Xác định đột biến codon 249 của gen p53 ở
người bằng phương pháp PCR-RFLP và
giải trình gen
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon 7
của gen p53 là 110 bp(7). Trong trường hợp có đột
biến của codon 249 làm cho mất vị trí cắt của
enzym BsuRI. Do đó sản phẩm điện di sau phản
ứng cắt bằng enzym cắt hạn chế RE, dạng wt
đồng hợp tử có 2 băng sáng tại vị trí 74bp và
36bp, dạng đột biến dị hợp tử sẽ có 3 băng tại
110, 74 và 36 bp, còn dạng đột biến đồng hợp tử
sẽ chỉ có một băng sáng tại 110 bp.
Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại exon
7 của 22 trường hợp bệnh nhân. Tiến hành xác
định đột biến tại codon 249 bằng phương
pháp RFLP với enzyme HaeIII. Sử dụng thang
chuẩn ladder 50 bp để tính kích thước sản
phẩm PCR. Và kết quả là cả 22 mẫu đều cho
kết quả đồng hợp tử kiểu hoang dại với 2 băng
sáng tại vị trí 74 bp và 36bp, không phát hiện
có đột biến tại codon khảo sát. Để đảm bảo độ
tin cậy của PCR-RFLP, chúng tôi khẳng định
kết quả không có đột biến tại vị trí 249 của gen
p53 ở người bằng giải trình tự 7 mẫu (31,8%)
và cho kết quả phù hợp.
Trong khi đó, nghiên cứu của ShuangYuan Kuang và cộng sự tỉ lệ đột biến tại codon
249 là 26,5%(11); theo Mengsu Yang và cộng sự
là 33,3%(6).
Đột biến đặc trưng cho nhiễm AFB1 thường
liên kết với các gốc G ở những vùng giàu GC, dễ
hình thành nên biến đổi từ G thành T. Codon
249 trên gen p53 là vị trí có nhiều GC vì vậy rất
dễ hình thành đột biến tại vị trí này khi nhiễm
AFB1 và tần suất đột biến này tùy thuộc vào
mức độ phơi nhiễm AFB1 cho thấy vai trò gây
bệnh HCC của AFB1(10). Trong nghiên cứu này
không thấy đột biến tại hotspot 249 xuất hiện, có
thể các trường hợp HCC này chủ yếu có nguồn
gốc do viêm gan HBV mạn tính, không liên quan
đến phơi nhiễm lâu dài với aflatoxin B1
6 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 09/02/2022 | Lượt xem: 12 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xác định genotype, đột biến bcp của HBV và codon 249 của gen P53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân HCC, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015
Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 332
XÁC ĐỊNH GENOTYPE, ĐỘT BIẾN BCP CỦA HBV VÀ CODON 249
CỦA GEN P53 Ở NGƯỜI TRONG HUYẾT THANH
CỦA BỆNH NHÂN HCC
Đỗ Thị Thanh Thủy*, Lương Bắc An*, Vũ Diễm My*, Nguyễn Thị Cẩm Hường*, Phạm Thị Lệ Hoa*
TÓM TẮT
Mở đầu: Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một loại ung thư thường gặp, là nguyên nhân hàng đầu dẫn
đến tử vong ở các bệnh nhân ung thư. Nguyên nhân chính gây ung thư biểu mô tế bào gan, virus gây viêm gan
B, viêm gan C và aflatoxin B1 (AFB) chiếm 80% các trường hợp HCC ở người. Kiểu gen của HBV, đôt biến đôi
1762T/1764A ở vùng basal core promotor (BCP) của virus HBV và đột biến tại codon R249S của gen p53 ở người
được xem là những dấu ấn sinh học giúp tiên đoán khả năng mắc HCC ở bệnh nhân viêm gan do HBV và phơi
nhiễm aflatoxin B1.
Mục tiêu: Xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật PCR, phát hiện đột biến đôi 1762T/1764A ở vùng BCP
của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự và phát hiện đột biến codon R249S ở gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCR-
RFLP và giải trình tự.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 22 mẫu máu của bệnh nhân
được chẩn đoán là HCC có HBsAg (+) và HBV DNA > 1.000 IU/ml tại phòng khám viêm gan bệnh viện Đại học
Y Dược Tp.HCM. Thiết lập kỹ thuật xác định kiểu gen của HBV, phát hiện đột biến đôi tại vùng BCP bằng
phương pháp giải trình tự, phát hiện đột biến R429S của gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình
tự, phân tích kết quả bằng phần mềm tin sinh học.
Kết quả: Trong 22 trường hợp thỏa mãn tiêu chí của nghiên cứu, tỉ lệ nam/nữ = 2,1, có 9 trường hợp HBV
genotype B (41%), 13 trường hợp HBV genotype (59%). Phát hiện có 16 trường hợp mang đột biến tại
1762T/1764A của vùng BCP (72,7%), 6 trường hợp không có đột biến đôi này. Không phát hiện có đột biến tại
codon 249 của gen p53 ở người trong cả 22 trường hợp khảo sát trên.
Kết luận: Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật PCR, PCR-RFLP và kĩ thuật giải trình tự trong việc
phát hiện kiểu gen của HBV, đột biến đôi 1762T/1764A tại vùng BCP của HBV và đột biến tại vị trí thường gặp
R249S của gen p53 ở người trên bệnh nhân HCC. Bước đầu cho thấy HBV genotype C và đột biến đôi
1762T/1764A trên vùng BCP của HBV phổ biến ở bệnh nhân HCC. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu trên cỡ
mẫu lớn hơn nhằm xác định xem các đột biến này có là các dấu ấn tiên lượng khả năng mắc HCC ở bệnh nhân bị
viêm gan do HBV và phơi nhiễm aflatoxine B1.
Từ khóa: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation.
ABSTRACT
IDENTIFICATION OF GENOTYPE AND MUTATION AT BCP OF HBV AND MUTATION AT
CODON 249 OF HUMAN P53 IN SERUM OF HCC PATIENTS.
Do Thi Thanh Thuy, Luong Bac An, Vu Diem My, Nguyen Thi Cam Huong, Pham Thi Le Hoa
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 2 - 2015: 332 - 337
Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer, a leading cause of death in cancer
patients. The main causative agents of HCC- hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), and aflatoxin B1
* Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP. HCM
Tác giả liên lạc: PGS. TS.BS. Đỗ Thị Thanh Thủy ĐT: 0908487425 Email: thuyprenatal@gmail.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 333
(AFB) are responsible for about 80% of all HCCs in humans. Genotype of HBV, the double mutation 1762T/1764A
at the basal core promoter (BCP) of HBV and the mutation at codon R249S of human p53 are considered
biomarkers to help predict susceptibility to HCC in patients with HBV infection and aflatoxine B1 exposure.
Objective: Identify genotype of HBV by PCR, detect the double mutation 1762T/1764A at BCP of HBV by
sequencing, and detect the mutation at codon R429S of p53 gene by PCR-RFLP and sequencing.
Method: Descriptive cross-sectional study performed on 22 blood samples from HCC diagnosed patients
with positive HbsAg and HBV DNA > 1.000 UI/ml at Hospital of University Medical Center, HCMC. Setting
up techniques for identifying HBV genotype by PCR, detecting double mutations at BCP region by sequencing
and detecting R249S mutation at p53 human gene by PCR-RFLP and sequencing as well as result analysis by
bioinformatics software.
Result: In 22 cases met the criteria of our study, male/female = 2.1, there were 9 cases of HBV genotype B
(41%) and 13 cases of HBV genotype C (59%). We detected 16 cases carrying the double mutation 1762T/1764A
in BCP region (72.7%) and 6 cases with no mutation. We did not detect any case with the mutation at codon 249
of p53 human gene.
Conclusion: Our research successfully applied PCR, PCR-RFLP, and sequencing in detection of HBV
genotypes, double mutation 1762T / 1764A in the BCP region of HBV and the hotspot mutation at position 249 of
p53 human gene in HCC patients. Initially, the study showed that HBV genotype C and double mutation 1762T /
1764A in BCP region are common in patients with HCC. However, we need to look for mutations on a larger
sample size to determine if these mutations could be used as prognostic markers of susceptibility to HCC in
patients with hepatitis B and exposure aflatoxine B.
Key work: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát
(Hepatocellular Carcinoma- HCC) là một bệnh
lý ác tính của tế bào gan. Ở Việt Nam, số bệnh
nhân ung thư gan đứng hàng thứ ba sau ung thư
phổi, ung thư dạ dày ở nam và sau ung thư vú,
ung thư cổ tử cung ở nữ giới. Tại châu Á, có tới
75% trường hợp HCC do nhiễm virus viêm gan
B (HBV) và virus viêm gan C (HVC) mạn tính,
xơ gan(5,6). Theo WHO, Việt Nam được xếp vào
vùng lưu hành cao của nhiễm vi rút viêm gan B,
tỉ lệ nhiễm HBV ở Việt Nam trung bình vào
khoảng 15%, như vậy tính ra có khoảng 10-12
triệu người đang mang mầm bệnh. Theo Hội
gan mật Việt Nam năm 2013, Việt Nam là một
trong vài nước có tỉ lệ nhiễm bị HBV cao vào bậc
nhất thế giới. Theo một số nghiên cứu về HCC
tại Trung Quốc và các nước châu Phi, có sự xuất
hiện đột biến đôi trong vùng BCP (Basic Core
Promoter) gồm A thành T tại nucleotid 1762 và
G thành A tai nucleotid 1764 của HBV. Đột biến
tại vùng này có khả năng làm gia tăng nguy cơ
viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan. Vì
vậy, các đột biến này được coi là các dấu ấn sinh
học giúp theo dõi và phát hiện sớm các bệnh
nhân có nguy cơ bị ưng thư gan. Ngoài ra, việc
xác định genotype của HBV cũng liên quan đến
khả năng phát triển HCC(11), vì tại Việt Nam có 2
loại HBV genotype phổ biến là B và C, trong đó
nhiễm HBV genotype C là một yếu tố thuận lợi
dễ tiến triển thành viêm gan mạn, xơ gan và ung
thư gan. Bên cạnh nguyên gây HCC trên, người
ta còn đặc biệt chú ý tới độc tố aflatoxin được
sinh ra từ nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus
parasiticus(9,6). Có trên 17 loại aflatoxin khác nhau,
trong đó aflatoxin B1 (AFB1) có độc tính mạnh
nhất. Ước tính có khoảng 4,5 tỉ người trên thế
giới có nguy cơ phơi nhiễm với aflatoxin trong
thực phẩm(3,10). Các báo cáo dịch tễ cho thấy
AFB1 đóng vai trò quan trọng nhất trong tỉ lệ
người bị HCC. Gen p53 là gen ức chế khối u ở
người và thường có tần suất đột biến cao ở bệnh
nhân ung thư (hơn 50% trường hợp ung thư ở
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015
Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 334
người có đột biến ở gen này). Do vậy, gen p53
được xem là một trong các dấu ấn cho các xét
nghiệm ung thư. Hơn 50% bệnh nhân HCC phơi
nhiễm AFB1 có mang đột biến tại codon 249
(R249S) trên exon 7 của gen p53 gây sự biến đổi
amino acid Arg thành Ser(9,11). Đột biến hotspot
R249S được coi là một dấu ấn phản ánh ung thư
biểu mô tế bào gan do nhiễm AFB1. Việc tìm
hiểu về đột biến hotspot R249S của gen p53 ở
bệnh nhân HCC Việt Nam là cần thiết(8, 7).
Chính vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát
genotype, đột biến đôi vùng BCP của HBV, và
đồng thời phát hiện đột biến tại codon 249 của
gen p53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân
HCC bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như
PCR, giải trình tự gen để tìm hiểu về tỉ lệ của các
đột biến này cũng như kiểu gen HBV trong các
mẫu mô gan được chẩn đoán CT là HCC.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kế nghiên cứu
Mô tả cắt ngang. Lấy mẫu thuận lợi.
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân được chẩn đoán HCC có HbsAg
(+) từ tháng 1-2013 đến tháng 9-2014 tại bệnh
viện Đại học Y Dược.
Đối tượng loại trừ
Bệnh nhân được chẩn đoán HCC có
HbsAg (+) nhưng HBV ADN âm tính.
Phương pháp nghiên cứu
Định lượng ADN của HBV
Để xác định mẫu HBV (+) bằng kỹ thuật real
time PCR. Các mẫu được chọn khi có tải lượng
HBV > 1.000 UI/ml.
Kỹ thuật ly trích DNA từ huyết tương
ADN của HBV được tách chiết bằng bộ kit
BOOM theo nguyên lý là sử dụng Guanidine
thiocyanate (GuSCN) để ly giải hoạt tính của
nuclease, và các ADN từ HBV được phóng
thích sẽ bám vào các hạt silica, nhờ đó ADN từ
mẫu bệnh phẩm sẽ được tách chiết một cách
tinh khiết.
Mồi cho phản ứng
Mồi sử dụng để xác định kiểu gen B và C của
HBV được liệt kê tại bảng 1(4).
PCR xác định kiểu gen HBV
Sử dụng bộ kít Hot Start Taq Polymerase
của Takara. Tiến hành phản ứng PCR với các
mồi BGB2, BB1R và BC1R và chu kì nhiệt PCR:
98oC/3 phút; 45 chu kì với mỗi chu kì gồm 2
bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây; 1 chu kì
72oC/5 phút. Tiến hành điện di sản phẩm với
gel 3% ở 70V trong 40 phút có chứa ethidium
bromide. Sau đó đọc kết quả điện di nhằm xác
định kiểu gen.
PCR khuếch đại vùng BCP HBV
Các mẫu bệnh phẩm đã xác định được
genotype của HBV thì sẽ tiếp tục được khuếch
đại vùng BCP để xác định đột biến đôi tại A1762T
và G1764A. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi
BCF2 và BCR2 để khuếch đại vùng gen cần giải
trình tự với chương trình PCR như sau: 1 chu kì
98oC/3 phút; 40 chu kì gồm 3 bước: 98oC/10 giây,
60oC/30 giây, 72oC/1 phút; 1 chu kì 72oC/3 phút.
Tiến hành điện di sản phẩm với gel 2% ở 100V
trong 30 phút có chứa ethidium bromide.
Giải trình tự vùng BCP HBV
Sản phẩm PCR vùng BCP trên được tinh
sạch với bộ kit Illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification Kit (GE healthcare), bảo quản
sản phẩm tinh sạch tại nhiệt độ 4oC. Sau đó giải
trình tự đoạn gen bằng mồi BCF2 (bảng 2) bằng
hệ thống điện di mao quản 3130 xl với thuốc thử
ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle
Sequencing Ready reaction (AB, USA).
PCR khuếch đại Exon 7 của gen p53
Sử dụng bộ kít Hot Start Taq Polymerase của
Takara. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi
p53-7F và p53-7R để khuếch đại vùng exon 7 của
gen P53 ở người cần giải trình tự. Các mồi thực
hiện PCR được liệt kê trong bảng 3. Chu trình
nhiệt PCR như sau: 1 chu kì 98oC/3 phút; 40 chu
kì gồm 3 bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây,
72oC/20 giây; 1 chu kì 72oC/3 phút. Tiến hành
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 335
điện di sản phẩm với gel 3% ở 100V trong 30
phút có chứa ethidium bromide.
Bảng 1: Mồi xác định kiểu gen của virus HBV
Mồi Trình tự (5’-3’)
Mồi chung BGB2 GGC TCM AGT TCM GGA ACA GT
Genotype B BB1R CAG GTT GGT GAG TGA CTG GAG A
Genotype C BC1R GGT CCT AGG AAT CCT GAT GTT G
Bảng 2: Mồi sử dụng PCR và giải trình tự vùng
BCP HBV
Mồi Trình tự (5’-3’)
BCF2 AGC AAT GTC AAC GAC CGA CC
BCR2 AGT AAC TCC ACA GTA GCT CC
Bảng 3: mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự vùng
Exon 7 của gen p53(7).
Mồi Trình tự (5’-3’)
PCR-RFLP
p53-7F GTT GGC TCT GAC TGT ACC AC
p53-7R CTG GAG TCT TCC AGT GTG AT
PCR-
sequencing
p53-seq7F GGC CTC CCC TGC TTG CCA CA
p53-vu7R TGC AGG GTG GCA AGT GGC
TC
Cắt enzyme xác định đột biến tại codon 249
của gen p53
Sử dụng bộ cắt enzyme BsuRI (HaeIII) của
Thermo Scientific. Thực hiện phản ứng cắt theo
hướng dẫn của nhà sản xuất. Ủ sản phẩm cắt ở
37oC trong 1 giờ. Điện di sản phẩm cắt với gen
4% ở 70V trong 40 phút có chứa ethidium
bromide. Ngoài việc xác định đột biến tại vị trí
hotspot R249S của gen p53 bằng phương pháp
PCR-RFLP (restriction fragment length
polymorphysim – Đa hình chiều dài các đoạn cắt
hạn chế), chúng tôi khẳng định kết đột biến bằng
phương pháp giải trình gen vùng exon 7 của gen
p53 ở người.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trong 22 bệnh nhân của nhóm nghiên cứu,
bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 32 tuổi và bệnh nhân
lớn tuổi nhất là 69 tuổi. Số bệnh nhân nam lớn
gấp 2,1 lần so với số bệnh nhân nữ (15/7). Tất cả
các bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng mắc
ung thư biểu mô tế bào gan dựa trên kết quả CT
scan và tăng AFP máu.
Bảng 4 trình bày kết quả vầ kiểu gen, kiểu
đột biến đôi tại A1762T và G1764A của HBV và
kiểu đột biến tại vị trí hotspot R249S của gen
p53 ở người.
Bảng 4: Kiểu gen, kiểu đột biến đôi tại A1762C và
G1764T của HBV và kiểu đột biến tại vị trí hotspot
R249S của gen p53.
Bệnh
nhân
Giới
tính
Tuổi
Genotype
Đột biến
1762/1764
Đột biến
(codon 249)
1 Nam 69 B WT WT
2 Nữ 49 C MT WT
3 Nam 41 C MT WT
4 Nam 35 C MT WT
5 Nam 41 B MT WT
6 Nam 53 B MT WT
7 Nữ 55 B MT WT
8 Nữ 32 C MT WT
9 Nữ 43 C MT WT
10 Nam 52 B WT WT
11 Nam 57 B WT WT
12 Nam 55 C MT WT
13 Nam 55 C MT WT
14 Nữ 53 C WT WT
15 Nam 50 C MT WT
16 Nữ 35 B WT WT
17 Nam 50 C MT WT
18 Nam 53 C MT WT
19 Nam 39 C MT WT
20 Nam 48 B WT WT
21 Nữ 58 C MT WT
22 Nam 39 B MT WT
MT: mutation-đột biến WT: Wild type: thể hoang dại
Kiểu gen của HBV
Xác định kiểu gen của HBV bằng cách sử
dụng các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho
từng kiểu gen của virus. Xác định kiểu gen
chủ yếu dựa trên trình tự gen ở vùng gen S.
Đến nay đã có 10 loại genotype HBV được xác
định trên thế giới và được đặt tên từ A đến J,
dựa vào sự khác biệt của bộ gen từ 8% trở lên.
Trong đó, các genotype B, C và A phổ biến ở
các nước châu Á, còn ở Việt Nam, chỉ có 2 loại
genotype là B và C, trong đó genotype B gấp
ba lần so với genotype C(4).
Trong 22 mẫu HCC này, có 9 trường hợp
mang kiểu gen B (41%) và 13 trường hợp mang
kiểu gen C (59%). Như vậy ở các bệnh nhân
HCC, genotype C tương đối nhiều hơn so với
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015
Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 336
genotype B. Trong khi đó, theo một nghiên cứu
khảo sát của Cao Minh Nga và cộng sự ở bệnh
nhân nhiễm HBV thì tỉ lệ genotype B là 69,6% và
genotype C là 7,6%(1). Điều đó cho thấy những
bệnh nhân nhiễm HBV genotype C có khả năng
cao mắc HCC.
Đột biến đôi vùng BCP
Giải trình tự một vùng gen HbX có chứa
vùng BCP. Kết quả hiển thị trên CLC Main
Workbench cho thấy tín hiệu của từng
nucleotide thể hiện qua từng đỉnh sóng đều, tín
hiệu nền hầu như không bị nhiễu. Điều này
chứng tỏ sản phẩm của phản ứng PCR và giải
trình tự có độ tinh sạch cao, không bị tạp nhiễm,
kết quả phân tích là chính xác, khách quan và có
độ tin cậy cao. Kết quả giải trình tự vùng BCP
cho thấy có 15 trường hợp mang đột biến đôi
A1762T, G1764A (68,2%); 1 trường hợp mang đột
biến A1762C, G1764T (4,5%) và 6 trường hợp không
mang đột biến (27,3%). Tần suất đột biến của
nghiên cứu tương đương với nghiên cứu của
Shuang-Yuan Kuang và cộng sự(11). Một trường
hợp đột biến mới được tìm thấy đó là A1762C và
G1764T. Đột biến G1764T đã từng được biết đến
trong một nghiên cứu trước đó ở trẻ em mắc
HCC, làm tăng hoạt động của core promotor
khoảng 2-8 lần. Đột biến này được cho là hình
thành một vị trí giả định gắn yếu tố 3 trong sao
chép tại nhân tế bào gan (transcription factor
hepatocyte nuclear factor 3 – HNF3)(2). Đột biến
A1762C chưa thấy có báo cáo ghi nhận.
Đột biến tại vùng core promotor có thể ảnh
hưởng tới sự biểu hiện gen và sao chép của virus
HBV. Đột biến đôi A1762T và G1764A được mô tả ở
nhiều trạng thái nhiễm của HBV. Ý nghĩa sinh
học của đột biến đôi này vẫn đang được nghiên
cứu, đặc biệt có liên quan tới đột biến codon stop
tại vùng precore. Đột biến đôi tại BCP cho thấy ở
một số trường hợp nghiên cứu có HbeAg âm
tính, sự hiện diện của đột biến đôi này cho thấy
có sự ức chế điều hòa sản xuất của HBeAg. Đột
biến đôi làm giảm mức độ mRNA precore vì vậy
dẫn tới giảm sự hình thành HBeAg. Đột biến này
gây gia tăng tần số bệnh lý do HBV như viêm
gan kịch phát, viêm gan mạn tính có HBeAg và
anti-HBeAg dương tính, ung thư biểu mô tế bào
gan. Tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi về các
đột biến ở nhưng vùng địa lí khác nhau.
Hình 1: Đột biến tại vị trí 1762 và 1764.
Xác định đột biến codon 249 của gen p53 ở
người bằng phương pháp PCR-RFLP và
giải trình gen
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon 7
của gen p53 là 110 bp(7). Trong trường hợp có đột
biến của codon 249 làm cho mất vị trí cắt của
enzym BsuRI. Do đó sản phẩm điện di sau phản
ứng cắt bằng enzym cắt hạn chế RE, dạng wt
đồng hợp tử có 2 băng sáng tại vị trí 74bp và
36bp, dạng đột biến dị hợp tử sẽ có 3 băng tại
110, 74 và 36 bp, còn dạng đột biến đồng hợp tử
sẽ chỉ có một băng sáng tại 110 bp.
Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại exon
7 của 22 trường hợp bệnh nhân. Tiến hành xác
17
1762 1764
Sóng bình thường
Sóng đột biến
Sóng đột biến mới
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 337
định đột biến tại codon 249 bằng phương
pháp RFLP với enzyme HaeIII. Sử dụng thang
chuẩn ladder 50 bp để tính kích thước sản
phẩm PCR. Và kết quả là cả 22 mẫu đều cho
kết quả đồng hợp tử kiểu hoang dại với 2 băng
sáng tại vị trí 74 bp và 36bp, không phát hiện
có đột biến tại codon khảo sát. Để đảm bảo độ
tin cậy của PCR-RFLP, chúng tôi khẳng định
kết quả không có đột biến tại vị trí 249 của gen
p53 ở người bằng giải trình tự 7 mẫu (31,8%)
và cho kết quả phù hợp.
Trong khi đó, nghiên cứu của Shuang-
Yuan Kuang và cộng sự tỉ lệ đột biến tại codon
249 là 26,5%(11); theo Mengsu Yang và cộng sự
là 33,3%(6).
Đột biến đặc trưng cho nhiễm AFB1 thường
liên kết với các gốc G ở những vùng giàu GC, dễ
hình thành nên biến đổi từ G thành T. Codon
249 trên gen p53 là vị trí có nhiều GC vì vậy rất
dễ hình thành đột biến tại vị trí này khi nhiễm
AFB1 và tần suất đột biến này tùy thuộc vào
mức độ phơi nhiễm AFB1 cho thấy vai trò gây
bệnh HCC của AFB1(10). Trong nghiên cứu này
không thấy đột biến tại hotspot 249 xuất hiện, có
thể các trường hợp HCC này chủ yếu có nguồn
gốc do viêm gan HBV mạn tính, không liên quan
đến phơi nhiễm lâu dài với aflatoxin B1.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật
PCR, PCR-RFLP và kĩ thuật giải trình tự trong
việc phát hiện kiểu gen và đột biến của HBV,
cũng như đột biến hotspot tại codon G249T của
gen p53 ở người. Nghiên cứu bước đầu cho thấy
tỉ lệ HBV có genotype C trong mẫu huyết thanh
của bệnh nhân HCC chiếm tới 59%, và đột biến
đôi 1762T/1764A phát hiện khá phổ biến ở bệnh
nhân HCC 68,2%. Tuy nhiên, nghiên cứu chưa
tìm được đột biến tại codon 249 của gen p53 ở
người, cần có những nghiên cứu sâu và mở rộng
khảo sát phạm vi các đột biến và trên cỡ mẫu lớn
hơn nhằm xác định xem các đột biến này có là
dấu ấn sinh học giúp tiên lượng khả năng mắc
HCC ở bệnh nhân bị viêm gan mạn do HBV và
phơi nhiễm với aflatoxine B1.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Cao Minh Nga, et.al., 2011. Sự phân bố kiểu gen (genotype)
của virus viêm gan B (HBV) ở trẻ em nhiễm HBV. Tạp chí Y
học thành phố Hồ Chí Minh. Tập 15. Số 1.
2. Gerner, P., et.al., 1999. Hepatitis B virus core promoter
mutations in children with multiple anti-HBe/HBeAg
reactivations result in enhanced promoter activity. J Med Virol
59, 415-423.
3. Hamid, A.S., et al., 2013. Aflatoxin B1-induced hepatocellular
carcinomas in developing countries: Geographical
distributiton, mechanism of action and prevention. Oncol Lett.
5(4): p.1087-1092.
4. Hideo Naito, et.al., 2001. Rapid and specific genotyping
system for hepatitis B virus corresponding to six major
genotypes by PCR using type-specific primers. Journal of
clinical microbiology. 39(1), p. 362-364.
5. Masao Omata., et al., 2010. Asian Pacific Association for the
Study of the Liver consensus recommendations on
hepatocellular carcinoma. Hepatol Int 4:439–474.
6. Mengsu Yang, et.al.,1997. Mutations at codon 249 of p53 gene
in human hepatocellular carcinomas from Tongan, China.
Mutation research. 381. p:25-29.
7. Nikolaidou. A. et,al., 1993. Detection of hepatitis B virus DNA
and mutation in K-ras and p53 genes in human hepatocellular
carcinomas. International journal of oncology. 3. p.593-596.
8. Okuda, K., et al., 1985. Natural history of hepatocellular
carcinoma and prognosis in relation to treatment. Study of 850
patients. Cancer. 56(4): p.918-28.
9. Qi, L.N., et al., 2014. The p53 mutation spectrum in
hepatocellular carcinoma from Guangxi, China: role of chronic
hepatitis B virus infection and aflatoxin B1 exposure. Liver int
10. Stephanie villar, et.al., 2012. Aflatoxin-induced TP53 R249S
mutation in hepatocellular carcinoma in Thailand: Association
with tumor developing in the absence of liver cirrhosis. Plos
one. 7(6).
11. Shuang-Yuan Kuang, et.al., 2005. Hepatitis B 1762T/1764A
mutations, hepatitis C infection and codon 249 p53 mutations
in hepatocellular carcinomas from Thailand. Cancer epidemiol
biomarker and prevention, 14:380-384.
12. Yang, M., et al., (1997) Mutations at codon 249 of p53 gene in
human hepatocellular carcinomas form Tongan, China. Mutat
Res. 381(1): p.25-9.
Ngày nhận bài báo: 30/10/2014
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/10/2014
Người phản biện: TS. Bùi Chí Bảo
Ngày bài báo được đăng: 10/04/2015
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- xac_dinh_genotype_dot_bien_bcp_cua_hbv_va_codon_249_cua_gen.pdf