Xác định Biofilm trong viêm Amiđan mạn tính ở trẻ em

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt 29 XÁC ĐỊNH BIOFILM TRONG VIÊM AMIĐAN MẠN TÍNH Ở TRẺ EM Nhan Trừng Sơn* Phú Quốc Việt** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ màng sinh học biofilm trong amiđan mạn tính bằng phương pháp nhuộm HE và soi qua kính hiển vi quét SEM, tìm mối tương quan giữa việc dùng kháng sinh, thời gian viêm amiđan với việc phát hiện ra biofilm. Phương pháp thực hiện: Cắt ngang mô tả trên 70 bệnh nhi có chỉ định cắt amiđan tại BV Nhi Đồng 1. Kết quả: Bằng phương pháp nhuộm HE: số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học biofilm là 38 (54,3%), không phát hiện ra biofilm là 32 (45,7%). Bằng phương pháp SEM: số bệnh nhân phát hiện ra biofilm là 30 (42,86%), không phát hiện ra biofilm là 40 (57,14%), không thấy sự liên quan giữa tổng thời gian bệnh của bệnh nhân với việc tạo màng biofilm, cũng như sự liên quan giữa việc dùng kháng sinh quá ngắn ngày, hay dài ngày với việc tạo ra biofilm của vi khuẩn. Kết luận: Phương pháp nhuộm HE và phương pháp soi bằng SEM là 2 phương pháp rất triển vọng để xác định biofilm. Phương pháp nhuộm HE là phương pháp dễ thực hiện tại cơ sở, giá thành thấp, nhưng hiệu quả trong việc xác định biofilm. Phương pháp soi bằng kính hiển vi điện tử quét đòi hỏi mẫu phải được xử lý kỹ trước khi đi soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành khá cao, nhưng đây cũng là phương tiện rất tốt để xác định biofilm. Từ khóa: Màng sinh học, viêm amiđan. ABSTRACT THE PRESENCE OF BACTERIAL BIOFILM IN CHRONIC TONSILLITIS IN CHILDREN Nhan Trung Son, Phu Quoc Viet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 1 - 2013: 29 - 33 Background: The presence of bacterial biofilms in inflamed tonsils may explain the chronicity and recurrent characteristic of tonsillitis. Objective: To assess biofilm rate in chronic tonsilitis by Hematoxyllin- Eosin (HE) staining and by Scanning Electron Microscopy (SEM), and to clarify if there are relations among using antibiotics, tonsillitis time and biofilm detection. Methods: Cross-sectional study on 70 paediatric patients undergone tonsillectomy at Children 1 Hospital. Results: Biofilms were identified in 38 patients (54.3%) by using HE method and in 30 (42.86%) patients by using SEM method. There was neither relation between tosillitis time and biofilm forming nor relation between using antibiotics (short-term (from 1to 5 days) or long-term (from 6-10 days)) and biofilm forming. Conclusion: HE and SEM are two potential methods for detecting biofilms. HE is a low-cost method, effective to detect biofilm and easy to apply at hospital. SEM is a high-cost method. It requires careful prepararion samples before scanning and transportation to SEM center. Từ khóa: Biofilm, tonsillitis. * Bộ môn Tai Mũi Họng, Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch ** Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Nhi Đồng 1 Tác giả liên lạc: Ths. Phú Quốc Việt ĐT: 0989818652 Email: bstheviet@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt 30 ĐẶT VẤN ĐỀ Amiđan là một tổ chức bạch huyết của vòng bạch huyết Waldeyer ở ngã tư đường ăn đường thở. Sự tiếp xúc thường xuyên với môi trường bên ngoài của họng là điều kiện làm cho vi khuẩn dễ tấn công vùng này. Chính vòng bạch huyết Waldeyer là một pháo đài chống lại sự tấn công này thông qua chức năng miễn dịch của nó. Viêm amiđan là một thuật ngữ được chỉ đến viêm amiđan khẩu cái. Đây là bệnh lý thường gặp trong lâm sàng các chuyên khoa Nội Nhi nói chung và chuyên khoa Tai Mũi Họng Nhi nói riêng ở Việt Nam và trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, theo niên giám thống kê của Bộ Y tế năm 2002, trong các bệnh mắc cao nhất trên toàn quốc, viêm họng và viêm amiđan cấp đứng hàng thứ 2 (251,39 trường hợp mắc trên 100.000 dân). Theo thống kê của bệnh viện Tai Mũi Họng TP. HCM năm 2007, viêm amiđan chiếm 21% trong các bệnh Tai Mũi Họng. Từ lâu, các vi khuẩn gây bệnh trong viêm amiđan mạn tính đã được xác định bởi các tác giả trong và ngoài nuớc. Việc sử dụng kháng sinh hợp lý trong các trường hợp viêm amiđan mạn tính song viêm amiđan vẫn tái đi tái lại, vì vậy chúng tôi cho rằng có khả năng vi khuẩn đã hình thành biofilm để chống lại tác dụng của kháng sinh và sự đề kháng của ký chủ. Vì vậy, chúng tôi mạnh dạn tiến hành thực hiện nghiên cứu đề tài: “Xác định biofilm trong viêm amiđan mạn tính ở trẻ em bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) và soi qua kính hiển vi điện tử quét Scanning Electron Microscope (SEM)”. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Biofilm là một tập hợp các tế bào vi sinh vật kết hợp với nhau và bám trên bề mặt Những tổ chức có biofilm thường khác so với những tổ chức tương tự trong việc giải mã gen, đề kháng kháng sinh và đề kháng hệ thống miễn dịch của con người(1,3). Chúng tôi cho rằng việc sử dụng kháng sinh lâu dài nhưng không đạt hiểu quả có khả năng do vi khuẩn kháng kháng sinh qua cơ chế tạo màng biofilm, nên chúng tôi đi sau vào việc xác định màng biofilm ở bề mặt mô amiđan. Trước đây, đã có nhiều nghiên cứu về màng biofilm trên mô amiđan: Khalid (2008) nghiên cứu trên 76 trường hợp trẻ em có độ tuổi trung bình là 5,7 tuổi bị viêm amiđan và VA thì 46 trường hợp tìm thấy biofilm của vi khuẩn bằng phương pháp soi qua kính điện tử quét (SEM) (chiếm 61%). Trong 26 bệnh nhi phải cắt amiđan và nạo VA vì tình trạng nhiễm trùng mạn tính thì có 22 trường hợp tìm thấy biofilm (85%). Richard (2008) nghiên cứu trên 19 bệnh nhân bị viêm amiđan mạn tính thì có 15 bệnh nhân có biofilm (79%). Rafael Ramirez(6) nghiên cứu trên 9 bệnh nhân với tiền sử bệnh viêm amiđan tái đi tái lại cần phải cắt amiđan, mẫu mô được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét thông thường và kính hiện vi điện tử quét phù hợp môi trường. Kết quả 8/9 bệnh nhân được phát hiện có biofilm trên bề mặt amiđan. R. R. Diaz (2010)(4) 36 bệnh nhân được chọn để cắt amiđan, tuổi từ 1 đến 6 tuổi, không bệnh nhân nào sử dụng kháng sinh quá 30 ngày trước khi cắt amiđan. Mẫu amiđan được nhuộm Hematoxylin – eosin, nhuộm gram, soi kính hiển vi huỳnh quang, và soi kín h hiển vi laser cùng tiêu điểm,có 77.28% bệnh nhân có biofilm trong amiđan(4). Galli. J(5) (2007) 10 trường hợp cắt amiđan, đây là những bệnh nhân viêm amiđan và VA mạn tính, hay viêm tái hồi nhiều lần, không còn đáp ứng với kháng sinh và kháng viêm liệu pháp. Nghiên cứu này nhằm phát hiện biofilm ở mẫu mô, mẫu mô được cấy và được soi bằng kinh hiển vi điện tử quét, kết quả cho thấy có 15/15 mẫu VA và 6/10 mẫu amiđan có thấy vi khuẩn dạng hình cầu bám trên bề mặt mô và tập trung thành từng khúm nhỏ(5). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt 31 Romain E. Kania (2007) khi ông so sánh hình ảnh thấy vi khuẩn và chất glycocalyx bằng kính hiển vi quét laser đồng tiêu điểm (CLSM) kết hợp với phương pháp nhuộm đôi để so sánh với kết quả bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) trên những mẫu mô amiđan. Kết quả có 17/24 (70,8%) trường hợp thí nghiệm cho thấy sự hiện diện màng sinh học vi khuẩn. Richard A. Chole(2) (2003) Nghiên cứu tháng 6/2003 trên 15 bệnh nhân bị viêm amiđan tái đi tái lại, kết quả có 11/15 trường hợp tìm thấy biofilm (73%) và 3/4 trường hợp amiđan quá phát có biofilm (75%) Bằng kính hiển vi điện tử Hình 1: (A) Biofilm ở amiđan (hình hoa thị) nhuộm với hematoxylin- eosin và mô viêm thâm nhiễm xung quanh (hình mũi tên), hình ảnh vật kính x400. (B) Nhìn toàn cảnh của khe hốc amiđan với biofilm (mũi tên) với nhiều nang giãn nở không có xơ hóa (hình hoa thị), xem ở vật kính x32. (C) Đáy của hốc amiđan với rất nhiều khúm vi khuẩn (hình mũi tên) và quá trình viêm mạnh mẽ, hình ảnh vật kính x100. (D) Đáy của hốc amiđan với chất á sừng (hình hoa thị) và nhiều biofilm (hình mũi tên) hình ảnh vật kính x150. Hình 2: Biofilm của mẫu amiđan quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Tiêu chuẩn chọn mẫu Tất cả các bệnh nhi từ 5 đến 15 tuổi khám tại phòng khám Tai Mũi Họng Bệnh Viện Nhi đồng I có triệu chứng viêm amiđan tái đi tái lại hơn 5 lần/ năm, từ 10-2011 đến 31-07-2012. Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân có chống chỉ định cắt amiđan. Các mẫu được xác nhận bằng giải phẫu bệnh lý không phải là viêm amiđan mạn sẽ bị loại trừ. Viêm amiđan tái đi tái lại ít hơn 5 lần/ năm. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang mô tả. Mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu được xác định phù hợp theo nghiên cứu mẫu nhỏ N = 70. N= C2 x (C =1,96 ; p = 90% ; ε = 7%) Cách tiến hành nghiên cứu Thực hiện phẫu thuật cắt amiđan. Lấy mô amiđan lưu giữ trong 2 lọ formol 10%. Một lọ gửi làm giải phẫu bệnh và tìm biofilm bằng nhuộm HE. Một lọ sau khi được xử lý khô gửi Viện công nghệ Nano, mẫu sẽ được bọc platinium sau đó được đem đi chụp biofilm bằng máy SEM. Phân tích thống kê bằng phần mềm Stata/SE 10. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm của mẫu nghiên cứu Tổng số bệnh nhân 70 bệnh nhân (21 nữ (30%), 49 nam(70%)). Tuổi trung bình 92,15 tháng ± 33 (tuổi nhỏ nhất 55 tháng, tuổi lớn nhất 184 tháng). Về nơi ở: 43 bệnh nhân ở tỉnh, 27 bệnh nhân ở thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt 32 Tổng thời gian bị viêm amiđan: 53,57 tháng ± 32,9 tháng (thời gian bị viêm amiđan ngắn nhất là 15 tháng, thời gian bị amiđan dài nhất là 144 tháng). Thời gian sử dụng kháng sinh ngắn nhất trong 1 đợt điều trị: trung bình là 2 ngày ± 1 ngày (ngắn nhất là 1 ngày, dài nhất là 5 ngày). Thời gian sử dụng kháng sinh dài nhất trong 1 đợt trong 1 đợt điều trị: trung bình là 6 ngày ± 1 ngày (ngắn nhất là 4 ngày, dài nhất là 10 ngày). Số lần viêm amiđan trung bình là: 6 lần ± 1 lần (ít nhất là 5 lần, nhiều nhất là 9 lần). Bảng 1: Độ lớn amiđan. Độ amiđan Nam Nữ Tổng số Xơ teo 0 0 0 Độ 1 5 (10,2%) 2 (9,52%) 7 (10%) Độ 2 16 (32,65%) 11 (52,38%) 27 (38,57%) Độ 3 28 (57,14% 8 (38,1%) 36 (51,43%) Độ 4 0 0 0 Tổng số 49 (100%) 21 (100%) 70 (100%) Bằng phương pháp nhuộm HE: Số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học biofilm là 38 Số bệnh nhân không phát hiện ra màng sinh học biofilm là 32. Bằng phương pháp SEM: Số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học biofilm là 30. Số bệnh nhân không phát hiện ra màng sinh học biofilm là 40. Bảng 2: Tỷ lệ phát hiện Biofilm. Phương pháp HE (+) HE (-) SEM (+) 25 (65,79%) 5 (15,63%) 30 SEM (-) 13 (34,21%) 27 (84,37%) 40 38 32 70 Nếu ta coi SEM là chuẩn vàng và đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của HE. Tính độ nhạy của HE là 83,3% (KTC 95% và độ đặc hiệu của HE là 67,5% (KTC 95% 81,4%). Tỷ lệ đồng thuận giữa 2 phương pháp. Bảng 3: Mức độ đồng thuận là để đánh giá xem HE cho kết quả giống SEM bao nhiêu phần trăm. Tỷ lệ đồng thuận Hệ số Kappa P 74,29% 0,49 0,000 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu về biofilm của vi khuẩn ở những bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Đồng 1 TPHCM bằng hai phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin và soi bằng kính hiển vi điện tử quét, chúng tôi thu nhận được một số kết quả. Từ đó, chúng tôi có một số kết luận và đề xuất sau: Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin và phương pháp soi bằng kính vi điện tử quét là 2 phương pháp rất triển vọng để xác định màng biofilm của vi khuẩn. Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin là phương pháp dễ thực hiện tại cơ sở, giá thành thấp, nhưng hiệu quả trong việc xác định màng biofilm vi khuẩn. Phương pháp soi bằng kính hiển vi điện tử quét đòi hỏi mẫu phải được xử lý kỹ trước khi đi soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành khá cao, nhưng đây cũng là phương tiện rất tốt để xác định màng biofilm của vi khuẩn, phương tiện này đã được sử dụng rất lâu trên thế giới và nay đã được chúng tôi sử dụng lần đầu tiên tại TPHCM để xác định màng biofilm của vi khuẩn. Hiện nay trên thế giới ít công trình nghiên về thời gian bệnh liên quan tới việc tạo ra biofilm, cũng như sự liên quan của việc dùng kháng sinh ngắn ngày, hay dài ngày trong việc tạo ra biofilm của vi khuẩn. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi không thấy sự liên quan giữa tổng thời gian bệnh của bệnh nhân với việc tạo màng biofilm. Chúng tôi cũng không ghi nhận được sự liên quan giữa việc dùng kháng sinh quá ngắn ngày, hay quá dài ngày trong 1 đợt điều trị viêm amiđan với việc tạo ra biofilm của vi khuẩn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Tai Mũi Họng – Mắt 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Al-Mazrou KA, Al-Khattaf AS. “Adherent biofilms in adenotonsillar diseases in children”. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2008; 134(1):20-23. 2. Chole RA, Faddis BT. “Anatomical evidence of microbial biofilms in tonsillar tissues: a possible mechanism to explain chronicity”. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003;129(6):634- 636. 3. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. “Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections”. Science. 1999;284(5418):1318-1322. 4. Diaz RR, Picciafuoco S et al. “Relevance of biofilms in pediatric tonsillar disease”. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2011; 30:1503– 1509. 5. Galli J, Calo L, Ardito F et al. “Biofilm formation by Haemophilus influenzae isolated from adeno-tonsil tissue samples, and its role in recurrent adenotonsillitis”. Acta Otorhinolaryngol Ital. 2007;27(3):134-8. 6. Ramírez-Camacho R, González-Tallón AI et al. “Environmental scanning electron microscopy for biofilm detection in tonsils”. Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(1):16-20.