp gen TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF4, E2A/PBX1, 4 cặp mồi cho mỗi tổ hợp gen được sử dụng. Riêng đối với những tổ hợp gen cần được khảo sát qua hai giai đoạn thì phản ứng PCR lần thứ hai sử dụng 1 μL sản phẩm của phản ứng PCR lần thứ nhất làm mạch khuôn. Nhiệt độ bắt cặp và thời gian phản ứng có thể thay đổi tùy theo từng loại tổ hợp gen, cặp mồi, tùy theo từng trường hợp cụ thể. Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng máy luân nhiệt iCycler (Công ty Biorad). Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên thạch 2% chứa 0,5 μg/mL ethidium bromide trong 0,5 x TBE, quan sát bằng hệ thống Gel Doc EQ (Công ty Biorad). Kết quả dương tính nếu như biểu hiện kích thước băng tương ứng các cặp mồi được mô tả trong bảng 1(7). Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excell và Medicalc. Bảng 1: Danh sách các sản phẩm tương ứng của 4 tổ hợp gen trong BCCDL STT Tên mồi Trình tự nucleotide Tên gen và kích thước sản phẩm 1 7700-F 5’ GAT GCT GAC CAA CTC GTG TGT G 3’ 2 7700-R 5’ TGG CCA CAA AAT CAT ACA GTG C 3’ Major BCR/ABL (7700) Type b2a2: 212 bp Type b3a2: 278 bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 495 STT Tên mồi Trình tự nucleotide Tên gen và kích thước sản phẩm 3 MB-A 1stF 5' CAA GGC TAC GGA GAG GC 3' 4 MB-A 1stR 5' ATG GTA CCA GGA GTG TTT CTC 3' Major BCR/ABL Type b2a2: 592 bp Type b3a2: 667 bp 5 MB-A 2ndF 5' GGA GCT GCA GAT GCT GAC C 3' 6 MB-A 2ndR 5' TTC CTT GGA GTT CCA ACG AGC 3' Major BCR/ABL Type b2a2: 154 bp Type b3a2: 229 bp 7 mB-A 2ndF 5' CAG TGC CAT AAG CGG CAC C 3' 8 mB-A 2ndR 5' TTC CTT GGA GTT CCA ACG AGC 3' Minor BCR/ABL 198 bp 9 TEL-C 5' AAG CCC ATC AAC CTC TCT CAT C 3' 10 AML1-D 5' TGG AAG GCG GCG TGA AGC 3' TEL/AML1 TEL exon 5/ AML1 exon 3: 298 bp và 259 bp 11 AF4-D 5' CGT TCC TTG CTG AGA ATT TG 3' 12 MLL-E5 5' AAG CCC GTC GAG GAA AAG 3' MLL/AF4 Type exon 8/ exon 7: 270 bp Type exon 8/ exon 4: 439 bp (hiếm gặp) Type exon 9/ exon 5: 468 bp Type exon 9/ exon 4: 513 bp (hiếm gặp) Type exon 10/ exon 6: 513 bp (hiếm gặp) Type exon 10/ exon 5: 600 bp Type exon 10/ exon 4: 645 bp 13 E2A-A 5' CAC CAG CCT CAT GCA CAA C 3' 14 PBX1-B 5' TCG CAG GAG ATT CAT CAC G 3' E2A/PBX1 E2A exon 13/ PBX1 exon 2: 372 bp KẾT QUẢ Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, 179 bệnh nhân BCCDL đã được chọn vào nhóm nghiên cứu, để xác định 4 tổ hợp gen nêu trên. Tuổi trung vị là 8 tuổi, giá trị bách phân thứ 25 (25%) là 4 và giá trị bách phân thứ 75 (75%) là 15,5. Trong đó, tuổi trung vị của giới nam là 6, của giới nữ là 9. Sự phân bố tuổi được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2. Sự phân phối nhóm bệnh BCCDL theo tuổi Nhóm tuổi Số lượng Tỉ lệ% Từ 1 đến dưới 5 tuổi 47 26,3% Từ 5 đến dưới 10 tuổi 57 31,8% Từ 10 đến dưới 15 tuổi 30 16,8% Từ 15 tuổi trở lên 45 25,1% Tổng số 179 100,0% Tỉ lệ nam (55,9%) cao hơn nữ (44,1%). Chẩn đoán tủy đồ gồm 2 nhóm chính: L1 (2,2%) và L2 (97,8%); trong khi đó, sự phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung ở dòng lymphô B (81,6%), bao gồm các thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B và B (Bảng 3). Bảng 3: Sự phân phối nhóm bệnh BCCDL theo chẩn đoán dấu ấn miễn dịch tế bào Dấu ấn miễn dịch tế bào Số lượng Tỉ lệ% Dấu ấn miễn dịch tế bào Số lượng Tỉ lệ% Precursor B 9 5,0% Pro B 6 3,4% Common B 8 4,5% B 123 68,7% T 33 18,4% Tổng số 179 100,0% Kết quả xác định gen được mô tả trong bảng 4. Trong đó, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm còn lại chiếm tỉ lệ khá cao 90,5%. Bảng 4: Kết quả 4 tổ hợp gen trong BCCDL Loại gen Số lượng Tỉ lệ% TEL/AML1 17 9,5% BCR/ABL 16 8,9% MLL/AF4 5 2,8% E2A/PBX1 8 4,5% Không phát hiện bất thường gen 133 74,3% Tổng số 179 100,0% Hình thái học tế bào không có liên quan với tổ hợp gen (Bảng 5), trong khi dấu ấn miễn dịch tế bào liên quan với tổ hợp gen có ý nghĩa thống kê với P = 0,0248 (Bảng 6). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 496 Bảng 5: Phân phối nhóm bệnh BCCDL theo chẩn đoán tủy đồ và tổ hợp gen (P = 0,3164) Chẩn đoán tủy đồ Tổng số Loại gen L1 L2 TEL/AML1 0 17 17 (9,5%) BCR/ABL 0 16 16 (8,9%) MLL/AF4 0 5 5 (2,8%) E2A/PBX1 1 7 8 (4,5%) Không phát hiện bất thường gen 3 130 133 (74,3%) Tổng số 4 (2,2%) 175 (97,8%) 179 Bảng 6: Phân phối nhóm bệnh BCCDL theo chẩn đoán dấu ấn miễn dịch tế bào và tổ hợp gen (P = 0,0248) Dấu ấn miễn dịch tế bào Loại gen Dòng B Dòng T Tổng số TEL/AML1 17 0 17 (9,5%) BCR/ABL 15 1 16 (8,9%) MLL/AF4 5 0 5 (2,8%) E2A/PBX1 8 0 8 (4,5%) Không phát hiện bất thường gen 101 32 133 (74,3%) Tổng số 146 (81,6%) 33 (18,4%) 179 BÀN LUẬN Chẩn đoán tủy đồ gồm 2 nhóm chính: L1 (2,2%) và L2 (97,8%); khác với nghiên cứu của tác giả C.H.Pui(4) có tỉ lệ L1 cao nhất. Có sự khác biệt trên có thể do phân loại hình thái học theo FAB thường dựa vào sự chủ quan của người đọc tủy đồ và do không có một tiêu chuẩn rõ ràng để phân biệt L1 và L2. Song phân biệt L1 và L2 không có ý nghĩa nhiều trong việc tiên lượng cũng như điều trị. Với L3, tế bào gần giống như tế bào lymphôm Burkitt và thường là tế bào B trưởng thành thì trong nghiên cứu của chúng tôi loại bỏ vì không đưa vào nhóm nghiên cứu. Trong nghiên cứu của chúng tôi, không có mối liên quan giữa hình thái tế bào và các đột biến NST, điều này phù hợp với kết quả của tác giả C.H.Pui và cộng sự(4). Trong khi đó, sự phân bố dòng tế bào theo dấu ấn miễn dịch tế bào tập trung ở dòng lymphô B (81,6%), bao gồm các thể BCCDL Precursor B, Pro B, common B và B (Bảng 3). Dấu ấn miễn dịch tế bào là một trong những yếu tố tiên lượng độc lập cũng là một trong những tiêu chuẩn để phân nhóm nguy cơ. Tỷ lệ bệnh nhân có dấu ấn miễn dịch tế bào là dòng B chiếm tỷ lệ cao nhất và tỷ lệ này tương tự so với kết quả của tác giả C.H.Pui(4). Khi khảo sát mối tương quan giữa dấu ấn miễn dịch tế bào và bất thường gen đặc trưng, chúng tôi nhận thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P = 0,0248 (Bảng 6). Điều này phù hợp với y văn do các đột biến khác gặp trong tế bào dòng lymphô T vẫn chưa được khảo sát nên có thể nhầm lẫn trong nhóm có NST bình thường. Đối với BCCDL, những bất thường NST lúc chẩn đoán có ý nghĩa tiên lượng rất rõ ràng. Có 4 kiểu chuyển vị NST thường gặp trong BCCDL là t(12;21), t(9;22), t(4;11), t(1;19) tạo ra 4 kiểu tổ hợp gen là TEL/AML1, BCR/ABL, MLL/AF9 và E2A/PBX1 tương ứng. Trong 4 chuyển vị NST trên, thì t(12;21) thuộc nhóm tiên lượng tốt và 3 kiểu chuyển vị NST còn lại thuộc nhóm tiên lượng không tốt. Bốn kiểu bất thường trên chiếm từ 30% đến 40% trong BCCDL ở trẻ em, vì thế chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR để khảo sát bộ 4 tổ hợp gen trong tất cả những bệnh nhân mới chẩn đoán. Từ 01/03/2010 đến 31/07/2011, khảo sát 179 bệnh nhân (BN) BCCDL mới chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR, chúng tôi phát hiện 17 BN biểu hiện TEL/AML1 (9,5%), 16 BN biểu hiện BCR/ABL (8,9%), 5 BN biểu hiện MLL/AF4 (2,8%), và 8 BN biểu hiện E2A/PBX1 (4,5%), trong số 179 BN BCCDL. Tỉ lệ của 3 tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL tương đương với các nghiên cứu khác. Tuy nhiên, tỉ lệ TEL/AML1 9,5% khá thấp so với các nghiên cứu khác(1,2,3,6). Trong nghiên cứu này, chỉ với kỹ thuật RT- PCR, chúng tôi đã phát hiện được 46 bệnh nhân Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 497 có mang 4 kiểu tổ hợp gen thường gặp trên, chiếm tỷ lệ 25,7% giúp phân nhóm tiên lượng được bệnh nhân BCCDL. Căn cứ vào kết quả xác định gen được mô tả trong bảng 4, nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%, nhóm còn lại chiếm tỉ lệ khá cao 90,5%. Tuy nhiên, nhóm này không thể được xếp loại là nhóm tiên lượng không tốt vì chúng ta chưa loại trừ được các trường hợp đa bội trong nhóm này. Kỹ thuật RT-PCR có nhiều ưu điểm trong việc khảo sát bộ 4 tổ hợp gen thường gặp của BCCDL, không những nhạy hơn, phát hiện được các chuyển vị NST ở thể ẩn như t(12;21), mà còn có thể khảo sát nhiều tổ hợp gen thường gặp lúc chẩn đoán trong thời gian ngắn nhất (trong vòng 24 giờ) giúp phân nhóm tiên lượng kịp thời vào ngày thứ 8 của quá trình điều trị. Ngoài ra, RT-PCR còn thực hiện cùng lúc trên nhiều mẫu và chỉ cần một lượng nhỏ tế bào ung thư cũng đủ để khuếch đại. Tuy nhiên, với 90,5% số bệnh nhân còn lại mang những bất thường NST khác như đa bội, thiểu bội, mất đoạn, thêm đoạn hoặc chuyển vị NST khác hiếm gặp hơn thì phải cần kết quả NST đồ. Mỗi kỹ thuật có một ưu điểm riêng mà kỹ thuật khác không thể thay thế được. Kỹ thuật RT-PCR không thể được sử dụng để khảo sát riêng lẻ mà phải bổ sung với kỹ thuật NST đồ. Đây là nghiên cứu với cỡ mẫu tương đối lớn và phân tích khá đầy đủ với bộ 4 tổ hợp gen E2A/PBX1, MLL/AF4, BCR/ABL, và TEL/AML1 trên người Việt Nam. Chúng tôi đã chuẩn hóa thành công và đang sử dụng các kỹ thuật trên một cách thường quy trong khảo sát những bất thường NST và gen cho những bệnh nhân BCCDL tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh. KẾT LUẬN Nhóm bệnh BCCDL có nhóm tiên lượng tốt (TEL/AML1) chiếm tỉ lệ 9,5%. Mặc dù với số mẫu khảo sát chưa nhiều, chúng tôi cũng đã khảo sát sự liên hệ giữa hình thái học, dấu ấn miễn dịch và các đột biến NST, trong đó giữa dấu ấn miễn dịch và đột biến NST có liên hệ chặt chẽ nhất là trong chẩn đoán của nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng lympho. Kỹ thuật RT-PCR phát hiện 4 tổ hợp gen thường gặp trong BCCDL một cách nhanh chóng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp phân nhóm tiên lượng chính xác góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả điều trị. Kỹ thuật đơn giản nên có thể dễ dàng triển khai trong những phòng xét nghiệm sinh học phân tử của chuyên ngành Huyết học. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ariffin H, Chen SP, Wong HL, et al. (2003). Validation of a multiplex RT-PCR assay for screening significant oncogene fusion transcripts in children with acute lymphoblastic leukaemia. Singapore Med J, 44 (10): 517-536. 2. Elia L, Mancini M, Moleti L, et al. (2003). A multiplex reverse transcriptase-polymerase chain reaction strategy for the diagnostic molecular screening of chimeric genes: a clinical evaluation on 170 patients with acute lymphoblastic leukemia. Haematologica, 88 (3): 275-283. 3. Liang DC, Shih LY, Yang CP, et al. (2002). Multiplex RT-PCR assay for the detection of major fusion transcripts in Taiwanese children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Med Pediatr Oncol, 39 (1): 12-18. 4. Pui CH, Robison LL, Look AT (2008). Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet, 371 (9617): 1030-1072. 5. Raimondi CS (2006). Cytogenetics of acute leukemias. In: PUI (Eds.). Childhood Leukemias, 2nd edition: 235-237. Cambrigde University Press, UK. 6. Scurto P, Hsu RM, Kane JR, et al. (1998). A multiplex RT-PCR assay for the detection of chimeric transcripts encoded by the risk-stratifying translocations of pediatric acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 12 (12): 1994-2005. 7. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. (1999). Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia, 13 (12): 1901-1928.