Xác định hợp chất Polyphenol toàn phần có trong một số loại rau quả có tác dụng làm mịn da bằng phương pháp Folin-Ciocalteu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 193 XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT POLYPHENOL TOÀN PHẦN CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU QUẢ CÓ TÁC DỤNG LÀM MỊN DA BẰNG PHƯƠNG PHÁP FOLIN-CIOCALTEU Giang Thị Phương Anh*, Phan Thanh Dũng*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mục đích: Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần có trong các loại rau củ quả: cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông có trong bài thuốc làm đẹp da phổ biến trong dân gian hiện nay. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các loại rau, củ, quả như cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông được khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật; định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp Folin- Ciocalteu. Kết quả và bàn luận: Kết quả khảo sát cho thấy: Có nhiều carotenoid trong cà chua và cà rốt. Trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn có sự hiện diện của hợp chất polyphenol. Trong dịch chiết cồn ngoài sự hiện diện của proanthocyanidin còn có flavonoid.Đã khảo sát được điều kiện tối ưu để chiết xuất và xây dựng được phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần, trong cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông. Kết quả thẩm định qui trình cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại và đô chính xác cao (RSD < 4%); tỉ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép (85% - 110%). Kết luận: Đã xây dựng thành công qui trình định lượng polyphenol toàn phần có trong một số loại rau củ quả bằng phương pháp Folin Ciocalteu. Qui trình định lượng được thẩm định và áp dụng thành công trên một số loại rau củ quả như cà chua, khổ qua, ớt chuông, cần tây. Từ khóa: Folin Ciocalteu, ớt chuông, cà rốt, cà chua, khổ qua, cần tây ABSTRACT DETERMINATION OF TOTAL POLYPHENOL IN SOME VEGETABLES, TUBERS AND FRUITS FOLIN-CIOCALTEU METHOD Giang Thị Phương Anh, Phan Thanh Dung, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 193 - 197 Objective: To determination of total polyphenol components of some vegetables, tubers and fruits: tomato, carrot, celery, green pepper and bitter melon in a popular skin-care medication. Materials and methods: Some vegetables, tubers and fruits such as tomato, carrot, celery, bitter melon and green pepper were characterized for chemical components and quantification of the total polyphenol compounds by Folin-Ciocalteu method. Results and disscussion: Preliminary study of plant chemistry found the presence carotenoids in tomato and carrot. The aqueous and ethanol extracts contain polyphenol. The ethanol extrac contains proanthrocyanidine and also flavonoid. The optimized conditions for extracting and quantity determination of total polyphenol compound have been investigated. Validation results showed that the quantification method has good repeatability and accuracy with (RSD < 4%); recovery range from (85-110%) which is within acceptable limit. Conclusion: The quantification procedure for determination of total polyphenol in some vegetables, tubers * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phan Thanh Dũng ĐT: 0983 957158 Email: dungpharm@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 194 and fruits by Folin Ciocalteu method has been established. The procedure has been validated and succesfully applied for tomato, bitter melon, green pepper and celery. Key word: Folin Ciocalteu, green peppers, carrot, tomato, bitter melon, celery. ĐẶT VẤN ĐỀ Để giữ gìn tuổi trẻ và sắc đẹp thì ngoài việc ăn uống đầy đủ dinh dưỡng, xu hướng hiện nay của đa số chị em là sử dụng các sản phẩm dưỡng da, chống lão hóa. Trên thị trường hiện nay các sản phẩm làm đẹp rất đa dạng chủ yếu là các sản phẩm ngoại nhập. Rất khó phân biệt các sản phẩm thật, sản phẩm giả và cũng rất khó biết rõ tác dụng phụ của chúng đến đâu. Chính vì vậy, xu hướng làm đẹp da bằng các sản phẩm từ thiên nhiên đang được thịnh hành. Có rất nhiều bài thuốc dân gian làm đẹp da từ một số rau, củ, quả phổ biến dễ tìm, dễ chế biến như: dưa leo, cà chua, cà rốt, sữa chua, mật ong, trà xanh.v.vBài thuốc làm đẹp da phổ biến hiện nay gồm hỗn hợp các loại rau, củ, quả: cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông. Đề tài này góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của các loại rau củ quả có trong bài thuốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Dịch chiết cồn từ 5 loại rau, củ, quả: cà chua, cà rốt, cần tây, ớt chuông và khổ qua thu mua tại Đà Lạt. Chất đối chiếu: Pyrogallol 98,00%, Fluka, lot 1273740, Vitamin C 99,56%, Sanofi- Synthelabo VN (chuẩn làm việc, số kiểm soát: 100256-WS), Acid gallic 99,00%, Trung Quốc. Trang thiết bị Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 2550 với phần mềm UVProbe V. 1,11 (Japan). Phương pháp nghiên cứu Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật(3,9): Chiết các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn có độ phân cực tăng dần lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol (hay methanol) và nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. Định lượng hợp chất phenol toàn phần bằng phương pháp Folin-Ciocalteu(1,5,6,7,10): dựa trên sự khử của tungstat/molybdat trong thuốc thử Folin-Ciocalteu bởi hợp chất phenol/môi trường kiềm tạo ra sản phẩm có màu, đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại của sản phẩm thu được (phương pháp quang phổ) Thăm dò các điều kiện tối ưu để định lượng: tiến hành xác định độ ổn định của thuốc thử Folin Ciocalteu 1/10 và dung dịch natri carbonat 7,5%. Xác định bước sóng hấp thu cực đại của các dung dịch thử nghiệm. Xác định độ ổn định hấp thu quang của các dung dịch thử nghiệm. Khảo sát chiết xuất ở nhiệt độ phòng và ở 40 oC. Xác định thời gian siêu âm để chiết hoàn toàn hợp chất polyphenol trong mẫu thử. Xây dựng qui trình, thẩm định quy trình phân tích(2,4). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật(3,9) Bảng 1: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật Dược liệu Hợp chất xác định Cà chua Ớt chuông Cà rốt Cần tây Khổ qua Dịch chiết ether Carotenoid (TT H2SO4 đđ) +++ - +++ - - Dịch chiết cồn Flavonoid γ-pyron Anthocyanosid Proanthocyanidin +++ - ++ +++ - +++ - - + - - + - - + Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 195 Dược liệu Hợp chất xác định Cà chua Ớt chuông Cà rốt Cần tây Khổ qua - Polyphenol ++ ++ +++ ++ ++ Dịch chiết nước Proanthocyanidin +++ + + + + - Polyphenol ++ ++ +++ ++ ++ Ghi chú: (+): phản ứng có màu nhạt; (++): phản ứng có màu rõ; (+++): phản ứng có màu rất rõ; (-): phản ứng âm tính Kết quả khảo sát cho thấy trong dịch chiết ether có nhiều carotenoid trong cà chua và cà rốt. Trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn có sự hiện diện của hợp chất flavonoid và hợp chất polyphenol. Trong dịch chiết cồn ngoài sự hiện diện của proanthocyanidin như dịch chiết nước còn có flavonoid cấu trúc pyron. Định lượng hợp chất phenol toàn phần- phương pháp Folin-Ciocalteu Xác định dung môi chiết Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật dung môi để chiết hợp chất phenol trong các nguyên liệu sẽ là cồn vì chiết được nhiều hợp chất hơn so với nước. Khảo sát nhiệt độ và thời gian siêu âm Tiến hành khảo sát thời gian siêu âm từ 5- 60 phút và nhiệt độ từ 30 đến 45 0C. Kết quả cho thấy nhiệt độ chiết xuất tối ưu là 400 C và thời gian siêu âm tối ưu là 5 phút Khảo sát thời gian ổn định phản ứng màu Tiến hành khảo sát thời gian ổn định phản ứng màu từ 0-120 phút. Kết quả cho thấy, thời gian tối ưu từ 30-40 phút. Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại Bảng 2: Kết quả khảo sát bước sóng hấp thu cực đại Acid gallic Pyrogallol Cà chua Cà rốt (λmax /nm) 758 752 760 768 Cần tây Khổ qua Ớt chuông (λmax /nm) 746 748 753 Điều kiện tối ưu để định lượng Tiến hành khảo sát phương pháp chiết xuất, thời gian chiết, nhiệt độ chiết xuất, thời gian ổn định màu của phản ứng và bước sóng hấp thu cực đại của các nguyên liệu kết quả cho thấy điều kiện định lượng tối ưu như sau: - Mẫu được chiết với dung môi là cồn 50% bằng phương pháp siêu âm trong 5 phút. Nhiệt độ chiết xuất: 40 oC. Thời gian ổn định phản ứng màu: 30 - 40 phút. Đo quang ở bước sóng hấp thu cực đại: 750 nm. Kết quả thẩm định quy trình Bảng 3: Tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu Mẫu Nồng độ (mg/ml) Hệ số tương quan (R ≥ 0,99) Phương trình hồi quy Chuẩn gallic 0,01 - 0,1 0,9998 Ŷ = 10,3955 X + 0,0108 Chuẩn pyrogallol 0,01 - 0,1 0,9990 Ŷ = 13,721 X Cà chua 60 - 600 0,9963 Ŷ = 1,5083X + 0,066 Cà rốt 60 - 600 0,9930 Ŷ = 0,5049 X + 0,0285 Cần tây 120 - 1200 0,9937 Ŷ = 0,5936 X + 0,0296 Khổ qua 60 - 600 0,9919 Ŷ = 1,379 X + 0,1545 Ớt chuông 20 - 200 0,9974 Ŷ = 0,8697 X + 0,0622 ⇒ Có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và độ hấp thu. Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng Khoảng tin cậy 95% (n=5) Thêm chuẩn gallic Thêm chuẩn pyrogallol 80% 100% 120% 80% 100% 120% Cà chua 89,72 94,53 99,66 103,71 102,24 93,78 Cà rốt 94,00 91,26 98,63 86,04 89,28 91,91 Cần tây 89,74 89,12 92,74 92,83 92,79 91,37 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 196 Khoảng tin cậy 95% (n=5) Thêm chuẩn gallic Thêm chuẩn pyrogallol 80% 100% 120% 80% 100% 120% Khổ qua 108,51 108,50 108,99 103,72 106,45 102,14 Ớt chuông 101,10 98,11 95,84 94,74 89,27 90,33 Tỉ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép 85% - 110%. Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại RSD% (n=5) Thêm chuẩn gallic Thêm chuẩn pyrogallol 80% 100% 120% 80% 100% 120% Cà chua 1,2 2,6 2,5 2,2 3,5 2,8 Cà rốt 4,1 2,4 3,1 2,9 3,9 3,4 Cần tây 0,7 2,2 3,2 2,5 3,9 3,5 Khổ qua 2,1 0,6 1,3 3,7 3,2 4,2 Ớt chuông 2,4 3,1 3,9 2,9 3,2 2,9 Độ lặp lại nằm trong giới hạn cho phép ≤ 4%. Bảng 6: Kết quả độ lặp lại cùng ngày và khác ngày Hợp chất phenol toàn phần /100 g nguyên liệu tươi tính theo mg chuẩn gallic và pyrogallon (khoảng tin cậy 95%) Chuẩn gallic Chuẩn pyrogallol Nguyên liệu Cùng ngày Khác ngày Cùng ngày Khác ngày Cà chua 27,99 (1,0%) 25,15 (2,4%) 17,61 (1,0%) 15,87 (2,4%) Cà rốt 21,07 (2,8%) 22,58 (3,1%) 13,26 (2,8%) 14,25 (3,1%) Cần tây 9,41 (2,1%) 9,27 (2,0%) 6,00 (2,1%) 5,87 (2,0%) Khổ qua 22,58 (2,5%) 23,71 (1,1%) 14,21(2,5%) 14,96 (1,1%) Ớt chuông 56,51 (1,6%) 51,99 (2,7%) 35,56 (1,6%) 32,81 (2,7%) Phương pháp có độ lặp lại trên nguyên liệu tốt % RSD ≤ 4%. Quy trình định lượng - Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg acid gallic hoặc 25 mg pyrogallol vào bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml dung dịch cồn 50%, siêu âm để tan hoàn toàn. Để nguội, thêm dung dịch cồn 50% đến vạch. Đảo đều, được dung dịch có nồng độ 0,5 mg/ml (dung dịch S), bảo quản tránh ánh sáng. - Dung dịch thử: Cân 15 g (cà chua, cà rốt, khổ qua); 30 g cần tây vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm cồn 50% (lần 1-10 ml, lần 2-5 ml) và 5 g ớt chuông vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm cồn 50% (lần 1-10 ml, lần 2-10 ml). Siêu âm trong 5 phút ở 40 oC với cường độ 100%. Gạn dịch chiết. Gộp tất cả dịch chiết, để nguội, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 2 ml dịch lọc đầu, được các dung dịch thử (dung dịch T), bảo quản tránh ánh sáng. Bảng 7: Bảng thực hiện phản ứng xác định hợp chất phenol toàn phần Dung dịch thêm vào (ml) N Mẫu chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng Dung dịch ethanol 50% 0 0 1,0 Dung dịch S 1,0 0 0 Dung dịch T 0 1,0 0 TT F-C 1/10 5,0 5,0 5,0 Lắc rung để đồng nhất hỗn hợp. Để yên 5 phút trong tối ở nhiệt độ phòng. Dung dịch Na2CO3 7,5 % Điền đầy đến vạch 10 ml. Đảo đều. Lắc rung để đồng nhất hỗn hợp. Để yên trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đo hấp thu quang ở 750 nm. Công thức tính lượng hợp chất phenol toàn phần/ 100 g nguyên liệu tươi theo chuẩn gallic Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 197 hay pyrogallol (mg): t t mA fCmA X S SS × ×××× = 100 At, AS: độ hấp thu quang của thử và chuẩn, mS:khối lượng chuẩn (mg), CS: hàm lượng chuẩn tinh khiết (số mg chuẩn tinh khiết có trong 100 mg nguyên liệu). mt: khối lượng thử (g), f: hệ số pha loãng (f = 0,03 đối với cà chua, khổ qua và cần tây; f = 0,04 đối với nguyên liệu cà rốt và ớt chuông). Kết quả xác định hợp chất phenol toàn phần trong nguyên liệu Bảng 8: Kết quả xác định hợp chất phenol toàn phần (n = 6) Hợp chất phenol toàn phần/100 g nguyên liệu tươi được tính theo mg chuẩn Nguyên liệu Chuẩn gallic Chuẩn pyrogallol Cà chua 28,29 ± 0,30 (1,0%) 17,70 ± 0,19 (1,0%) Cà rốt 21,29 ± 0,62 (2,8%) 13,32 ± 0,39 (2,8%) Cần tây 9,41 ± 0,21 (2,1%) 6,00 ± 0,14 (2,1%) Khổ qua 22,83 ± 0,60 (2,5%) 14,28 ± 0,38 (2,5%) Ớt chuông 57,12 ± 0,93 (1,6%) 35,73 ± 0,68 (1,6%) KẾT LUẬN Đề tài đã khảo sát được sơ bộ thành phần hóa học trong các dược liệu cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông. Kết quả khảo sát cho thấy. Có nhiều carotenoid trong cà chua và cà rốt. Trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn có sự hiện diện của hợp chất flavonoid và hợp chất polyphenol. Trong dịch chiết cồn ngoài sự hiện diện của proanthocyanidin còn có flavonoid. - Đã khảo sát được điều kiện tối ưu để chiết xuất và xây dựng được phương pháp xác định hàm lượng hợp chất phenol toàn phần, trong cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông. Kết quả thẩm định qui trình cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại và đô chính xác cao; tỉ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép 85% - 110%. Áp dụng qui trình đã thẩm định xác định hàm lượng hợp chất polyphenol toàn phần, trong cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Doss A, Pugalenthi M, Rajendrakumaran D and Vadivel V (2010), Phenols, flavonoids and antioxidant activity of under- utilized legume seeds, Asian J.Exp. SCI 1(3): 700-705. 2. AOAC Guidelines for Single Laboratory (2002), Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals, pp. 13-22. 3. Bộ môn Dược Liệu (2008), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược TP. HCM, 26-42. 4. Ermer J, McB. Miller JH (2004), Method Validation in Pharmaceutical Analysis, A Guide to best Practice, Wiley- VCH. p. 418 5. Antolovich M et al (2002), “Methods for testing antioxidant activity”, Analyst 127 (1): 183-198. 6. Turkmen T et al. (2007),“Effect of extraction conditions on measured Total Polyphenol contents and Antioxidant and antibacterial activities of Black tea”, Molecules 12: 484-496. 7. Pham Thanh Quan, Tong Van Hang, Nguyen Hai Ha, Nguyen Xuan De, Truong Ngoc Tuyen (2006), “Microwave- assisted extraction of polyphenols from fresh tea shoot”, tạp chí phát triển KH&CN 9:70. 8. Burda S and Oleszek W (2001), “Antioxidant and antiradical activities of flavonoids”, J Agric Food Chem 49 (6):2774-2779. 9. Trương Văn Thiện (2008), Tổng hợp và khảo sát tác dụng chống oxy hoá in vitro của các dẫn chất Chrysin, luận văn Dược sỹ đại học, Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp. HCM. 10. Zhang Z, Jin J, Shi L (2008), Antioxidant activities of the derivaties of polysaccharide extracted from a Chinese medical herb (Ramulus mori), Food Sci.Technol. 14: 160-168. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014