Xác định gen gây độc và tính đa dạng di truyền của nấm metarrhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH GEN GÂY ĐỘC VÀ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001-2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: HUỲNH NGỌC PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí minh -2005- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH GEN GÂY ĐỘC VÀ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN: Th.S. VÕ THỊ THU OANH HUỲNH NGỌC PHƢƠNG TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh -2005- iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  TS. Lê Đình Đôn và ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Đinh Duy Kháng đã tận tình giải đáp cho tôi những khó khăn gặp phải trong lúc thực hiện khóa luận.  TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ đã sinh thành, dạy dỗ và ủng hộ tinh thần cho tôi.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Huệ, chị Hƣng , chị Liên đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Xác định gen gây độc Pr1 và tính đa dạng di truyền đoạn gen Pr1của nấm Metarrhizium anisopliae trên côn trùng gây hại” đƣợc thực hiện từ ngày 14 tháng 2 năm 2005 đến ngày 1 tháng 8 năm 2005 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Huỳnh Ngọc Phƣơng thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh và TS. Lê Đình Đôn. Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng nhu động ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của côn trùng dẫn đến côn trùng bị chết khô. Hiện nay nấm Metarrhizium anisopliae đã xuất hiện khắp nơi trong nƣớc và đã góp phần không nhỏ vào việc tạo ra các chế phẩm vi sinh dùng diệt côn trùng gây hại trên cây trồng. Nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana đƣợc xem nhƣ những yếu tố kiểm soát sinh học góp phần tạo nên nền nông nghiệp sạch và bền vững. Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm Metarrhizium anisopliae ở cấp độ phân tử giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt côn trùng lâu dài và hiệu quả. Ngoài ra còn cung cấp những thông tin về tính đa dạng của gen Pr1 nhằm giúp cho việc phát hiện gen Pr1 đƣợc dễ dàng hơn. Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại ngoài đồng ruộng. 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) liên quan đến tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae. 3. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1. Phân lập đƣợc 12 nguồn nấm ký sinh trên nhiều côn trùng khác nhau nhƣ: bọ xít đen, bọ dừa, rầy nâu, sâu cuốn lá lúa, rầy bông cúc ở các tỉnh: Tiền Giang, Long An, Bến Tre, Trà Vinh, Tây Ninh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh. 2. Sử dụng kỹ thuật PCR đã cho phép phát hiện gen Pr1có kích thƣớc 1.5 kb với cặp mồi METPR1/METPR4. Với 12 dòng nấm phân lập đƣợc, tôi đã phát hiện ra 5 dòng (BXĐTG1, BXĐTV7, BXĐLA3, RBCQ915, RBCQ92) là có gen Pr1. 3. Kết quả đọc trình tự cho thấy có một số sai khác giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae của Việt Nam và thế giới. Tuy nhiên, hai mẫu nấm đƣợc giải trình tự là BXĐTG1 và BXĐTV7 không thấy có sự khác biệt. 4. Độ tƣơng đồng của gen Pr1 của hai mẫu BXĐTG1 và BXĐTV7 so với các mẫu trên genbank khá cao (96 – 99.8%). Những kết quả trong nghiên cứu thể hiện tính hiện đại qua sự kết hợp của công nghệ gen và công nghệ vi sinh – là hai công nghệ nền của công nghệ sinh học hiện đại. Kết quả nghiên cứu này sẽ góp phần nhất định trong việc thúc đẩy triển khai nghiên v cứu, ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại không những phục vụ trực tiếp cho công tác chọn giống vi sinh, mà còn phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật trên thực tế. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... ix Danh sách các bảng ............................................................................................... x Danh sách các hình ............................................................................................... xi 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài ................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................... 2 1.2.2. Mục tiêu ...................................................................................................... 3 1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu .................................................................................... 3 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 4 2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay ........... 4 2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng ............................................................. 4 2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. ............................................. 5 2.2.2. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm. ...................................... 9 2.3. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. ............... 10 2.4. Hoạt tính sinh học............................................................................................... 13 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. ............. 17 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................. 17 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................ 17 2.6. Vai trò của protease Pr1 ..................................................................................... 18 2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 ......................................................................... 19 2.8. Phản ứng PCR .................................................................................................... 20 2.8.1. Giới thiệu chung về PCR ......................................................................... 20 2.8.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR ................................... 21 2.8.3. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR ...................................................... 23 2.8.3.1. Sử dụng phƣơng pháp PCR tổng hợp mẫu dò cho các thử nghiệm S1 nuclease ........................................................................................... 23 2.8.3.2. Sử dụng PCR để sàng lọc .............................................................. 23 2.8.3.3. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gen tổng hợp .............. 24 2.8.3.4. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm .......................................... 24 2.8.3.5. Định lƣợng bằng phƣơng pháp PCR ............................................. 25 2.8.3.6. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR ...................................... 26 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR .................................................... 26 2.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide ......................................................... 27 2.9.1. Nguyên tắc hoá học: phƣơng pháp Maxam và Gilbert ............................ 28 2.9.2. Phƣơng pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid của Sanger. ................................................................................................... 28 vii 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 30 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 30 3.1.1. Thời gian .................................................................................................. 30 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................... 30 3.2. Vật liệu và hoá chất ............................................................................................ 30 3.2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 30 3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................. 30 3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự ................ 31 3.2.2. Hoá chất và môi trƣờng ............................................................................ 31 3.2.2.1. Các hóa chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm ................ 31 3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di .................................................... 31 3.2.2.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) ..... 32 3.2.2.4. Môi trƣờng .................................................................................... 32 3.2.3. Các thiết bị chính ...................................................................................... 32 3.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 32 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 33 3.4.1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại cây trồng ............................................................................................. 33 3.4.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA ............................................................ 33 3.4.1.2. Phƣơng pháp tách bào tử ............................................................... 33 3.4.2. Xác định qui trình PCR phát hiện gen Pr1 liên quan tới tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae ............................................................... 33 3.4.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm ....................... 33 3.4.2.2. Phƣơng pháp ly trích DNA ........................................................... 34 3.4.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch DNA ........................................................ 34 3.4.2.4. Khuếch đại gen Pr1-PCR .............................................................. 35 3.4.2.5. Điện di trên gel agarose ................................................................. 36 3.4.2.6. Đọc kết quả điện di........................................................................ 37 3.4.3. Sử dụng phƣơng pháp giải trình tự để xác định và phát hiện sự sai khác cụ thể trong đa dạng di truyền nấm Metarrhizium anisopliae ................. 37 3.4.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR .............................................................. 37 3.4.3.2. Lƣợng DNA thích hợp cho đọc trình tự ........................................ 38 3.4.3.3. Thành phần của phản ứng đọc trình tự .......................................... 39 3.4.3.4. Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự .................. 39 3.4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR .............................................................. 39 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 41 4.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu hại cây trồng ................................................................................................ 41 4.2. Sử dụng phƣơng pháp PCR phát hiện gen liên quan đến tính độc của nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1). ............................................ 43 4.2.1. Quy trình ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae. ...... 43 4.2.2. Tiến hành phản ứng PCR ......................................................................... 45 4.2.3. Xác định trình tự nucleotide trong đoạn gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae. ............................................................................. 47 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 53 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 53 5.1.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae ................................ 53 viii 5.1.2. Phƣơng pháp ly trích DNA và kỹ thuật PCR ........................................... 53 5.1.3. Phƣơng pháp đọc trình tự gen Pr1 ........................................................... 53 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 53 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 56 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................ 59 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BXĐTG1 : Bọ xít đen Tiền Giang 1 BXĐTV7 : Bọ xít đen Trà Vinh 7 BXĐLA3 : Bọ xít đen Long An 3 BXĐLA8 : Bọ xít đen Long An 8 RBCQ915 : Rầy bông cúc Quận 9 15 RBCQ2 : Rầy bông cúc Quận 2 BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTV1 : Bọ dừa Trà Vinh 1 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4 BDLA8 : Bọ dừa Long An 8 SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.5 : Rầy nâu Bến Tre 1.5 ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar IPM : Intergrated pest management SDA : Soduim dedocyl sulphate RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Enzyme của một số loài nấm diệt sâu ................................................. 14 Bảng 2.2: Hoạt tính phân hủy chitin và protein của một số nấm diệt sâu ........... 15 Bảng 2.3: Sự liên quan giữa hoạt tính enzyme với độc tính diệt sâu .................. 16 Bảng 4.1: Nguồn nấm Metarrhizium anisopliae đƣợc thu thập ở một số địa phƣơng dùng trong thí nghiệm ........................................................... 41 Bảng 4.2: Các nguồn nấm Metarrhizium trên genbank đƣợc dùng để so sánh. .. 48 Bảng 4.3: So sánh trình tự nucleotid đoạn gen Pr1 của hai mẫu BXĐTG1, BXĐTV7 với các trình tự trên genbank. ............................................ 49 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau ....................................................................................................... 9 Hình 2.2: Chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae trên thị trƣờng: metanat – CE ...................................................................................... 10 Hình 2.3: Chu kỳ xâm nhập của nấm ký sinh trên côn trùng, Metarrhizium anisopiae ............................................................................................. 11 Hình 2.4: Sự xâm nhập của nấm trên lớp vỏ thân sâu rốm ở mức vi mô ............ 12 Hình 2.5: Mối bị nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh đƣợc chụp dƣới kính lúp sôi nổi ở độ phóng đại 40 lần .............................................................. 12 Hình 3.1: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ......................................................... 36 Hình 4.1: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên rầy nâu............................ 42 Hình 4.2: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên bọ dừa ............................ 42 Hình 4.3: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên sâu cuốn lá lúa ............... 42 Hình 4.4: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên bọ xít đen ....................... 42 Hình 4.5: Sự nảy mầm của bào tử nấm Metarrhizium anisopliae dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần ........................................................... 42 Hình 4.6: Khuẩn lạc nấm Metarrhizium anisopliae sau khi tách đơn bào tử...... 43 Hình 4.7: Kết quả ly trích DNA của các nguồn nấm Metarrhizium anisopliae .. 44 Hình 4.8: DNA của các nguồn nấm Metarrhizium anisopliae sau khi đƣợc xử lý với RNAse .......................................................................................... 44 Hình 4.9: Kết quả phát hiện gen Pr1 của các nguồn nấm qua PCR ................... 48 Hình 4.10: Hình cây phát sinh loài ...................................................................... 53 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Tình hình dân số ngày càng gia tăng, nhu cầu của con ngƣời sử dụng lƣơng thực ngày càng cao cả về số lƣợng và chất lƣợng. Do đó, mục tiêu đặt ra là sản xuất nông nghiệp phải đạt năng suất cao và ổ định. Để bảo vệ mùa màng khỏi bị các đối tƣợng dịch hại tấn công, ngƣời ta đã đƣa ra nhiều phƣơng pháp khác nhau trong đó phƣơng pháp sử dụng thuốc trừ sâu hóa học vẫn còn đang chiếm ƣu thế hiện nay. Tuy nhiên, việc sử dụng nhiều thuốc hoá học sẽ gây ra những hậu quả không mong muốn nhƣ ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ con ngƣời, gây ô nhiễm môi trƣờng, tăng tính kháng của dịch hại, tiêu diệt hệ thiên địch, phá vỡ mối cân bằng sinh thái trong tự nhiên, gây ra nhiều vụ bùng nổ về số lƣợng lớn sâu hại. Quan sát thực tế thấy rằng, ngoài tác dụng của thuốc hoá học gây chết côn trùng còn có nấm ký sinh cũng gây chết côn trùng. Các loại nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng, có hơn 700 loài nấm gây hại cho côn trùng hầu hết thuộc bộ Moniliales (Deuteromycetes) và bộ Entomophthorales (Phycomyces) gây bệnh cho hơn 90 loại côn trùng (Charley, 1989). Việc sử dụng vi sinh vật gây hại côn trùng để quản lý sâu hại là biện pháp sinh học lý tƣởng. Việc dùng biện pháp sinh học sẽ đem lại hiệu quả tốt và ít ảnh hƣởng đến môi trƣờng cũng nhƣ sức khoẻ con ngƣời. Do vậy, trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực này nhằm tạo ra một nền nông nghiệp sạch và bền vững. Trong các loài vi sinh vật gây hại côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ nấm bất toàn mà quan trọng là nấm Metarrhizium anisopliae - một trong các loài có tính diệt côn trùng mạnh nhất. Nói chung, trên thế giới nấm Metarrhizium anisopliae và một số loại nấm khác nhƣ Baeuveria bassiana, Normurea đã đƣợc nghiên cứu, sử dụng và thƣơng mại hóa từ lâu – nhƣ là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại sâu hại thuộc bộ cánh phấn (Lepidoptera), và cánh cứng (Coleoptera) trên nhiều loại cây trồng khác nhau. Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về đặc tính sinh học, khả năng gây độc, xác định sự đa dạng sinh học của nấm Metarrhizium anisopliae vẫn chƣa rộng và chỉ thực hiện 2 ở mức độ hình thái. Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên nhiều loại côn trùng của nhiều loại cây trồng khác nhau nhƣ trên sâu róm, sâu tơ, sâu khoang (ở miền Bắc); trên rầy nâu, bọ xít đen, sâu cuốn lá lúa, sâu cắn gié, sâu xanh da láng, sâu tơ, bọ dừa, rệp xáp, cào cào (ở miền Nam) (Phạm Thị Thuỳ và ctv, 2000). Trong chiều hƣớng tiến đến xây dựng một nền nông nghiệp hàng hoá với sản phẩm sạch và chất lƣợng cao, không ca ngợi và lạm dụng thuốc trừ sâu hoá học thì việc nghiên cứu sâu hơn về các loại nấm này cần đƣợc quan tâm. Từ khi Metarrhizium anisopliae có mặt ở khắp nơi, đòi hỏi phải có các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để xác định gen gây độc của chúng nhằm chọn lọc ra những chủng nấm Metarrhizium anisopliae có tính độc cao đảm bảo hoạt tính trừ sâu lâu dài và hiệu quả. Sự mô tả đúng và chính xác những loài nấm Metarrhizium anisopliae sẽ đánh giá đƣợc tầm quan trọng lớn nhất cho việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng nhƣ là tác nhân phòng trừ sinh học ở những loài côn trùng khác nhau. Một số kỹ thuật sinh học phân tử thật sự hữu hiệu trong việc nghiên cứu sâu hơn về loại nấm này đã đƣợc sử dụng nhiều nơi trên thế giới nhƣ kỹ thuật PCR phát hiện sự hiện diện của gen Pr1 (protease) của nấm Metarrhizium anisopliae; kỹ thuật RFLP, RAPD dùng để xác định sự đa dạng di truyền của gen gây độc Pr1 giữa những dòng nấm Metarrhizium anisopliae; đặc biệt là kỹ thuật sequencing có thể xác định đƣợc cụ thể trình tự nucleotide của đoạn gen gây độc này. Gen Pr1 là một chymoelastase, trở thành một yếu tố quyết định tác nhân gây bệnh. Pr1 đƣợc sản xuất ra để ức chế carbon catabolite, nitrogen metabolite ở lớp biểu bì côn trùng. Trên cơ sở chƣa có báo cáo khoa học nào trong nƣớc nghiên cứu sâu hơn về gen qui định tính độc và sự đa dạng di truyền bằng các phƣơng pháp phân tử hiện đại. Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài:”Xác định gen gây độc Pr1 và tính đa dạng di truyền đoạn gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae trên côn trùng gây hại.” 1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài 1.2.1. Mục đích Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay. 3 1.2.2. Mục tiêu Xác định gen Pr1 và tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae. 1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu Phân lập các dòng nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên nhiều loại côn trùng ở những cây trồng khác nhau. Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae bằng phƣơng pháp PCR. Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen gây độc Pr1. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Nấm Metarrhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau. 4 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay Dƣới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nông nghiệp với sản lƣợng cao, chất lƣợng tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hƣởng đến môi trƣờng, chúng ta phải tăng cƣờng sử dụng biện pháp sinh học một cách có hệ thống. Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nông lâm nghiệp theo định hƣớng tăng cƣờng sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc là một hƣớng nghiên cứu ứng dụng mới mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, bảo vệ môi trƣờng và cân bằng sinh thái. Có nhiều cách để sử dụng biện pháp sinh học, bao gồm: Sử dụng ký sinh thiên địch chuyên tính, thƣờng là ký sinh. Sử dụng ký sinh thiên địch không chuyên tính, thƣờng là các loài ăn thịt sâu hại. Biện pháp dòng hoá đực làm cho sâu hại không thể sinh sản đƣợc. Sử dụng vi sinh vật có ích. Biện pháp dẫn dụ giới tính để phòng trừ sâu hại. Biện pháp sinh học trong IPM giúp cho việc loại bỏ một số nhƣợc điểm của các biện pháp hoá học thƣờng dùng trƣớc đây. Ƣu điểm của biện pháp vi sinh vật gồm: Ngăn chặn sự phát triển tính kháng trong quần thể sâu bệnh và cỏ dại. Giảm bớt hoặc giảm hoàn toàn sử dụng thuốc hoá học, giữ đƣợc quần thể sâu hại phát triển ở mức thấp nhất, tránh bộc phát thành dịch. Bảo vệ đƣợc côn trùng có ích và các vi sinh vật có ích khác, hạn chế sâu bệnh thứ cấp trở thành sâu bệnh chính. Bảo vệ đƣợc sức khỏe con ngƣời và tránh ô nhiễm môi trƣờng (Trần Văn Mão, 2004). 2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng Cũng nhƣ vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng nhƣ sinh vật cộng sinh hoặc hoại sinh, nhƣng có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tƣợng bệnh lý và dẫn đến sự chết của côn trùng. Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng, 5 1981) nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên có thể gây chết thƣờng xuyên với tỷ lệ cao cho nhiều loài côn trùng gây hại và thật sự là những tác nhân điều hoà quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thƣờng, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn trùng. Cơ thể côn trùng chết do nấm không bị tan rã, mà thƣờng giữ nguyên hình dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 1981). Nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy sống dƣới nƣớc đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho côn trùng có mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deurteromycetes. - Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các loài ký sinh trên côn trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng nhƣ Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae. Những giống nấm ký sinh côn trùng quan trọng của nhóm nấm bậc thấp là: Coelosporidum Chytridiopsis (bộ Chytridiales) Coelomonyces (bộ Blastocladiales) và Entomophthora (bộ Entomophthorales). - Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là nội ký sinh của côn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là: Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales). - Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống có các loài gây bệnh trên côn trùng, đó là giống Septobasidium và Uredinella. - Lớp nấm bất toàn Deuteromycetes: Phần lớn các loài nấm bất toàn ký sinh côn trùng đều thuộc bộ Moniliades. Những giống Beauveria, Spicana, Metarrhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các loài nấm khi xâm nhiễm vào côn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định. 2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. Nấm này đƣợc Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì. Nấm thƣờng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất, thuộc vi sinh vật đất trong tự nhiên. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong. Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn 6 trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết. Nấm Metarrhizium anisopliae có 2 dạng: M. anisopliae var. major có bào tử dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9,0 (thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh (nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000). Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ: Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể nuôi cấy trên môi trƣờng thức ăn nhân tạo. Metarrhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm bệnh bởi Metarrhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Ngoài ra Metarrhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân bố rộng trong tự nhiên. M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng OA sau 10 ngày nuôi cấy ở 20 oC có đƣờng kính 2 cm. Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ). Ở những nơi không có côn trùng cũng phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông, 7 đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarrhizium anisopliae: Không thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất không có chitin. Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và O2 chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). Ở dƣới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra. Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. Metarrhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin (lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004). Danh mục côn trùng vật chủ nhạy cảm với nấm diệt sâu Metarrhizium anisopliae (Theo K. H. Veen 1968) (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Orthoptera Acrididae Acridium sp. Indonésia Roepke Anacridium aegyptium L. Egypte Natrass (1932) Melanoplus sp. USA Hyslop (1915) Schistocerca paraneusis Burm Argentine Marchionatto (1942) Gryllotalpidae Scapteriscus borelli G.T. Argentine Marchionatto (1942) Scapteriscus vicinus SCUD USA Hayslip (1943) Dermaptera Forficulidae Forficula auricularia L. USA Barss et Stearns (1925) 8 Hemiptera Miridae Heclopeltis sp. Java leefmans (1916) Pentatomidae Scotinophara lurida BURM Japon Katsumana (1930) Cercopidae Aeneolamia flavilatera U.R. Barbados James (1946) Aeneolamia postica walk Trinidad Rorer (1910) Cicididae Cicada sp. Java Von Hoehnel (1909) Cicada viridis STAL Maurice Balfour-Browne (1960) Flatidae Ormenis pygmaea F. Peurto Rico Camunas (1919) Phromnia marginella STAL Ceylon Balfuor-Browne (1960) Coccidae Cryptococcus sp. USA Charles (1941) Cryptococcus punctulatus USA Charles (1941) Pseudococcus maritimus Allemagne Ott (1960) Diptera Asilidae Plesiomma sp. Cuba Johnston (1918) Chironomidae Chironomus sp. USA Charles (1941) Tipulidae Tipula sp. France Veen (1968) Himenoptera Ichneumonidae Ambliteles sp. USA Rockwood (1950) Scoliidae Campsomeris quadrifascialta Philippines Balfuor-Browne (1960) 9 Coleoptera Bituridae Biturus unicolor SAY USA Charles (1941) Carabidae Colpodes japanicus Japon Kobayasi (1911) Hình 2.1: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau a: trên bọ xít xanh (bên phải) ( nguồn: - fftc – agnet – org). b: trên kiến lửa chúa (nguồn: - usda – ufl – edu –ifahi – pics - fireant – fungus - jpg.htm). 2.2.2. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghiệm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong a a b 10 vụ. Dùng nấm B. bassiana để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ 19 – 95% so với đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004). Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều. (Trần Văn Mão, 2004). Hình 2.2: Chế phẩm nấm Metarrhizium trên thị trƣờng: metanat - CE (nguồn: www.naturalrural.com.br/ fotos/metanat - ce.jpg) 2.3. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ không qua đƣờng miệng, mà qua lớp vỏ cơ thể, nghĩa là phải có sự tiếp xúc của nguồn nấm với bề mặt cơ thể vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh đƣợc. 11 Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng. Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nƣớc. Dƣới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Thí dụ, trƣờng hợp bào tử nấm Aspergillus trong ruột ong mật. Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhƣng rất ít. Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng là một quá trình phức tạp, gồm 3 giai đoạn chính sau đây: Hình 2.3: Chu kỳ xâm nhập của nấm ký sinh trên côn trùng, Metarrhizium anisopiae (nguồn: Charnley Keith) Sự xâm nhập Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng bằng sự xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin, theo cách này thì nấm tiết ra enzyme phân hủy lớp cutin để có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Ngoài ra nấm ký sinh côn trùng còn có thể xâm nhập gián tiếp vào cơ thể vật chủ qua thành ống tiêu hoá, qua lổ thở, qua vết thƣơng trên cơ thể côn trùng. Khoang máu biểu bì vỏ cutin sự xâm nhập vào ký chủ Bào tử dính chết do đói, sự đứt gãy về mặt vật lý, sự nhiễm độc, sự tự nhiễm độc sự phóng bào tử trên cơ thể côn trùng 12 Hình 2.4: Sự xâm nhập của nấm trên lớp vỏ thân sâu rốm ở mức vi mô (nguồn: Charnley Keith) Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục. Hình 2.5: Mối bị nấm Metarrhizium ký sinh đƣợc chụp dƣới kính lúp sôi nổi độ phóng đại 40 lần (nguồn: Võ Thị Thu Oanh, 2005) 13 Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấm gây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau. Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào tập tính của côn trùng vật chủ. 2.4. Hoạt tính sinh học Các nấm diệt sâu cũng đƣợc chú ý nhiều nhƣ một sinh vật sản sinh các enzyme, toxin và các chất hoạt tính sinh học khác. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine (ví dụ nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana, nấm Muscardine xanh: Metarrhizium anisopliae) có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn các enzyme: trong đó có ý nghĩa lớn nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chitinase, proteinase, lipase và amylase. Huber J. (1958) đã nghiên cứu kỹ enzyme của một số loài nấm diệt sâu, đƣợc nêu ở bảng 2.1 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). 14 Bảng 2.1 Enzyme của một số loài nấm diệt sâu Loài nấm Lipase Glucog enase Trip Xin Proteinase Urease Aspatainase Amylase Cordyceps militaris (Fri) Link M. anisopliae (Metch.) sork. B. bassiana (Bals) Will Asp. Flavus Link ex Fr + + + +++ - + - - - - - + + - + + + - + + + + + + + + +++ +++ Chú thích: Số lƣợng dấu +: tƣơng ứng mức độ hoạt tính của enzyme. Dấu -: không có enzyme. Qua bảng 2.1 cho thấy hầu hết các loài nấm diệt sâu đều có nhiều hệ enzyme khác nhau. Ali B.S. (1965) cho biết nấm Entomopthora coranata (Cost) Kevord, đƣợc phân lập từ rệp cây có tạo thành chitinase. Nấm này có thể phát triển trên chitin tinh khiết và sử dụng N. ascetylglucosamin là sản phẩm thủy phân từ Chitin. Huber (1958) đã tìm thấy lipase, amylase trong dịch nuôi cấy nấm Cordyceps militaris, Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Aspergillus Flavus. Benz G. (1965) cho biết tất cả các nấm ký sinh côn trùng đều có khả năng tiết một lƣợng lớn enzyme cần thiết để hòa tan Cutincum côn trùng. A. Samsinakova (1973) đã xác định hoạt tính phân hủy Chitine và Protein ở một số nấm diệt sâu và nêu sự liên quan giữa hoạt tính enzyme với độc tính diệt sâu của chúng (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). 15 Bảng 2.2: Hoạt tính phân hủy chitine và protein của một số nấm diệt sâu Nấm Hoạt tính phân hủy Chitne Hoạt tính phân hủy Protein N-acetylglucosamin trong mg/10ml NH2-N trong mg/10ml Gía trị vùng gelatin phân hủy (mm) B. bassiana N o 33 B. bassiana N o 40 B. bassiana N o 16 B. bassiana N o 12 B. tenella Pae. Farinosus N o 6 Pae. Farinosus N o 7 Pae. Farinosus N o 8 Pae. Heliathis Pae. Variotii M. anisopliae C. coccurum Asp. Parasiticus 75 70 40 35 48 4 5 16 - - 70 72 73 7,56 6,06 4,20 3,92 15,50 - 2,32 2,36 - - 9,8 - 18,48 9,5 9,0 6,0 4,3 24,0 2,0 3,0 2,6 - - 11,5 - 26,0 16 Bảng 2.3: Sự liên quan giữa hoạt tính enzyme với độc tính diệt sâu Nấm Chitinase Protease Lipase Độc tính 5 ngày sau khi nhiễm Galeria melonella B. bassiana N o 33 B. bassiana N o 40 B. bassiana N o 16 B. bassiana N o 12 B. tenella Pae. Farinosus N o 6 Pae. Farinosus N o 7 Pae. Farinosus N o 8 Pae. Heliathis Pae. Variotii M. anisopliae C. coccurum Asp. Parasiticus +++ +++ ++ ++ ++ + + + - - +++ +++ +++ ++ ++ + + +++ - + + - - ++ - +++ + + ++ ++ +++ + + + - - ++ - +++ +++ +++ + + ++ + + + - - +++ - +++ Chú thích: số dấu +: chỉ mức độ hoạt tính của enzyme và mức độ tƣơng quan giữa hoạt tính enzyme với độc tính diệt sâu. Dấu trừ -: không có enzyme và không có độc tính diệt sâu 17 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. 25.1. Nghiên cứu trong nƣớc Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarrhizium để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarrhizium sau khi đã thử nghiệm trong phòng, trong nhà lƣới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Hiện tại ở Việt Nam đã thu thập và lƣu giữ một số chủng nấm Beauveria và Metarrhizium, gồm 18 nguồn Beauveria và 10 nguồn Metarrhizium. Chúng đƣợc phân lập từ các loại côn trùng khác nhau, gồm sâu đo xanh, châu chấu hại cam, sâu khoang hại lạc, rầy nâu hại lúa, sâu đục thân ngô, sâu xanh hại bông, sâu cắn gié, bọ xít đen, bọ xít dài (Nguyễn Văn Tuất, 2000). Theo Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho các chủng Metarrhizium anisopliae là môi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu. Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau một năm xử lý. Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm , sản xuất và ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Ngoài ra, ở nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành. Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng – Hemiptera. 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Theo Juntin L. Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawsski và Ray M.Miller (1999), các nghiên cứu về các nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng từ 1995-1998, và cho biết trong 8 loài nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết 18 chết rầy mềm, gồm 6 loài thuộc Entomophthorales (Pandora neoaphidis, connidiobolus thromboides, C.coronatus, Entomophthora planchoniana và neozygites fresenii) và hai loài thuộc Hyphomycetes (Beauveria basssiana, Verticillium lecanii). Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm, 3mm, 4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì không đáng kể. Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố ở nấm Metarrhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể. 2.6. Vai trò của protease Pr1 Metarrhizium anisopliae có protease tổng hợp khác nhau và chất bài tiết có thể bám dính thích hợp cho phát triển của nấm trên biểu bì côn trùng. Phần lớn những protease này là acidic (điểm đẳng điện trong phạm vi 4,2 – 5,6) có tính đồng nhất cao hơn những trypsin động vật. Trình tự ở đầu NH2 của protease đƣợc nhận biết nhƣ là protease Pr1. Trình tự cơ bản thứ hai đƣợc nhận biết nhƣ carboxypeptidase. Những tính tƣơng đồng khác không đƣợc tìm thấy (Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004). Những enzyme tác nhân gây bệnh hội tụ ngoài tế bào có thể làm suy thoái cấu trúc polymer của biểu bì (protein, chitin và lipid) trong suốt giai đoạn phát sinh bệnh, giúp cho quá trình thâm nhập của nấm đƣợc dễ dàng và cung cấp những dinh dƣỡng cho nấm phát triển nhanh hơn. Sản phẩm của những enzyme làm phân hủy biểu bì này thì thƣờng đƣợc phân lập bởi sự nuôi cấy trên môi trƣờng chứa biểu bì hoặc chitin (Raymond và ctv, 1995). 2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 Phƣơng pháp PCR mô tả để nhận biết những giống Metarrhizium thích hợp cho việc sử dụng thí nghiệm đồng ruộng. Sử dụng kỹ thuật này, 40 giống Metarrhizium đƣợc phân ra 15 nhóm khác nhau. Kỹ thuật PCR này cho phép nhận dạng những giống 19 nấm, sử dụng bào tử nấm từ bề mặt của những côn trùng bị chết riêng lẻ bởi nấm hoặc những côn trùng chết độc lập với bên ngoài sợi nấm. Sản phẩm Pr1 – PCR từ hai giống Metarrhizium đã phát hiện ra gen Pr1 có ít nhất ba intron (Soraya và ctv, 1997). Những phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) có những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi hỏi số lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lƣợng mẫu có thể phân tích đƣợc trong thời gian thích hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mô tả đặc điểm những giống Metarrhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký chủ. Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của những giống Metarrhizium anisopliae lây nhiễm trên côn trùng. Đó là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease đƣợc tiết ra bởi Metarrhizium anisopliae, subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) và men cắt giới hạn các sản phẩm PCR này. Gần đây, nhiều kỹ thuật phân tử đã đƣợc sử dụng để thiết lập mối quan hệ dòng tộc trong phạm vi Metarrhizium, ví dụ nhƣ RFLP, phân tích so sánh chuỗi trình tự của rDNA và phân tích RAPD (sự khác biệt giữa các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ngẫu nhiên). Tuy nhiên những phƣơng pháp này chỉ thành công một phần trong việc cải tiến những kỹ thuật thích hợp cho sự nhận diện giống. RFLPs cũng phân biệt chƣa chính xác giữa những giống Metarrhizium anisopliae hoặc cung cấp rất ít thông tin về sự khác nhau giữa các mẫu phân lập. RAPD – PCR polymorphism thì nhìn chung đƣợc xem nhƣ là công cụ chẩn đoán hiệu quả để phân biệt những sinh vật khác, đã chỉ ra một ít biến đổi trong phạm vi Metarrhizium flavoviride khi kết hợp với Metarrhizium anisopliae, nhƣng vẫn còn chƣa đủ để cho phép nhận biết chính xác. RFLPs trong mDNA thì đƣợc sử dụng một cách rõ ràng để đáng giá mối quan hệ giữa loài và phân biệt những giống trong loài. Trong giống Metarrhizium anisopliae, chỉ có một báo cáo về marker mtDNA, nhƣng chỉ có 3 giống đƣợc thử nghiệm và dựa vào mức độ khác nhau giữa các loài nấm về khả năng ký sinh côn trùng (Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004). 20 2.8. Phản ứng PCR 2.8.1. Giới thiệu sơ lƣợc về PCR Kỷ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, biện pháp cắt mầm bệnh trên ngƣời, vật nuôi và thực phẩm. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thƣờng là 94oC – 95 oC trong vòng 30 giây – 4 phút. Bƣớc 2 (bƣớc lai, anealation): trong bƣớc này, ở nhiệt độ hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong