Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex pcr trên ba giống bò

TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài được tiến hành từ ngày 14-02-2005 đến ngày 06-07-2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đối tượng được nghiên cứu trong đề tài là ba giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan. Đây là những giống bò được nuôi phổ biến nhất ở Việt Nam và mang lại nguồn lợi lớn cho ngành chăn nuôi. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp multiplex PCR để xác định giới tính của chúng nhằm ứng dụng phương pháp này trong xác định giới tính của phôi ở các giống bò sau này. Kết quả đạt được như sau: 1. Ly trích được 54 mẫu DNA từ cơ vân và 10 mẫu DNA từ lông đuôi của ba giống bò. Trong đó, DNA từ cơ (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm lượng cao hơn DNA từ lông (1,49), thấp nhất từ ngọn lông (1,22). 2. Trong hai chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thử nghiệm, chu trình nhiệt I cho hiệu quả xác định giới tính kém hơn chu trình nhiệt II (0% so với 100%) khi tiến hành trên giống ta Vàng. Chu trình nhiệt I có thời gian ngắn hơn chu trình nhiệt II 3. Taq polymerase có nguồn gốc từ hãng ABgene và Bio-rad cho hiệu quả xác định giới tính cao hơn Taq có nguồn gốc từ hãng Promega (100% so với 0%) khi thí nghiệm trên giống ta Vàng. 4. Qui trình PCR với chu trình nhiệt I và Taq ABgene 1,5 UI có thể xác định giới tính trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100%. 5. 11 mẫu DNA cơ làm khô theo mức độ I cho hiệu quả PCR cao hơn 11 mẫu DNA cơ làm khô theo mức độ II (100% so với 20%). 6. Tỷ lệ thành công trong xác định giới tính bằng PCR trên 10 mẫu DNA lông thấp hơn rất nhiều so với tỷ lệ thành công trên 32 mẫu DNA cơ (20% so với 100%). MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìai Trang tựaii Lời cảm tạiii Tóm tắt khóa luậniv Mục lụcv Danh sách các chữ viết tắtvii Danh sách các bảngviii Danh sách các hình và biểu đồix PHẦN I. MỞ ĐẦU1 1.1 Đặt vấn đề1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu2 1.2.1 Mục tiêu2 1.2.2 Yêu cầu2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU3 2.1 Khái quát về nguồn mẫu chiết xuất DNA3 2.1.1 Đặc điểm về ngoại hình các giống bò3 2.1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA3 2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò3 2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò3 2.2 Cơ sở xác định giới tính4 2.2.1 Lịch sử khám phá cơ chế xác định giới tính tự nhiên ở động vật4 2.2.2 Sơ lược về NST giới tính5 2.2.2.1 Các gen trên NST Y6 2.2.2.2 Các gen trên NST X8 2.3 Các phương pháp xác định giới tính9 2.3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST9 2.3.2 Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên chuyên biệt giới tính10 2.3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính11 2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi11 2.3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR)12 2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính12 2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR13 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU15 3.1 Nội dung nghiên cứu15 3.2 Thời gian và địa điểm tiến hành15 3.3 Vật liệu15 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA15 3.3.2 Đoạn mồi15 3.4 Phương pháp tiến hành16 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu16 3.4.2 Ly trích DNA16 3.4.2.1 Ly trích DNA từ cơ16 3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông18 3.4.3 Multiplex PCR xác định giới tính19 3.4.3.1 Xây dựng qui trình PCR xác định giới tính bò19 3.4.3.2 Áp dụng qui trình PCR để xác định giới tính bò20 3.4.4 Điện di và quan sát sản phẩm PCR20 3.4.4.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5%21 3.4.4.2 Điện di sản phẩm PCR21 3.5 Xử lý số liệu21 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN22 4.1 Ly trích DNA22 4.1.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo hai mức độ làm khô22 4.1.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông22 4.1.3 Kết quả ly trích DNA từ gốc lông và ngọn lông23 4.2 PCR xác định giới tính25 4.2.1 Kết quả xây dựng qui trình PCR25 4.2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt25 4.2.1.2 Thử nghiệm ba loại Taq26 4.2.2 Áp dụng qui trình PCR28 4.2.2.1 Xác định giới tính của ba giống bò với DNA từ cơ28 4.2.2.2 Kết quả PCR với DNA từ cơ được phơi khô theo hai mức độ29 4.2.2.3 So sánh kết quả PCR trên DNA của cơ và lông30 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ32 5.1 Kết luận32 5.2 Đề nghị32 TÀI LIỆU THAM KHẢO33 PHỤ LỤC36 XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR TRÊN BA GIỐNG BÒ