Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đên tính kháng thuốc isoniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người . Hiện nay tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác định là chiếm 1/3 dân số thế giới . Có khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm . Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính . Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và đang tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng . Hiện nay, bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với đặc trưng là kháng đa thuốc. Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tìm ra được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , trong khi các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung có 5 thuốc. Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ t khó điều trị. Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao . Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc , hiện nay các cơ sở trong nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ . Thời gian chuẩn đoán lao kháng thuốc cần ít nhất 4 – 6 tuần. Với thời gian dài như vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị , khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toán bệnh lao . Khắc phục nhữ ng nhược điểm đó , việc ứng dụng sinh học phân tử đang tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc . Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày , với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu trách nhiệm . Ví dụ, nếu chỉ ra được độ t biến ở gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao đó kháng isoniazid . Xuất phát từ những lý do trên , chúng tôi tiến hành đề tài : "Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam". 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu. 2. Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu. 3. Nội dung nghiên cƣ́u - Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu . - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli. - Tách dòng gen katG. - Giải trình tự gen katG. - Phát hiện, phân tích đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình bệnh lao 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao [1]. Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [22]. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22]. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [22]. Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á. Dưới đây là ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực [22]. Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực Khu vực Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 Tử vong do lao (bao gồm cả nhiễm HIV) Các thể AFB (+) Các thể AFB (+) SL (nghìn) TL/100000 Châu Phi 2354 (26%) 1000 350 149 556 83 Châu Mỹ 370 (4%) 165 43 19 53 6 Trung Đông 622 (7%) 279 124 55 143 28 Châu Âu 472 (5%) 211 54 24 73 8 Đông nam Châu Á 2890 (33%) 1294 182 81 625 39 Tây Thái Bình Dương 2090 (24%) 939 122 55 373 22 Toàn cầu 8797 (100%) 3887 141 63 1823 29 Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được. Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của ngân hàng thế giới ở Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [22]. Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh trong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém. Trên 95% số bệnh nhân lao, 98% số chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là tuổi làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời [1, 22]. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Việt Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004). Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [1]. Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế quốc gia trọng điểm. Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 chống lao. Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4]. Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000. Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trên cả nước [4]. Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3]. Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới [1]. Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG. Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, TCYTTG và hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4]. Vì là một trong số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức này. Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [4]. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía nam là 2%, ở các tỉnh phía bắc là 1%). Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có một s ố lượng lớn người bị mắc lao mới . Số lượng người mắc lao mới được thể h iện qua bảng 1.2. Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam Số mới mắc lao (mọi thể): 130.000 Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000 Tổng số trường hợp lao: 260.000 Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000 Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới. Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 1.1.3. Tình hình lao kháng thuốc Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện nay ở mức cao chưa từng có. Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca nhiễm lao hàng năm. Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [5]. Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc. Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trình chống lao , một nguyên nhân khác hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian... Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp. Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới ở khu vực Tây Thái Bình Dương dao động trong khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu trong khu vực) [4]. Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao trên cơ sở toàn c ầu được thực hiện từ năm 1995 với mục tiêu là xác định được tổng số bệnh nhân lao kháng thuốc trên thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc lao của vi khuẩn . Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tình hình vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực trên thế giới [6]. Theo công bố này , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bình với riêng từ ng loại thuốc có khác nhau , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, trong đó kháng steptomycin ở vùng Ivanovo (Nga) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất . Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát trung bình là 9,9 % trong đó kháng 1 thuốc chiếm 6,6 %, kháng 2 thuốc chiếm 2,5 %, kháng 3 thuốc chiếm 0,6 %, kháng bốn thuốc chiếm 0,2 %, kháng đa thuốc trung bình là 1,4 %. Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hất 40,6 % ở cộng hòa Dominica , thấp nhất là 2% ở cộng hòa Séc [6]. Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau : kháng isoniazid trung bình 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %, steptomycin 2,6 %. Kháng thuốc mắc phải với steptomycin ở Cuba có tỷ lệ cao nhất 57 %. Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên toàn thế giới là 36 %, trong đó kháng 1 loại thuốc 12,2 %, 2 loại thuốc 9,7 %, 3 loại thuốc 5,4 %, 4 loại thuốc 4,4 %. Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bình là 13 %. Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất ở Latvia , có tỷ lệ 54 % [6]. Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn , đe dọa công cuộc phòng chống lao trên toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc . Trong khi các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại thường có độc tính cao và giá thành đắt [5]. Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm . Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc phải v ới isoniazid là 53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với steptomycin là 59 % [6]. Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại . Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5 % đứng thứ tư trong khảo sát của TCYTTG sau Latvia (34%), Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%). Qua các nghiên cứu đã cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân dẫn đến thấ t bại trong điều trị. Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100%. Nhưng bệnh nhân lao kháng thuốc mắc phải , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22]. Kết quả còn thấp hơn nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải, thậm chí không chữa được. Nguy hiểm hơn là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho người khác. Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong chiến lược điều trị lao hiện nay. 1.2. Vi khuẩn lao 1.2.1. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria , ngành Actinobacteria , bộ Actinomycetales , phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [18]. Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis. Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm : Mycobacterium tuberculosis gồm bốn loài có khả năng gây bệnh ở người , và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở người [6,7]. 1.2.2. Đặc điểm hình thể Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước 2 – 4 μm, rộng 0,3 – 1,5 μm. Trực khuẩn thanh mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N , Y, V hoặc thành dãy phân nhánh như cành cây . Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường do có lớp sáp ở thành tế bào [7]. 1.2.3. Khả năng gây bệnh Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế này tạo nên độc lực của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này [7]. Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose – 6,6’ – dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên những u hạt mãn tính . Miễn dịch trong bệ nh lao ngày nay được xác định là đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào . Đáp ứng miễn dịch làm chậm sự nhân lên của vi khuẩn lao , gây hạn chế sự lan tràn của vi khuẩn lao , dẫn tới phá hủy tế bào vi khuẩn . Đáp ứng miễn d ịch trong bệnh lao phát sinh một phản ứng quá muộn . Một số trường hợp vi khuẩn lao có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt trở lại bạch cầu người và tồn tại dưới dạng ngủ trong các u hạt nên cơ thể không tiêu diệt được . Đặc biệt trong các trường hợp lao kháng thuốc cơ thể không tiêu diệt được vi khuẩn và các thuốc cũng không tác động được . Đó là một vấn đề nan giả i trong điều trị bệnh lao [8]. Vi khuẩn lao có thể vào cơ thể qua nhiều đường , thường là qua đường hô hấp, bên cạnh đó là các đường tiêu hóa , da, kết mạc mắt ... Sau khi gây tổn thương tiên phát , vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu tới cơ quan khác gây tổn thương thứ phát . Nhiều cơ quan : phổi, thận, màng não , xương, hạch, da... đều có thể bị vi khuẩn lao xâm nhập , nhưng thường bị hơn cả là phổi và vị trí gặp nhiều nhất là đỉnh phổi , nơi có phân áp oxy 120 mmHg [6]. 1.2.4. Hệ gen của vi khuẩn lao Hệ gen của v i khuẩn lao đã được đọc trình tự , có chiều dài 4.411.522 cặp base trong đó có 3.924 trình tự được dự đoán là có mã hóa protein , tỷ lệ G + C chiếm đến 65,6%. Genome của vi khuẩn lao có chứa tới 90,8 % trình tự mã hóa protein và chỉ có 6 gen giả [28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 1.3. Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao và chịu trách nhiệm mã hóa cho enzyme catalase - peroxidase. Người ta nhận thấy có khoảng 95% các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid có đột biến trên gen này [28]. Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase. Enzyme này hoạt hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic-NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất enoyl-AcpM. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao. Cơ chế phân tử của tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) của gen katG mã hóa catalase-peroxidase. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase-peroxidase do đó M. tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51]. Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid. 1.4. Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Isoniazid Vi khuẩn lao kháng isoniazid được xác định theo phương pháp chẩn đoán kiểu gen. Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác định đột biến ở các gen có liên quan kháng thuốc tương ứng . Để xác định đột biến trên gen katG hiện có nhiều phương pháp , song giải trình gen vẫn là phương phá p cơ bản , chính xác , rõ ràng nhất . Tuy nhiên đây là phương pháp không phải nơi nào cũng làm được vì đòi hỏi máy móc thiết bị đắt tiền và nhân lực có trình độ để vận hành khai thác [28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Giải trình tự (DNA squencing ) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide trong phân tử DNA . Nguyên lý của phương pháp này là : Tổng hợp các mạch đơn DNA mới có độ dài ngắn hơn mạch khu ôn, nhờ kỹ thuật đánh dấu và ngắt đoạn trong quá trình tổng h ợp mạch DNA , thu được các mạch đơn hơn kém nhau một base từ đó có được sơ đồ trật tự mạch DNA khuôn mẫu. So sánh trật tự của mẫu thí nghiệm với trật tự DNA ch uẩn ta biết được vị trí các sai lệch (đột biến) [33]. Ứng dụ ng các kỹ thuật sinh học phân tử đã xác định các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có đột biến ở gen katG. Codon xảy ra đột biến là codon 315 [34]. Sự đột biến xảy ra là do thay thế nucleotid e ở codon 315 (AGC  ACC hoặc AGC  ACA) [34]. Để giải trình tự gen katG, hiện nay người ta có thể thực hiện trực tiếp từ sản phẩm PCR . Khi sản phẩm PCR là đơn nhất và có độ dài thích hợp cho việc phân tích kết quả thì có thể thực hiện giải trình tự trực tiếp . Cũng có thể giải trình tự thông qua tách dòng , gắn đoạn gen katG cần nghiên cứu vào vector. Đoạn gen cùng với vector tái tổ hợp được nhân lên trong tế bào E.coli. Khi giải trình tự gen , cả đoạn gen katG và 1 phần vector đều được xác định trình tự . Giải trình tự thông qua tách dòng được ứng dụng khi sản phẩm PCR không được tốt , đặc biệt là trong các trường hợp gây đột biến nhân tạo kiểm chứng kháng thuốc và trong nghiên cứu biểu h iện gen [6]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis được cung cấp bởi Học viện Quân y. Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao Mã DNA Mã Chủng Kháng thuốc ĐA1 TB06-22 HSRE ĐA2 TB06-23 HSRE ĐA3 TB06-26 HSRE ĐA4 TB06-27 HSR ĐA5 TB06-28 HSRE ĐA6 TB06-31 HSRE ĐA7 TB06-33 HSRE ĐA8 TB06-35 HSR ĐA9 TB06-36 HSRE ĐA10 TB06-37 HSRE ĐA11 TB06-38 HSRE ĐA12 TB06-39 HSR ĐA13 TB06-41 HSRE ĐA14 TB06-51 HSRE Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 2.2. Vật liệu thiết bị và dụng cụ nghiê n cƣ́u 2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất chính Tên hóa chất Hãng sản xuất 1. H/c dùng trong PCR Tris base Lysozyme Proteinase K Agarose Thang chuẩn DNA EDTA Taq-DNA-polymerase 2. H/c sinh phẩm dùng trong tách dòng Pepton Yeast Extract Nacl Agar Ampicilin X-gal IPTG Accuprep plasmid Mini Extraction Kit EcoRI pBT 3. H/c phục vụ giải trình tƣ̣ gene Big Dye Terminator V3.1 HiDi Formamid Ethanol tuyệ đối Applied BioSciences (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Sigma (Mỹ) Sigma (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Applied BioSciences (Mỹ) Applied BioSciences (Mỹ) Fermentas (Mỹ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 2.2.2. Các máy và thiết bị chính Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính Tên máy, thiết bị Hãng sản xuất Tủ ấm ổn nhiệt Máy PCR (GenAmp PCR System 9700) Máy PCR (Thermo cycle) Máy ly tâm (Biofuge Primo R) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Máy chụp ảnh Gel-Doc Tủ lạnh -200C, -800C Lò vi sóng Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Bể ổn nhiệt Máy lắc Gyromax 737R Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100- Avant Sanyo (Nhật Bản) Applied BioSciences (Mỹ) Bio-rad (Pháp) Heraeus (Mỹ) Thommas Scientific (Mỹ) Dolphin (Mỹ) Nuaire (Mỹ) Sanyo (Nhật Bản) Nuaire (Mỹ) Memmert (Đức) Amerex Instrument (Đức) Analitika (Đức) Applied BioSciences (Mỹ) 2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu Các mồi đặc hiệu cho phát hiện trực khuẩn lao và lao kháng thuốc được sử dụng cho phản ứng PCR n hân các đoạn gen đích có trình tự tương ứng là : - Cặp mồi dùng cho nhân trình tự gen katG: KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3' KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3' - Cặp mồi dùng cho giải trình tự gen katG: M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' Các trình tự này được gửi tổng hợp ở công ty Invitrogen , Hồng Kông . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u 2.3.1. Thiết kế nghiên cƣ́u Tiến hành nghiên cứu theo phương pháp : - Dịch tễ học mô tả , điều tra cắt ngang, có đối chứng. - Thực nghiệm labo có đối chứng . Sơ đồ nghiên cƣ́u DNA (Tách từ vi khuẩn lao đã đƣợc xác định tính kháng thuốc) Nhân bản đoạn gen katG sƣ̉ dụng mồi đặc hiệu Sản phẩm gen KatG Tách dòng gen KatG Sản phẩm vector có đoạn gen KatG Giải trình tự gen KatG Xác định đột biến liên quan đến tính kháng INH Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể 2.3.2.1. Kỹ thuật nhân bản đoạn gen katG sử dụng mồi đặc hiệu Sơ đồ qui trình nhân bản đoạn gen KatG Cụ thể: 1. Sau khi đo nồng độ DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nha u để khi đưa vào hỗn hợp sản phẩm cùng một thể tích DNA khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thể tích 25µl phản ứng . 2. Tính các giá trị của các thành phần khác . Đo nồng độ DNA của mẫu nghiên cƣ́u Tính toán giá trị các thành phần phản ứng PCR Tạo hỗn hợp phản ứng Nhân gen theo chu trình nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa Điện di kiểm tra vạch đặc hiệu Sƣ̉ dụng sản phẩm PCR làm DNA chèn vào plasmid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ Nước 10,25 MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM PCR bufer (10X) 2,5 1 X dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM Mồi KatG F 1 0,5 µM Mồi KatG R 1 0,5 µM Taq Polymerase 0,25 1 unit DNA khuôn 5 Tổng 25 Các thành phần này ở phản ứng của các mẫu bệnh phẩm đều giống nhau. Có đối chứng âm khi tiến hành phản ứng . 3. Chu trình nhiệt như sau : 4. Điện di sản phẩm PCR trên a garose 1,5%, nhuộm Ethidium bromide và đọc kết quả trên máy Gel - Doc. 95 0 C 5 phút 95 0 C 1 phút 56 0 C 45 giây 72 0 C 1 phút 72 0 C 4 phút 4 0 C 60 phút 35 chu kỳ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.3.2.2. Kỹ thuật tách dòng (cloning), tạo sản phẩm phục vụ giải trình tự gen katG Sơ đồ qui trình tách dòng Sau khi nhân bản thành công đoạn gen katG, chúng tôi tiến hành làm sạch (thôi gel) bằng bộ kit QIAquick Gel Extraction . Trong quá trình thao tác trên đèn tím rất có thể bị đứt gẫy các nucleotide sẽ gây ảnh hưởng k hông tốt tới sản phẩm kết nối , vì vậy trước k hi thực hiện phản ứng kết nối chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng nối đầu A . Thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.5. Tinh sạch và gắn đoạn gen vào vector tách dòng pBT tạo vector tái tổ hợp Đƣa vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến Nuôi cấy tế bào có vector Lƣ̣a chọn tế bào mang vector tái tổ hợp theo nguyên tắc chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng Kiểm tra và tách plasmid Thu plasmid, kiểm tra đoạn gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A Thành phần phản ứng PCR Thể tích (µl) Nồng độ Nước 5,25 MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM PCR bufer (10X) 2,5 1 X dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM Taq Polymerase 0,25 1 unit DNA khuôn 7 Tổng 20 Sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 720C trong 10 phút. Sau đó tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR theo qui trình của nhà sản xuất. Qui trình : - Thêm 100 µl building buffer và o các Eppendorf chứa mẫu vừa được nối đầu A. Vortex nhẹ. - Hút hết sản phẩm trên sang các Eppendorf có bổ sung cột lọc. - Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch lỏng, thu cặn bám trên cột lọc. - Thêm 500 µl Washing buffer vào Eppendorf. Ly tâm 13000 vòng/phút/40C. Đổ dịch, thu cặn bám trên cột lọc. - Lặp lại bước trên. - Làm khô bằng cách ly tâm thêm 1 lần nữa. - Thêm 15 µl nước deion vào . Đợi trong vòng 1 phút. - Thu dịch, loại bỏ cột lọc. Sau đó thực hiện các bước sau: 1. Tạo sản phẩm kết nối Kết nối đoạn gen katG cần nghiên cứ u với vector pBT theo qui trình của nhà sản xuất . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Qui trình : - 2X Papid Ligation Buffer 1 µl - T4 DNA Ligase 1 µl - pBT Vector 1 - PCR product 5 µl - Nước cất khử ion vừa đủ 10 µl. Sau đó sản phẩm được tiến hành trên máy PCR ở 220C trong vòng 60 phút. 2. Biến nạp và nuôi cấy tế bào có vector tái tổ hợp Biến nạp sản phẩm kết nối trên vào tế bào khả biến E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt [15]. Nuôi cấy tế bào và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong tế bào theo qui trình sau : - Lấy tế bào khả biến ra khỏi tủ âm , để trong nước đá (40C) trong vòng 10-15 phút. - Hút 5 µl sản phẩm kết nối cho vào các ống tế bào khả biến (có đảo nhẹ). - Để ống tế bào khả biến trong nước đá (40C) 30 phút, sốc nhiệt ở 420C trong vòng 90 giây. - Tiếp tục giữ ở 40C trong vòng 1-2 phút. - Thêm 100 µl LB lỏng vào các ống tế bào khả biến trên (có đảo nhẹ ), cho ngay các ống tế bào khả b iến này vào tủ nuôi cấy lắc , để ở 370C và 220 vòng/phút trong 1 giờ. - Hút 150 µl dịch khuẩn đã nuôi lắc cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có carbenicillin, X-gal, IPTG. - Giữ sản phẩm ở tủ ổn nhiệt 370C qua đêm (18-24 giờ). - Khi trên bề mặt đĩa thạch xuất hiện các tế bào xanh trắng , lựa chọn các khuẩn lạc trắng chấm vào 3 ml LB lỏng có kháng sinh carbenicillin với nồng độ 100 µg/ml. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 - Lấy 1 µl dịch khuẩn làm phản ứng PCR k iểm tra đoạn gen vớ i 2 mồi KatG F và KatG R (chu trình nhiệt như với PCR nhân đoạn gen katG). - Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm PCR , nếu mẫu nào có vạch tương ứng với đoạn gen KatG thì sử dụng mẫu đó để tách plasmid . 3. Tách chiết plasmid (Sử dụng các hóa chất có tại phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH). Sử dụng kit QIAprep spin Miniprep (của hãng QIAGEN ) và quy trình của nhà sản xuất để tách chiết plasmid . Đây là phương pháp tách chiết plasmid lượng nhỏ từ 1-1,5 ml khuẩn lạc E. coli. - Hút 2 ml dịch khuẩn cho vào Eppendorf 2 ml. - Ly tâm 8000 vòng/2 phút ở 40C thu khuẩn . - Thêm 100 µl sol I, vortex nhẹ cho tan cặn . - Thêm 200 µl sol II, đảo nhẹ Eppendorf. - Thêm 150 µl sol III, đảo nhẹ Eppendorf cho dịch chuyển sang màu trắng. (Đảo ngay khi thêm hóa chất vào Eppendorf, tránh kết tủa cục bộ). - Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Hút 300 µl dịch, bỏ cặn. - Thêm 1 lượng tương đương P CI 24:1 (24 phenol-chloroform - isoamylalchohol). Lắc mạnh, ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Thu pha trên. - Thêm 1 lượng tương tương isopropanol . Lắc đều. - Ly tâm 13000 vòng/10 phút/40C. Thu cặn. - Rửa cồn. Ly tâm 13000 vòng/5 phút/40C. - Đợi khô. - Thêm 50 µl nước deion. 4. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chèn vào plasmid Sử dụng enzym cắt giới hạn BamHI để cắt plasmid . Theo như sơ đồ vector pBT thì chỉ cần một enzym này là có thể cắt ở cả hai đầu phía trước vị trí của đoạn gen chèn vào. Kết quả sau khi thực hiện phản ứng cắt sẽ thu được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 hai phần : tạo một vạch trên hình ảnh điện di có kích thước khoảng 684 bp và một vạch là phần còn lại của plasmid khoảng 2705 bp. Qui trình dùng BamHI: - 10X BamHI buffer: 2µl - BamHI enzym: 1µl - DNA plasmid: 5µl - Nước deion vừa đủ 20µl Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút. Sau đó điện di trong agarose 1% kiểm tra vạch đặc hiệu . Những mẫu nào có vạch tương ứng với vị trí 684 bp thì có thể sử dụng để đọc trình tự . Sau khi xác định được mẫu plasmid đi đọc trình tự , pha loãng plasmid 50 lần rồi hút 10µl mẫu đó cho vào Eppendorf, bổ xung thêm 5µl RNAase. Sản phẩm được tiến hành ở bể ổn nhiệt 370C trong vòng 90 phút để khử RNA . 2.3.2.3. Phương pháp đọc trình tự DNA theo Sanger trên máy đọc trình tự tự động phân tích kết quả bằng các phần mềm chuyên dụng Plasmid được gửi đọc trình tự tại phòng Công nghệ gen t rọng điểm - Viện Công nghệ Sinh học . * Phân tích kết quả : - Kiểm tra kết quả thu được bằng phần mềm máy tính ABI 3130. - Khai thác dữ liệu từ ngân hàng gen , thiết lập chủn g chuẩn wild type để so sánh. - Xử lý, phân tích các trình tự đoạn gen katG có kích thước khoảng 684 bp của các chủng vi khuẩn lao bằng chương trình phân tích chuỗi BioEdit . So sánh đối chiếu với các dữ liệu ở ngân hàng gen để có kết quả các vị trí đột biến của từng chủng nghiên cứu . Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê , sử dụng chương trình phân tích sinh học Star View v5.0 để xác định các mối liên quan kháng thuốc . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cƣ́u Sử dụng cặp mồi katG F và katG R nhân bản đoạn gen katG bằng kỹ thuật PCR. Sau khi có được sản phẩm PCR , chúng tôi tiến hành kiểm tra đoạn gen được nhân lên bằng phương pháp điện di trên agarose 1%. Kết quả được thể hiện như trong ảnh 3.1 và 3.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Kết quả điện di kiểm tra sau khi PCR nhân gen katG cho thấy cả 14 chủng vi khuẩn lao đều có kết quả dương tính với đoạn gen katG có chiều dài 684bp. Các vạch DNA đặc hiệ u rõ ràng , không có vạch phụ kèm theo . Chứng tỏ đoạn gen katG đã được nhân lên đặc hiệu. Zenteno-cuevas và cộng sự (2009), từ 80 mẫu bệnh phẩm lâm sàng có kết quả PCR chẩn đoán dương tín h với vi khuẩn lao thì có hơn 95% số chủng có đoạn gen katG. Nhiều tá c giả khác khi nhân đoạn gen katG để giải trình tự , thường có kết quả tỷ lệ dương tính với gen katG là 100%. Như vậy kết quả của chúng tôi thống nhất với các công bố khác trong và ngoài nước . Theo nhiều tác giả trên thế giới , cần thiết phải tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối . Chúng tôi tiến hành tinh sạch theo phương pháp thôi gel bằng kit của hãng QIAGEN , song song với các mẫu đó chúng tôi tiến hành các mẫu không tinh sạch . Kết quả qua lựa chọn các dòng tế bào dương tính có chứa đoạn gen katG của 2 nhóm này thấy rằng , chọn 10 dòng thì ở nhóm tinh sạ ch có tới 9 dòng dương tính , còn ở nhóm không tinh sạch đạt từ 6-7 dòng dương tính . Hơn nữa ở nhóm có tinh sạch khi điện di kiểm tra trên agarose 0,8% cho các vạch rõ ràng , sắc nét . Vì vậy các mẫu sau này chúng tôi đều tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR trước khi tạo sản phẩm kết nối. Kết quả này cũng chứng tỏ sản phẩm PCR đoạn gen katG có chiều dài 684 bp đã tách dòng được. 3.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α Bước đầu tiên của quá trình tách dòng là thực hiện ph ản ứng gh ép nối gen katG và vector tách dòng pBT , đây là vector có nhiều ưu điểm như : kích thước nhỏ , có nhiều điểm cắt giới hạn của các enzym hạn chế . Đồng t hời, vector này còn chứa hai gen kháng kháng sinh ampicillin và ca rbenicillin giúp cho quá trình chọn lọc đơn giản hơn . Đặc biệt vector này rất thuận lợi cho Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 thao tác ghép nối các đoạn DNA ngoại lai do chúng được thiết kế dưới dạng mở vòng mạch thẳng với hai đầu 3' của mỗi sợi gắn thêm nucleotide T. Ảnh 3.3: Sơ đồ vector pBT Đầu 5' của đoạn gen katG có mang nucleotid e loại A . Vì vậy khi thực hiện phản ứng kết nối , gen katG sẽ dễ dàng được gắn vào vector theo nguyên tắc bổ sung . Phản ứng nối được xú c tác bởi T 4 DNA ligase . Bước tiếp theo chúng tôi tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt . Sau đó, sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin , X- gal và IPTG . Sự có mặt của X -gal sẽ giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng. Kết quả được trình bày ở hình 3.2. C ác v ị trí cắt củ a en zy m g iớ i h ạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Ảnh 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp trên môi trƣờng LB có bổ sung carbenicillin, X-gal và IPTG. Trên môi trường có chứa kháng sinh carbenicillin, X-gal và IPTG , phát triển hai loại khuẩn lạc : khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng . Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã đượ c biến nạp plasmid chứa gen kháng kháng sinh carbenicillin, nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp . Vì những vi khuẩn E. coli chứa plasmid pBT nguyên vẹn sẽ có gen lacZ hoàn chỉnh sản xuất ra β-galactosidase. Enzym này phân hủy cơ chất X-gal có trong môi trường tạo nên dẫn xuất indol , dẫn xuất này ngoài môi trường sẽ bị oxy hóa tạo thành màu xanh . Nếu đoạn DN A ngoại lai xen vào giữ a gen lacZ thì gen này sẽ bị phá hỏng , enzym β-galactosidase không được tạo ra , vì thế mặc dù có X -gal trong môi trường nhưng cơ chất này không bị thủy phân , không tạo nên dẫn xuất indol và khuẩn lạc có màu trắng . 3.3. Kết quả tách dòng gen katG Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmi d tái tổ hợp chứa đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng kỹ thuật c olony- PCR. Vì số lượng khuẩn lạc sau khi biến nạp là rất nhiều nên chúng tôi chọn ngẫu nhiên 28 khuẩn lạc trắng để thực hiện phả n ứng colony -PCR sử dụng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 cặp mồi katG F và katG R. Sản phẩm colony -PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Nếu khuẩn có plasmid mang gen katG thì sản phẩm PCR sẽ xuất h iện một băng có kích thước mong muốn khoảng 684 bp. Đồng thời nuôi những khuẩn lạc này vào 3 ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin, để tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự . Sau khi nuôi khuẩn lạ c trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh carbenicillin, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình của nhà sản xuất . Để khẳng định chắc chắn rằng plasmid mới tách chiết có mang đoạn gen katG quan tâm, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt plasmid . Sản phẩm cắt plasmid được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.5, 3.6, 3.7 và 3.8. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Trên ảnh , các plasmid có mang gen katG có độ dài khoảng 684 bp thì sẽ xuất hiện hai băng vạch . Một vạch có kích thước khoảng 684 bp, là kích thước của đoạn gen katG. Một vạch có kích thước khoảng 2,7 kb, là kích thước của vector pBT. Thực hiện cắt plasmid bằng enzy m giới hạn BamHI xác định đoạn gen katG trên 27 mẫu plasmid có 23 mẫu cho kết quả dương tính , 4 mẫu kết quả âm tính . Các kết quả âm tính này là do những sai sót trong lựa chọn mẫu để tách plasmid . Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu plasmid cho thấy là các dòng tế bào được tăng sinh khá tốt và quá trình tinh sạch là đảm bảo chất lượng. Các tác giả khác khi sử dụng các bộ kit tinh sạch của các hãng như Fermentas, Promega... đều cho các kết quả tương tự . Nồng độ vi khuẩn của các mẫu là tương đương và cùng được sử dụng một phương pháp tách chiết vì vậy n ồng độ của DNA plasmid các mẫu nghiên cứu khá đồng đều , chủ yếu từ 300-500 ng/µl. Như vậy kế t quả tách chiết kiểm tra plasmid của chúng tôi đã khẳng định đoạn gen katG đã được nhân lên với số lượng lớn trong tế bào vi khuẩn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 E.coli DH5α. Các mẫu DNA plasmid thu được có đủ điều kiện về độ tinh sạch và nồng độ phục vụ cho giải trình tự gen . 3.4. Kết quả phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cƣ́u. Các chủng vi khuẩn lao sau khi đọc trình tự được xử lý kết quả qua phần mềm BioEdit . So sánh trình tự nucleo tide và acid amin từ các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotid e và acid amin của chủng dại H 37Rv chúng tôi thu được kết quả đột biến trên các chủng lao kháng thuốc . Kết quả được thể hiện qua ảnh 3.9 và 3.10. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Ảnh 3.9: So sánh trình tƣ̣ nucleotide các mẫu bệnh phẩm với trình tự nucleotide của chủng dại H37Rv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Ảnh 3.10: So sánh trình tƣ̣ acid amin các mẫu bệnh phẩm với trình tự acid amin của chủng dại H37Rv Từ ảnh 3.9 và ảnh 3.10 chúng tôi có bảng thống kê sau : Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Bảng 3.1: Các vị trí xảy ra đột biến trên đoạn gen katG của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 612 628 673 708* 723* 742 761 768* 925 944 980 1060 1107* 1123 1129 1163 1203* 1205 1211 1 TGG- CGG GCC- GCT* AGC- ACC GGC- GGT* 2 AGC- ACC CCG- TCG 3 AGC- ACC ACC- GCC TTG- TCG 4 AAC- AAT* ATT- TTT AGC- ACC 5 AGC- ACC 6 ATG- GTG AAA- ATA 7 AGC- ACG ATG- GTG X 8 AGC- ACC 9 CCC- CCG* AGC- ACC GAG- GGG 10 11 CGC- CAC AGC- ACC 12 AGC- ACC CCC- CCA* 13 X GGT- TGT AGC- AAC 14 AGC- AAC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Chú thích: X: Vị trí đột biến mất mucleotide; *: Vị trí đột biến không dẫn đến sự thay đổi acid amin Bảng 3.2: Các vị trí xảy ra đột biến thay thế acid amin của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 204 210 225 248 254 309 315 327 354 356 375 377 388 402 404 1 W -> R S -> T 2 S -> T P -> S 3 S -> T T -> A L -> S 4 I -> F S -> T 5 S -> T 6 M -> V K -> I 7 S -> T M -> V X 8 S -> T 9 S -> T E -> G 10 11 R -> H S -> T 12 S -> T 13 X G -> C S -> N D -> G 14 S -> T Mẫu ĐB Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Chú thích: X: Vị trí codon có đột biến mất nucleotide. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Từ bảng thống kê 3.1 chúng tôi nhận thấy : Đột biến xảy ra ở 13 mẫu trên tổng số 14 mẫu bệnh phẩm . Đột biến có thể xảy ra ở một điểm hoặc nhiều điểm trên đoạn gen katG quan tâm. Mỗi acid amin có thể được mã hóa bở i nhiều bộ ba . Vì vậy không phải tất cả các đột biến đều dẫn đến sự hình thành một acid amin mới. Các đột biến làm xuất hiện bộ ba mã hóa mới , nhưng không dẫn đến sự hình thành acid amin mới thì không làm thay đổi cấu trúc bậc một của protein, do đó cấu trúc không gian của protein vẫn được giữ vững nên các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc . Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 1, tại điểm 768 có đột biến làm biến đổi bộ ba GCC thành GCT , tại điểm 1107 có đột biến làm biến đổi bộ ba GGC thành GGT; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 4, tại điểm 708 có đột biến làm biến đổi bộ ba AAC thành AAT ; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 9, tại điểm 723 có đột biến làm biến đổi bộ ba CCC thành CCG ; Ở mẫu bệnh phẩm ĐA 12, tại điểm 1203 có đột biến làm biến đổi bộ ba CCC thành CCA . Khi đối chiếu các điểm đột biến này sang bảng 3.4, chúng tôi nhận thấy các đột biến này không làm xuất hiện các acid amin mới . Từ đó chúng tôi kết luận các đột biến này không liên quan tới tính kháng thuốc isoniazid . Từ bảng thống kê 3.2 chúng tôi nhận thấy : Sự đột biến xảy ra ít nhất trên 1 codon và nhiều nhất là trên 3 codon như ở các mẫu bệnh phẩm ĐA 3, ĐA7, ĐA13. Trong số 13 mẫu bệnh phẩm có mang đột biến thì có tới 11 mẫu có đột biến tại codon 315, chiếm 84,6%. Đột biến tại codon 315 này là đột biến thay thế 1 nucleotide loại G thành loại C , sự thay thế này làm bộ ba AGC trở thành ACC. Đột biến tại codon 315 cũng có thể là sự thay thế cùng lúc 2 nucleotide, như ở mẫu bệnh phẩm ĐA7. Sự thay đổi bộ ba mã hóa các acid amin kéo theo là sự thay đổi các acid amin do bộ ba đó quy định. Vì vậy acid amin tại codon 315 được biến đổi từ serine thành threonine . Năm 2009, Elis R Dalla Costa và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 cộng sự đã tiến hành xác định các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc trên các gen katG, oxyR-ahpC và inhA . Với