Xác định genotype, đột biến bcp của HBV và codon 249 của gen P53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân HCC

Xác định đột biến codon 249 của gen p53 ở người bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình gen Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon 7 của gen p53 là 110 bp(7). Trong trường hợp có đột biến của codon 249 làm cho mất vị trí cắt của enzym BsuRI. Do đó sản phẩm điện di sau phản ứng cắt bằng enzym cắt hạn chế RE, dạng wt đồng hợp tử có 2 băng sáng tại vị trí 74bp và 36bp, dạng đột biến dị hợp tử sẽ có 3 băng tại 110, 74 và 36 bp, còn dạng đột biến đồng hợp tử sẽ chỉ có một băng sáng tại 110 bp. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại exon 7 của 22 trường hợp bệnh nhân. Tiến hành xác định đột biến tại codon 249 bằng phương pháp RFLP với enzyme HaeIII. Sử dụng thang chuẩn ladder 50 bp để tính kích thước sản phẩm PCR. Và kết quả là cả 22 mẫu đều cho kết quả đồng hợp tử kiểu hoang dại với 2 băng sáng tại vị trí 74 bp và 36bp, không phát hiện có đột biến tại codon khảo sát. Để đảm bảo độ tin cậy của PCR-RFLP, chúng tôi khẳng định kết quả không có đột biến tại vị trí 249 của gen p53 ở người bằng giải trình tự 7 mẫu (31,8%) và cho kết quả phù hợp. Trong khi đó, nghiên cứu của ShuangYuan Kuang và cộng sự tỉ lệ đột biến tại codon 249 là 26,5%(11); theo Mengsu Yang và cộng sự là 33,3%(6). Đột biến đặc trưng cho nhiễm AFB1 thường liên kết với các gốc G ở những vùng giàu GC, dễ hình thành nên biến đổi từ G thành T. Codon 249 trên gen p53 là vị trí có nhiều GC vì vậy rất dễ hình thành đột biến tại vị trí này khi nhiễm AFB1 và tần suất đột biến này tùy thuộc vào mức độ phơi nhiễm AFB1 cho thấy vai trò gây bệnh HCC của AFB1(10). Trong nghiên cứu này không thấy đột biến tại hotspot 249 xuất hiện, có thể các trường hợp HCC này chủ yếu có nguồn gốc do viêm gan HBV mạn tính, không liên quan đến phơi nhiễm lâu dài với aflatoxin B1

pdf6 trang | Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 09/02/2022 | Lượt xem: 12 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xác định genotype, đột biến bcp của HBV và codon 249 của gen P53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân HCC, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 332 XÁC ĐỊNH GENOTYPE, ĐỘT BIẾN BCP CỦA HBV VÀ CODON 249 CỦA GEN P53 Ở NGƯỜI TRONG HUYẾT THANH CỦA BỆNH NHÂN HCC Đỗ Thị Thanh Thủy*, Lương Bắc An*, Vũ Diễm My*, Nguyễn Thị Cẩm Hường*, Phạm Thị Lệ Hoa* TÓM TẮT Mở đầu: Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một loại ung thư thường gặp, là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong ở các bệnh nhân ung thư. Nguyên nhân chính gây ung thư biểu mô tế bào gan, virus gây viêm gan B, viêm gan C và aflatoxin B1 (AFB) chiếm 80% các trường hợp HCC ở người. Kiểu gen của HBV, đôt biến đôi 1762T/1764A ở vùng basal core promotor (BCP) của virus HBV và đột biến tại codon R249S của gen p53 ở người được xem là những dấu ấn sinh học giúp tiên đoán khả năng mắc HCC ở bệnh nhân viêm gan do HBV và phơi nhiễm aflatoxin B1. Mục tiêu: Xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật PCR, phát hiện đột biến đôi 1762T/1764A ở vùng BCP của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự và phát hiện đột biến codon R249S ở gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCR- RFLP và giải trình tự. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 22 mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán là HCC có HBsAg (+) và HBV DNA > 1.000 IU/ml tại phòng khám viêm gan bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM. Thiết lập kỹ thuật xác định kiểu gen của HBV, phát hiện đột biến đôi tại vùng BCP bằng phương pháp giải trình tự, phát hiện đột biến R429S của gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự, phân tích kết quả bằng phần mềm tin sinh học. Kết quả: Trong 22 trường hợp thỏa mãn tiêu chí của nghiên cứu, tỉ lệ nam/nữ = 2,1, có 9 trường hợp HBV genotype B (41%), 13 trường hợp HBV genotype (59%). Phát hiện có 16 trường hợp mang đột biến tại 1762T/1764A của vùng BCP (72,7%), 6 trường hợp không có đột biến đôi này. Không phát hiện có đột biến tại codon 249 của gen p53 ở người trong cả 22 trường hợp khảo sát trên. Kết luận: Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật PCR, PCR-RFLP và kĩ thuật giải trình tự trong việc phát hiện kiểu gen của HBV, đột biến đôi 1762T/1764A tại vùng BCP của HBV và đột biến tại vị trí thường gặp R249S của gen p53 ở người trên bệnh nhân HCC. Bước đầu cho thấy HBV genotype C và đột biến đôi 1762T/1764A trên vùng BCP của HBV phổ biến ở bệnh nhân HCC. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn nhằm xác định xem các đột biến này có là các dấu ấn tiên lượng khả năng mắc HCC ở bệnh nhân bị viêm gan do HBV và phơi nhiễm aflatoxine B1. Từ khóa: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation. ABSTRACT IDENTIFICATION OF GENOTYPE AND MUTATION AT BCP OF HBV AND MUTATION AT CODON 249 OF HUMAN P53 IN SERUM OF HCC PATIENTS. Do Thi Thanh Thuy, Luong Bac An, Vu Diem My, Nguyen Thi Cam Huong, Pham Thi Le Hoa * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 2 - 2015: 332 - 337 Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer, a leading cause of death in cancer patients. The main causative agents of HCC- hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), and aflatoxin B1 * Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP. HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS.BS. Đỗ Thị Thanh Thủy ĐT: 0908487425 Email: thuyprenatal@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 333 (AFB) are responsible for about 80% of all HCCs in humans. Genotype of HBV, the double mutation 1762T/1764A at the basal core promoter (BCP) of HBV and the mutation at codon R249S of human p53 are considered biomarkers to help predict susceptibility to HCC in patients with HBV infection and aflatoxine B1 exposure. Objective: Identify genotype of HBV by PCR, detect the double mutation 1762T/1764A at BCP of HBV by sequencing, and detect the mutation at codon R429S of p53 gene by PCR-RFLP and sequencing. Method: Descriptive cross-sectional study performed on 22 blood samples from HCC diagnosed patients with positive HbsAg and HBV DNA > 1.000 UI/ml at Hospital of University Medical Center, HCMC. Setting up techniques for identifying HBV genotype by PCR, detecting double mutations at BCP region by sequencing and detecting R249S mutation at p53 human gene by PCR-RFLP and sequencing as well as result analysis by bioinformatics software. Result: In 22 cases met the criteria of our study, male/female = 2.1, there were 9 cases of HBV genotype B (41%) and 13 cases of HBV genotype C (59%). We detected 16 cases carrying the double mutation 1762T/1764A in BCP region (72.7%) and 6 cases with no mutation. We did not detect any case with the mutation at codon 249 of p53 human gene. Conclusion: Our research successfully applied PCR, PCR-RFLP, and sequencing in detection of HBV genotypes, double mutation 1762T / 1764A in the BCP region of HBV and the hotspot mutation at position 249 of p53 human gene in HCC patients. Initially, the study showed that HBV genotype C and double mutation 1762T / 1764A in BCP region are common in patients with HCC. However, we need to look for mutations on a larger sample size to determine if these mutations could be used as prognostic markers of susceptibility to HCC in patients with hepatitis B and exposure aflatoxine B. Key work: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát (Hepatocellular Carcinoma- HCC) là một bệnh lý ác tính của tế bào gan. Ở Việt Nam, số bệnh nhân ung thư gan đứng hàng thứ ba sau ung thư phổi, ung thư dạ dày ở nam và sau ung thư vú, ung thư cổ tử cung ở nữ giới. Tại châu Á, có tới 75% trường hợp HCC do nhiễm virus viêm gan B (HBV) và virus viêm gan C (HVC) mạn tính, xơ gan(5,6). Theo WHO, Việt Nam được xếp vào vùng lưu hành cao của nhiễm vi rút viêm gan B, tỉ lệ nhiễm HBV ở Việt Nam trung bình vào khoảng 15%, như vậy tính ra có khoảng 10-12 triệu người đang mang mầm bệnh. Theo Hội gan mật Việt Nam năm 2013, Việt Nam là một trong vài nước có tỉ lệ nhiễm bị HBV cao vào bậc nhất thế giới. Theo một số nghiên cứu về HCC tại Trung Quốc và các nước châu Phi, có sự xuất hiện đột biến đôi trong vùng BCP (Basic Core Promoter) gồm A thành T tại nucleotid 1762 và G thành A tai nucleotid 1764 của HBV. Đột biến tại vùng này có khả năng làm gia tăng nguy cơ viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan. Vì vậy, các đột biến này được coi là các dấu ấn sinh học giúp theo dõi và phát hiện sớm các bệnh nhân có nguy cơ bị ưng thư gan. Ngoài ra, việc xác định genotype của HBV cũng liên quan đến khả năng phát triển HCC(11), vì tại Việt Nam có 2 loại HBV genotype phổ biến là B và C, trong đó nhiễm HBV genotype C là một yếu tố thuận lợi dễ tiến triển thành viêm gan mạn, xơ gan và ung thư gan. Bên cạnh nguyên gây HCC trên, người ta còn đặc biệt chú ý tới độc tố aflatoxin được sinh ra từ nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus parasiticus(9,6). Có trên 17 loại aflatoxin khác nhau, trong đó aflatoxin B1 (AFB1) có độc tính mạnh nhất. Ước tính có khoảng 4,5 tỉ người trên thế giới có nguy cơ phơi nhiễm với aflatoxin trong thực phẩm(3,10). Các báo cáo dịch tễ cho thấy AFB1 đóng vai trò quan trọng nhất trong tỉ lệ người bị HCC. Gen p53 là gen ức chế khối u ở người và thường có tần suất đột biến cao ở bệnh nhân ung thư (hơn 50% trường hợp ung thư ở Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 334 người có đột biến ở gen này). Do vậy, gen p53 được xem là một trong các dấu ấn cho các xét nghiệm ung thư. Hơn 50% bệnh nhân HCC phơi nhiễm AFB1 có mang đột biến tại codon 249 (R249S) trên exon 7 của gen p53 gây sự biến đổi amino acid Arg thành Ser(9,11). Đột biến hotspot R249S được coi là một dấu ấn phản ánh ung thư biểu mô tế bào gan do nhiễm AFB1. Việc tìm hiểu về đột biến hotspot R249S của gen p53 ở bệnh nhân HCC Việt Nam là cần thiết(8, 7). Chính vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát genotype, đột biến đôi vùng BCP của HBV, và đồng thời phát hiện đột biến tại codon 249 của gen p53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân HCC bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, giải trình tự gen để tìm hiểu về tỉ lệ của các đột biến này cũng như kiểu gen HBV trong các mẫu mô gan được chẩn đoán CT là HCC. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Lấy mẫu thuận lợi. Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân được chẩn đoán HCC có HbsAg (+) từ tháng 1-2013 đến tháng 9-2014 tại bệnh viện Đại học Y Dược. Đối tượng loại trừ Bệnh nhân được chẩn đoán HCC có HbsAg (+) nhưng HBV ADN âm tính. Phương pháp nghiên cứu Định lượng ADN của HBV Để xác định mẫu HBV (+) bằng kỹ thuật real time PCR. Các mẫu được chọn khi có tải lượng HBV > 1.000 UI/ml. Kỹ thuật ly trích DNA từ huyết tương ADN của HBV được tách chiết bằng bộ kit BOOM theo nguyên lý là sử dụng Guanidine thiocyanate (GuSCN) để ly giải hoạt tính của nuclease, và các ADN từ HBV được phóng thích sẽ bám vào các hạt silica, nhờ đó ADN từ mẫu bệnh phẩm sẽ được tách chiết một cách tinh khiết. Mồi cho phản ứng Mồi sử dụng để xác định kiểu gen B và C của HBV được liệt kê tại bảng 1(4). PCR xác định kiểu gen HBV Sử dụng bộ kít Hot Start Taq Polymerase của Takara. Tiến hành phản ứng PCR với các mồi BGB2, BB1R và BC1R và chu kì nhiệt PCR: 98oC/3 phút; 45 chu kì với mỗi chu kì gồm 2 bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây; 1 chu kì 72oC/5 phút. Tiến hành điện di sản phẩm với gel 3% ở 70V trong 40 phút có chứa ethidium bromide. Sau đó đọc kết quả điện di nhằm xác định kiểu gen. PCR khuếch đại vùng BCP HBV Các mẫu bệnh phẩm đã xác định được genotype của HBV thì sẽ tiếp tục được khuếch đại vùng BCP để xác định đột biến đôi tại A1762T và G1764A. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi BCF2 và BCR2 để khuếch đại vùng gen cần giải trình tự với chương trình PCR như sau: 1 chu kì 98oC/3 phút; 40 chu kì gồm 3 bước: 98oC/10 giây, 60oC/30 giây, 72oC/1 phút; 1 chu kì 72oC/3 phút. Tiến hành điện di sản phẩm với gel 2% ở 100V trong 30 phút có chứa ethidium bromide. Giải trình tự vùng BCP HBV Sản phẩm PCR vùng BCP trên được tinh sạch với bộ kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE healthcare), bảo quản sản phẩm tinh sạch tại nhiệt độ 4oC. Sau đó giải trình tự đoạn gen bằng mồi BCF2 (bảng 2) bằng hệ thống điện di mao quản 3130 xl với thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA). PCR khuếch đại Exon 7 của gen p53 Sử dụng bộ kít Hot Start Taq Polymerase của Takara. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi p53-7F và p53-7R để khuếch đại vùng exon 7 của gen P53 ở người cần giải trình tự. Các mồi thực hiện PCR được liệt kê trong bảng 3. Chu trình nhiệt PCR như sau: 1 chu kì 98oC/3 phút; 40 chu kì gồm 3 bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây, 72oC/20 giây; 1 chu kì 72oC/3 phút. Tiến hành Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 335 điện di sản phẩm với gel 3% ở 100V trong 30 phút có chứa ethidium bromide. Bảng 1: Mồi xác định kiểu gen của virus HBV Mồi Trình tự (5’-3’) Mồi chung BGB2 GGC TCM AGT TCM GGA ACA GT Genotype B BB1R CAG GTT GGT GAG TGA CTG GAG A Genotype C BC1R GGT CCT AGG AAT CCT GAT GTT G Bảng 2: Mồi sử dụng PCR và giải trình tự vùng BCP HBV Mồi Trình tự (5’-3’) BCF2 AGC AAT GTC AAC GAC CGA CC BCR2 AGT AAC TCC ACA GTA GCT CC Bảng 3: mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự vùng Exon 7 của gen p53(7). Mồi Trình tự (5’-3’) PCR-RFLP p53-7F GTT GGC TCT GAC TGT ACC AC p53-7R CTG GAG TCT TCC AGT GTG AT PCR- sequencing p53-seq7F GGC CTC CCC TGC TTG CCA CA p53-vu7R TGC AGG GTG GCA AGT GGC TC Cắt enzyme xác định đột biến tại codon 249 của gen p53 Sử dụng bộ cắt enzyme BsuRI (HaeIII) của Thermo Scientific. Thực hiện phản ứng cắt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ủ sản phẩm cắt ở 37oC trong 1 giờ. Điện di sản phẩm cắt với gen 4% ở 70V trong 40 phút có chứa ethidium bromide. Ngoài việc xác định đột biến tại vị trí hotspot R249S của gen p53 bằng phương pháp PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphysim – Đa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế), chúng tôi khẳng định kết đột biến bằng phương pháp giải trình gen vùng exon 7 của gen p53 ở người. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Trong 22 bệnh nhân của nhóm nghiên cứu, bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 32 tuổi và bệnh nhân lớn tuổi nhất là 69 tuổi. Số bệnh nhân nam lớn gấp 2,1 lần so với số bệnh nhân nữ (15/7). Tất cả các bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng mắc ung thư biểu mô tế bào gan dựa trên kết quả CT scan và tăng AFP máu. Bảng 4 trình bày kết quả vầ kiểu gen, kiểu đột biến đôi tại A1762T và G1764A của HBV và kiểu đột biến tại vị trí hotspot R249S của gen p53 ở người. Bảng 4: Kiểu gen, kiểu đột biến đôi tại A1762C và G1764T của HBV và kiểu đột biến tại vị trí hotspot R249S của gen p53. Bệnh nhân Giới tính Tuổi Genotype Đột biến 1762/1764 Đột biến (codon 249) 1 Nam 69 B WT WT 2 Nữ 49 C MT WT 3 Nam 41 C MT WT 4 Nam 35 C MT WT 5 Nam 41 B MT WT 6 Nam 53 B MT WT 7 Nữ 55 B MT WT 8 Nữ 32 C MT WT 9 Nữ 43 C MT WT 10 Nam 52 B WT WT 11 Nam 57 B WT WT 12 Nam 55 C MT WT 13 Nam 55 C MT WT 14 Nữ 53 C WT WT 15 Nam 50 C MT WT 16 Nữ 35 B WT WT 17 Nam 50 C MT WT 18 Nam 53 C MT WT 19 Nam 39 C MT WT 20 Nam 48 B WT WT 21 Nữ 58 C MT WT 22 Nam 39 B MT WT MT: mutation-đột biến WT: Wild type: thể hoang dại Kiểu gen của HBV Xác định kiểu gen của HBV bằng cách sử dụng các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho từng kiểu gen của virus. Xác định kiểu gen chủ yếu dựa trên trình tự gen ở vùng gen S. Đến nay đã có 10 loại genotype HBV được xác định trên thế giới và được đặt tên từ A đến J, dựa vào sự khác biệt của bộ gen từ 8% trở lên. Trong đó, các genotype B, C và A phổ biến ở các nước châu Á, còn ở Việt Nam, chỉ có 2 loại genotype là B và C, trong đó genotype B gấp ba lần so với genotype C(4). Trong 22 mẫu HCC này, có 9 trường hợp mang kiểu gen B (41%) và 13 trường hợp mang kiểu gen C (59%). Như vậy ở các bệnh nhân HCC, genotype C tương đối nhiều hơn so với Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 336 genotype B. Trong khi đó, theo một nghiên cứu khảo sát của Cao Minh Nga và cộng sự ở bệnh nhân nhiễm HBV thì tỉ lệ genotype B là 69,6% và genotype C là 7,6%(1). Điều đó cho thấy những bệnh nhân nhiễm HBV genotype C có khả năng cao mắc HCC. Đột biến đôi vùng BCP Giải trình tự một vùng gen HbX có chứa vùng BCP. Kết quả hiển thị trên CLC Main Workbench cho thấy tín hiệu của từng nucleotide thể hiện qua từng đỉnh sóng đều, tín hiệu nền hầu như không bị nhiễu. Điều này chứng tỏ sản phẩm của phản ứng PCR và giải trình tự có độ tinh sạch cao, không bị tạp nhiễm, kết quả phân tích là chính xác, khách quan và có độ tin cậy cao. Kết quả giải trình tự vùng BCP cho thấy có 15 trường hợp mang đột biến đôi A1762T, G1764A (68,2%); 1 trường hợp mang đột biến A1762C, G1764T (4,5%) và 6 trường hợp không mang đột biến (27,3%). Tần suất đột biến của nghiên cứu tương đương với nghiên cứu của Shuang-Yuan Kuang và cộng sự(11). Một trường hợp đột biến mới được tìm thấy đó là A1762C và G1764T. Đột biến G1764T đã từng được biết đến trong một nghiên cứu trước đó ở trẻ em mắc HCC, làm tăng hoạt động của core promotor khoảng 2-8 lần. Đột biến này được cho là hình thành một vị trí giả định gắn yếu tố 3 trong sao chép tại nhân tế bào gan (transcription factor hepatocyte nuclear factor 3 – HNF3)(2). Đột biến A1762C chưa thấy có báo cáo ghi nhận. Đột biến tại vùng core promotor có thể ảnh hưởng tới sự biểu hiện gen và sao chép của virus HBV. Đột biến đôi A1762T và G1764A được mô tả ở nhiều trạng thái nhiễm của HBV. Ý nghĩa sinh học của đột biến đôi này vẫn đang được nghiên cứu, đặc biệt có liên quan tới đột biến codon stop tại vùng precore. Đột biến đôi tại BCP cho thấy ở một số trường hợp nghiên cứu có HbeAg âm tính, sự hiện diện của đột biến đôi này cho thấy có sự ức chế điều hòa sản xuất của HBeAg. Đột biến đôi làm giảm mức độ mRNA precore vì vậy dẫn tới giảm sự hình thành HBeAg. Đột biến này gây gia tăng tần số bệnh lý do HBV như viêm gan kịch phát, viêm gan mạn tính có HBeAg và anti-HBeAg dương tính, ung thư biểu mô tế bào gan. Tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi về các đột biến ở nhưng vùng địa lí khác nhau. Hình 1: Đột biến tại vị trí 1762 và 1764. Xác định đột biến codon 249 của gen p53 ở người bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình gen Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon 7 của gen p53 là 110 bp(7). Trong trường hợp có đột biến của codon 249 làm cho mất vị trí cắt của enzym BsuRI. Do đó sản phẩm điện di sau phản ứng cắt bằng enzym cắt hạn chế RE, dạng wt đồng hợp tử có 2 băng sáng tại vị trí 74bp và 36bp, dạng đột biến dị hợp tử sẽ có 3 băng tại 110, 74 và 36 bp, còn dạng đột biến đồng hợp tử sẽ chỉ có một băng sáng tại 110 bp. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại exon 7 của 22 trường hợp bệnh nhân. Tiến hành xác 17 1762 1764 Sóng bình thường Sóng đột biến Sóng đột biến mới Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 337 định đột biến tại codon 249 bằng phương pháp RFLP với enzyme HaeIII. Sử dụng thang chuẩn ladder 50 bp để tính kích thước sản phẩm PCR. Và kết quả là cả 22 mẫu đều cho kết quả đồng hợp tử kiểu hoang dại với 2 băng sáng tại vị trí 74 bp và 36bp, không phát hiện có đột biến tại codon khảo sát. Để đảm bảo độ tin cậy của PCR-RFLP, chúng tôi khẳng định kết quả không có đột biến tại vị trí 249 của gen p53 ở người bằng giải trình tự 7 mẫu (31,8%) và cho kết quả phù hợp. Trong khi đó, nghiên cứu của Shuang- Yuan Kuang và cộng sự tỉ lệ đột biến tại codon 249 là 26,5%(11); theo Mengsu Yang và cộng sự là 33,3%(6). Đột biến đặc trưng cho nhiễm AFB1 thường liên kết với các gốc G ở những vùng giàu GC, dễ hình thành nên biến đổi từ G thành T. Codon 249 trên gen p53 là vị trí có nhiều GC vì vậy rất dễ hình thành đột biến tại vị trí này khi nhiễm AFB1 và tần suất đột biến này tùy thuộc vào mức độ phơi nhiễm AFB1 cho thấy vai trò gây bệnh HCC của AFB1(10). Trong nghiên cứu này không thấy đột biến tại hotspot 249 xuất hiện, có thể các trường hợp HCC này chủ yếu có nguồn gốc do viêm gan HBV mạn tính, không liên quan đến phơi nhiễm lâu dài với aflatoxin B1. KẾT LUẬN Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật PCR, PCR-RFLP và kĩ thuật giải trình tự trong việc phát hiện kiểu gen và đột biến của HBV, cũng như đột biến hotspot tại codon G249T của gen p53 ở người. Nghiên cứu bước đầu cho thấy tỉ lệ HBV có genotype C trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân HCC chiếm tới 59%, và đột biến đôi 1762T/1764A phát hiện khá phổ biến ở bệnh nhân HCC 68,2%. Tuy nhiên, nghiên cứu chưa tìm được đột biến tại codon 249 của gen p53 ở người, cần có những nghiên cứu sâu và mở rộng khảo sát phạm vi các đột biến và trên cỡ mẫu lớn hơn nhằm xác định xem các đột biến này có là dấu ấn sinh học giúp tiên lượng khả năng mắc HCC ở bệnh nhân bị viêm gan mạn do HBV và phơi nhiễm với aflatoxine B1. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cao Minh Nga, et.al., 2011. Sự phân bố kiểu gen (genotype) của virus viêm gan B (HBV) ở trẻ em nhiễm HBV. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh. Tập 15. Số 1. 2. Gerner, P., et.al., 1999. Hepatitis B virus core promoter mutations in children with multiple anti-HBe/HBeAg reactivations result in enhanced promoter activity. J Med Virol 59, 415-423. 3. Hamid, A.S., et al., 2013. Aflatoxin B1-induced hepatocellular carcinomas in developing countries: Geographical distributiton, mechanism of action and prevention. Oncol Lett. 5(4): p.1087-1092. 4. Hideo Naito, et.al., 2001. Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers. Journal of clinical microbiology. 39(1), p. 362-364. 5. Masao Omata., et al., 2010. Asian Pacific Association for the Study of the Liver consensus recommendations on hepatocellular carcinoma. Hepatol Int 4:439–474. 6. Mengsu Yang, et.al.,1997. Mutations at codon 249 of p53 gene in human hepatocellular carcinomas from Tongan, China. Mutation research. 381. p:25-29. 7. Nikolaidou. A. et,al., 1993. Detection of hepatitis B virus DNA and mutation in K-ras and p53 genes in human hepatocellular carcinomas. International journal of oncology. 3. p.593-596. 8. Okuda, K., et al., 1985. Natural history of hepatocellular carcinoma and prognosis in relation to treatment. Study of 850 patients. Cancer. 56(4): p.918-28. 9. Qi, L.N., et al., 2014. The p53 mutation spectrum in hepatocellular carcinoma from Guangxi, China: role of chronic hepatitis B virus infection and aflatoxin B1 exposure. Liver int 10. Stephanie villar, et.al., 2012. Aflatoxin-induced TP53 R249S mutation in hepatocellular carcinoma in Thailand: Association with tumor developing in the absence of liver cirrhosis. Plos one. 7(6). 11. Shuang-Yuan Kuang, et.al., 2005. Hepatitis B 1762T/1764A mutations, hepatitis C infection and codon 249 p53 mutations in hepatocellular carcinomas from Thailand. Cancer epidemiol biomarker and prevention, 14:380-384. 12. Yang, M., et al., (1997) Mutations at codon 249 of p53 gene in human hepatocellular carcinomas form Tongan, China. Mutat Res. 381(1): p.25-9. Ngày nhận bài báo: 30/10/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/10/2014 Người phản biện: TS. Bùi Chí Bảo Ngày bài báo được đăng: 10/04/2015

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfxac_dinh_genotype_dot_bien_bcp_cua_hbv_va_codon_249_cua_gen.pdf