Xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (ce-C4d) - Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

68 XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ACID FORMIC, ACID ACETIC, ACID PROPIONIC VÀ ACID BUTYRIC BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÖC (CE-C4D) Đến tòa soạn 21 - 08 - 2016 Nguyễn Thị Quỳnh Hoa Khoa Công nghệ Hóa học và Môi trường - Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Hưng Yên Lê Thị Hồng Hảo, Vũ Thị Trang Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia - Bộ Y tế Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, Đỗ Thị Trang, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thị Ánh Hường Khoa Hóa học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Vũ Quỳnh Chi Trường Đại học Y Dược Thái Bình - Bộ Y tế Lê Hoàng Cục An toàn Thực phẩm - Bộ Y tế SUMMARY SIMULTANEOUS DETERMINATION OF FORMIC ACID, ACETIC ACID, PROPIONIC ACID AND BUTYRIC ACID BY CAPILLARY ELECTROPHOESIS WITH CAPACITIVELY COUPLED CONTACTLESS CONDUCTIVITY DETECTION (CE-C 4 D) Capillary electrophoresis is an effective and simple method for rapid determination of organic acids in different kind of samples, including food sample. Four organic acids, including Formic acid, Acetic acid, Propionic acid and Butyric acid, were separated using fused-silica capillary of 50µm I.D and total length of 50cm. The separation voltage was -18 kV. The separation was performed in less than six minutes with electrolyte solution consisting of 30mM L-histidine and 40mM Mes (2-(N- morpholino) ethanesulfonic) (pH 5.8). Detection limits of 10 -6 M and 2.10 -6 M were achieved for Formic acid and Acetic acid, Propionic acid, Butyric acid, respectively. The method was applied for the determination of target acids in coffee, red wine and soft drink samples. Keywords: Formic acid, Acetic acid, Propionic acid, Butyric acid, capillary electrophoresis (CE), capacitively coupled contactless conductivity detection (C 4 D) Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 21, Số 4/2016 69 1. MỞ ĐẦU Bốn aci hữu cơ: aci Formic, aci Acetic, aci Propionic, aci Butyric có vai tr quan trọng trong c ng nghiệp chế iến thực phẩm v i các tác ụng nhƣ chống nấm mốc, gi p ức chế sự phát triển của vi sinh vật, kéo i thời gian sử ụng của sản phẩm Tuy nhiên, khi sử ụng v i h m lƣợng l n, ch ng kh ng những kh ng ảo quản đƣợc thực phẩm m c n có thể ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời tiêu ng [1, 2]. Do đó, việc ph n tích xác định h m lƣợng các aci n y trong mẫu thực phẩm, đồ uống nhằm đánh giá và kiểm soát chất lƣợng thực phẩm l cần thiết Các phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử ụng để xác định đồng thời các aci hữu cơ n y l sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí (GC), sắc ký trao đổi ion, Trong nghiên cứu n y, ch ng t i gi i thiệu m t phƣơng pháp ph n tích nhanh, đơn giản, hiệu quả v i chi phí thấp nhằm xác định đồng thời ốn aci hữu cơ n y trong mẫu thực phẩm, đó l phƣơng pháp điện i mao quản sử ụng etector đ ẫn kh ng tiếp x c kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) trên cơ sở hệ thiết ị tự chế, án tự đ ng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các hóa chất tinh khiết ph n tích đƣợc sử ụng trong nghiên cứu gồm: aci Formic, aci Acetic, aci Propionic v aci Butyric (Merck, Đức), L-Histidine (His) và 2- (N- morpholino) ethanesulfonic (Mes) (Fluka, Thụy sĩ) Trong nghiên cứu n y, ốn aci hữu cơ gồm: aci Formic, aci Acetic, aci Propionic v aci Butyric đƣợc xác định đồng thời trong các đối tƣợng mẫu thực phẩm, đồ uống nhƣ: c phê, rƣợu vang v nƣ c giải khát, ằng phƣơng pháp điện i mao quản sử ụng etector đ ẫn kh ng tiếp x c kết nối kiểu tụ điện (CE- C4D). Hình 1 Hệ thiết ị điện i mao quản CE-C4D tự chế, án tự đ ng (1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D), 4: Bộ phận kết nối bán tự động, 5: Núm điều chỉnh, 6: Bộ phận điều khiển, 7: Bình khí nén) Hệ thiết ị CE-C4D tự chế, án tự đ ng (Hình 1) đƣợc thiết kế, chế t o t i Việt Nam ởi C ng ty cổ phẩn 3SANALYSIS ( trên cơ sở hợp tác v i nhóm nghiên cứu của GS Peter Hauser (Khoa Hóa, Trƣờng Đ i học Basel, Thụy 70 Sĩ) Các th ng tin về đ c điểm kỹ thuật của hệ thiết ị có thể tham khảo trong c ng ố trƣ c đ y của nhóm nghiên cứu [3 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ƣu phân tích đồng thời acid Formic, acid Acetic, acid Propionic và acid Butyric bằng phƣơng pháp CE- C4D Việc khảo sát các điều kiện ph n tách đồng thời 4 acid đƣợc thực hiện trên thiết ị CE-C 4D v i c t mao quản có chiều i 50 cm (chiều i hiệu ụng 43 cm), đƣờng kính trong 50 µm, ơm mẫu theo phƣơng pháp thuỷ đ ng lực học kiểu xiph ng Các điều kiện n y đƣợc giữ nguyên trong tất cả các thí nghiệm Ngo i ra, các th ng số liên quan đến hiệu quả ph n tách ằng phƣơng pháp CE-C4D nhƣ ung ịch đệm điện i (th nh phần, pH v nồng đ ), thế tách, chiều cao v thời gian ơm mẫu cũng đƣợc khảo sát nhằm đ t đƣợc kết quả tối ƣu nhất 3.1.1. Khảo sát dung dịch đệm điện di Trong phƣơng pháp CE-C4D thì th nh phần, pH v nồng đ của ung ịch đệm điện i ảnh hƣởng trực tiếp đến khả năng tách các chất trong quá trình ph n tích Trên cơ sở tham khảo t i liệu [5 v thực tế khảo sát cho thấy, khi sử ụng hệ đệm điện i His 50 mM/Mes 50 mM (pH = 6,1) cho kết quả ph n tách các aci n y khá tốt Do đó, hệ đệm His/Mes đƣợc lựa chọn để khảo sát, thay đổi tỷ lệ nồng đ các hợp phần nhằm tối ƣu về pH ph hợp v i điều kiện thực nghiệm ở Việt Nam. Các tỉ lệ nồng đ đệm tƣơng ứng v i pH đƣợc khảo sát gồm: His 30 mM/Mes 50 mM (pH = 5,6 ), His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8 ), và His 50 mM/Mes 40 mM (pH = 6,3 ) Các điều kiện khảo sát gồm: h n hợp mẫu chuẩn có nồng đ của aci Acetic l 6 10-5 M, acid Formic, acid Propionic v aci Butyric có c ng nồng đ l 5 10-5 M; thế tách l -18 kV, ơm mẫu ở đ cao 10 cm trong 20 s. Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong Hình 2 4003002001000 20 mV formic acetic propionic butyric Thêi gian di chuyÓn (s) 1 2 3 Hình 2. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của dung dịch đệm điện di His/Mes đến sự phân tách acid Formic, acid Acetic, acid Propionic và acid Butyric 1: His 30mM /Mes 50mM, 2: His 30mM /Mes 40mM, 3: His 50mM /Mes 40mM 71 Kết quả cho thấy ở cả a tỉ lệ khác nhau về pH v nồng đ của cấu tử đệm đều cho khả năng tách tốt các chất ph n tích Tuy nhiên, hệ đệm His 30 mM/Mes 40 mM (pH =5,8 ) cho kết quả iện tích pic của các chất ph n tích v đƣờng nền tốt nhất Do đó, ung ịch đệm điện i His 30 mM/Mes 40 mM (pH =5,8) đƣợc lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thế tách Trong phƣơng pháp CE-C4D, thế tách l m t trong những yếu tố quan trọng, ảnh hƣởng trực tiếp đến sự i chuyển của các ion trong mao quản, quyết định đến khả năng ph n tách của ch ng Thế tách đƣợc khảo sát ở các giá trị -15 kV, -18 kV và -20 kV. Các điều kiện khảo sát nhƣ mục 3 1 1 v i ung ịch đệm điện i l His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8 ) Kết quả khảo sát thế tách đƣợc thể hiện ở Hình 3. 4003002001000 20 mV Thêi gian di chuyÓn (s) formic acetic propionic butyric 15 kV 18 kV 20 kV Hình 3. Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thế tách Hình 3 cho thấy, khi áp thế từ -15 đến -20 kV thì iện tích các pic của các chất ph n tích hầu nhƣ ít thay đổi Dựa v o tín hiệu pic thu đƣợc, tổng thời gian ph n tích và tín hiệu nhiễu đƣờng nền, thế tách l -18 kV đƣợc chọn cho các khảo sát tiếp theo Ngo i ung ịch đệm điện i, thế tách thì chiều cao v thời gian ơm mẫu cũng đƣợc khảo sát V i các chiều cao ơm mẫu 10 cm, 15 cm, 20 cm v thời gian ơm mẫu là 10 s, 20 s, 25 s đ khảo sát, ch ng t i lựa chọn chiều cao ơm mẫu l 15 cm v thời gian ơm mẫu 20 s l tốt nhất Nhƣ vậy, điều kiện tối ƣu nhằm ph n tách đồng thời ốn aci hữu cơ ằng phƣơng pháp CE-C4D gồm: mao quản silica có tổng chiều i 50 cm (chiều i hiệu ụng 43 cm), đƣờng kính trong 50 µm, ơm mẫu ằng phƣơng pháp thủy đ ng lực học kiểu xiph ng ở đ cao 15 cm trong 20 s, ung ịch đệm điện i His 30 mM/Mes 40 mM (pH = 5,8 ), thế tách l -18 kV. 3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích Đƣờng chuẩn ph n tích ốn aci đ đƣợc thiết lập sử ụng điều kiện ph n tích tối ƣu, trong khoảng nồng đ 0,5 10-5 ÷ 10-4 M v i aci Formic, 0,6 10-5 ÷ 8.10-5 M v i Acetic, 0,6.10 -5 ÷ 10 -4 M v i hai aci Propionic v Butyric Kết quả phƣơng trình đƣờng 72 chuẩn, hệ số tƣơng quan, gi i h n phát hiện (LOD) v gi i h n định lƣợng (LOQ) của các aci đƣợc trình y trong Bảng 1 Bảng 1. Phương trình đường chuẩn xác định acid Formic, acid Acetic, acid Propionic và acid Butyric Tên chất Phƣơng trình đƣờng chuẩn Hệ số tƣơng quan R 2 LOD (M) LOQ (M) Acid Formic y = (10,165±6,532)+(61,798±1,1618)x 0,99912 1.10 -6 3,3.10 -6 Acid Acetic y = (-0,525±2,982)+(31,493±0,672)x 0,99909 2.10 -6 6,7.10 -6 Acid Propionic y = (-5,079±6,114)+(61,634±1,096)x 0,99921 2.10 -6 6,7.10 -6 Acid Butyric y = (6,705±5,283)+(57,903±0,991)x 0,99927 2.10 -6 6,7.10 -6 3.3. Phân tích một số mẫu thực tế Tiến h nh ph n tích 7 mẫu thực tế đƣợc mua ngẫu nhiên t i các cửa h ng/siêu thị ở H N i gồm nƣ c cam ép, nƣ c C2, Rƣợu Contre-étiquette, Rƣợu Soliera Tempranillo, Rƣợu vang Thăng Long, C phê Việt v C phê G7 Các mẫu đƣợc xử lý nhƣ sau: Mẫu c phê: Cân chính xác khoảng 1g cà phê trên cân phân tích, cho v o ống falcon cùng 10 ml nƣ c đề-ion, rung cơ học trong 5 phút rồi rung siêu âm trong 20 phút. Dung ịch n y đƣợc lọc qua m ng lọc 0,45 µm v pha lo ng v i tỉ lệ thích hợp (pha loãng 5 lần) trƣ c khi thực hiện quá trình ph n tích trên thiết ị CE-C4D. Mẫu nƣ c giải khát v mẫu rƣợu đƣợc lọc qua m ng lọc 0,25 µm, sau đó pha lo ng v i tỉ lệ thích hợp rồi tiến h nh ph n tích trên thiết ị CE-C4D. 3.3.1. Kết quả phân tích hàm lượng các acid trong mẫu thực tế Kết quả ph n tích h m lƣợng ốn aci trong các mẫu thực tế ằng phƣơng pháp thêm tiêu chuẩn đƣợc nêu trong Bảng 2 v m t số điện i đồ minh họa trong Hình 4 4003002001000 20mV Thêi gian di chuyÓn (s) cµ phª n-íc cam 1 2 2 2 3 3 3 3 1 2 r-îu Th¨ng Long r-îu nho Ph¸p Hình 4. Điện di đồ xác định các chất phân tích trong mẫu rượu, cà phê và nước giải khát 1. Acid Formic 2. Acid Acetic 3. Acid Propionic 73 Kết quả ph n tích kh ng phát hiện aci Butyric trong tất cả các mẫu, nhƣng phát hiện đồng thời 2 ho c 3 aci c n l i trong hầu hết các mẫu H m lƣợng aci Formic v aci Propionic đều nằm trong gi i h n cho phép của B Y tế đối v i các sản phẩm tƣơng ứng H m lƣợng aci Acetic trong mẫu nƣ c giải khát (cam ép v nƣ c C2) vƣợt quá h m lƣợng cho phép, đối v i các mẫu c n l i thì h m lƣợng aci Acetic nằm trong gi i h n cho phép của B Y tế (1500 mg/l đối v i nh n h ng nƣ c giải khát) 3.3.2. Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp tiêu chuẩn HPLC Để kiểm chứng các kết quả ph n tích ằng phƣơng pháp CE-C4D, 6 trong tổng số 7 mẫu ph n tích đ đƣợc ph n tích t i Viện Kiểm nghiệm An to n Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, sử ụng phƣơng pháp tiêu chuẩn (Phƣơng pháp Sắc kí lỏng Hiệu năng cao - HPLC) Kết quả ph n tích đối chứng đƣợc thể hiện trong Bảng 2 Bảng 2. Kết quả phân tích và kết quả đối chứng với phương pháp HPLC Mẫu thực H m lƣợng chất ph n tích % Sai khác giữa 2 phƣơng pháp Phƣơng pháp CE-C4D Phƣơng pháp HPLC For mic Acet ic Propio nic Butyr ic Form ic Aceti c Propio nic Butyr ic Form ic Acet ic Propio nic Buty ric Cam ép (mg/l) - 6126 249 - - 6567 261 - - 6,72 3,99 - Nƣ c C2 (mg/l) - 1992 448 - - 2387 473 - - 16,6 5,21 - Rƣợu Contre-étiquette (mg/l) - 83,9 471 - - 90,8 450 - - 7,50 -4,7 - Rƣợu Soliera Tempranillo (mg/l) - 1085 851 - - 1103 875 - - 1,58 2,72 - Rƣợu vang Thăng Long (mg/l) 270 935 41,5 - C phê Việt (mg/ 100g) 755 126 405 - 771 132 412 - 16,8 5,22 1,79 - Cà phê G7 (mg /100g) 744 232 949 - 859 211 992 - 13,5 - 9,82 4,23 - Nhƣ vậy, các kết quả ph n tích h m lƣợng ốn aci trong các mẫu thực tế ằng hai phƣơng pháp CE-C4D v HPLC l khá ph hợp (sai số từ 1,58-16,8%), cho thấy phƣơng pháp CE-C 4D có đ đ ng, đ chính xác, đ tin cậy tốt 4. KẾT LUẬN Nhƣ vậy, ch ng t i đ nghiên cứu, khảo sát đƣợc các điều kiện tối ƣu xác định đồng thời aci Formic, aci Acetic, aci Propionic v aci Butyric ằng thiết ị điện i mao quản (CE-C4D) tự chế, án tự đ ng v áp ụng qui trình ph n tích tối ƣu để xác định h m lƣợng của các aci đó trong mẫu c phê, rƣợu vang v nƣ c giải khát Từ đó cho thấy, đ y l m t phƣơng pháp hiệu quả để xác định nhanh h m lƣợng các aci n y v c n có khả năng, triển vọng mở r ng v i các đối tƣợng chất ph n tích khác trong các mẫu thực phẩm, đồ uống nhờ quy trình ph n tích đơn giản, thời gian ph n tích đƣợc giảm thiểu, thiết ị ho t đ ng đơn giản, chi phí thấp. 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 6. B Y Tế (2012) – Th ng tƣ số 27/2012/TT-BYT ngày 30/11/2012, Thông tư hướng dẫn việc quản lý phụ gia thực phẩm. 7. B Y Tế 2002- TCVN 7045:2002 – Quy định kỹ thuật về sản xuất rƣợu vang. 8. Thi Anh Huong Nguyen et. al. (2014), Simple semi-automated portable capillary electrophoresis instrument with contactless conductivity detection for the determination of β-agonists in pharmaceutical and pig-feed samples, Journal of Chromatography A, Vol. 1360, pp. 305-311. 9. Ine’s Mato, Silvia Sua’zez-Luque, José F. Huidobro (2006), Simple determination of main organic acids in grape juice and wine by using capillary zone electrophoresis with direct UV detection, Food Chemistry, Vol. 102 (1), pp. 104- 112. 10. Petr Kupán, Pavol Durc, Miroslava Bittová, Frantisek Foret (2013), Separation of oxalat, formate and glycolate in human body fluit samples by capillary electrophoresis with contactless conductometric detection, Journal of Chromatography A, Vol. 1325, pp. 241-2