Xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (lc-Ms/ms) - Lê Thị Hồng Hảo

116 Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 20, Số 2/2015 XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) Đến tòa soạn 25 – 1 – 2014 Lê Thị Hồng Hảo Viện Ki m nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia SUMMARY DETERMINATION OF OCHRATOXINS IN FOOD BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY – TANDEM MASS SPECTROMETRY (LC-MS/MS) Cereal are products essential in the our daily life However, cereals are prone to contamination by ochratoxins, which is toxic, carcinogenic and thermostable. A sensitive, reliable method was proposed for the determination of ochratoxins in food by high-performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The samples were firstly extracted and then cleaned up with an SPE C18 cartridge for LC-MS/MS analysis. Under the optimized conditions, the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for ochratoxins were 0,1 and 0,3 ng /mL, respectively. The recoveries of ochratoxins from cereal spiked at 2,5; 5 and 10 mg/kg ranged from 70 to 110%. The developed method was applied to the detection of 15 samples peanut, corn and 5 samples wine and 2 samples were contaminated by ochratoxins with levels below the newest legal limits. 1. MỞ ĐẦU Ochratoxins là một loại độc tố đƣợc sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (IRAC) thì ochratoxins đƣợc xếp vào loại chất có khả năng gây ung thƣ nhóm IIB. Độc tố này đã đƣợc phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng. Tại Việt nam, mức dƣ lƣợng tối đa cho phép Ochratoxin 117 trong ngũ cốc chƣa qua chế biến là 5µg/g, rƣợu vang là 2µg/g, ngũ cốc và bột ngũ cốc là 3µg/g, thực phẩm dành cho trẻ dƣới 36 tháng tuổi là 0,52µg/g. Hiện chƣa có quy định cụ thể nào về mức MRL cho ochratoxin B kể cả trong nƣớc và tiêu chuẩn Châu Âu (EN). Ochratoxin A Ochratoxin B Hình 1: Cấu trúc các Ochratoxins Trƣớc đây, phƣơng pháp thƣờng đƣợc áp dụng là ELISA, dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể đặc hiệu với ochratoxin đƣợc gắn lên bề mặt giếng nhựa polystryren. Tuy nhiên, phƣơng pháp này lại dễ bị dƣơng tính giả hoặc âm tính giả gây nhầm lẫn cho kết quả phân tích. Gần đây, có khá nhiều phƣơng pháp đƣợc áp dụng xác định ochratoxins nhƣ: sắc ký khí (Gas chromatography- GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (RF- HPLC) dùng cột ái lực miễn dịch (IAC) nhƣng mỗi phƣơng pháp đều cá những ƣu điểm và những hạn chế riêng. Hiện nay, phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ với những đặc điểm ƣu việt và độ chính xác cao đang đƣợc coi là phƣơng pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát hiện và định lƣợng nồng độ ochratoxin ở lƣợng vết hay siêu vết 1,2,3,4,5. 2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1 Hóa chất: Tất cả các loại hóa chất đều thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích dùng cho sắc ký của hãng Merck (Đức ): Acetonitril, methanol, n-hexan, acid acetic Các chất chuẩn đƣợc cung cấp bởi hãng Supelco. 2.2 Trang thiết bị : Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem. Cột sắc ký loại C18 (250mm x 4,6mm x 5µm) của Waters. Pha động gồm amoniacetate 10mM và methanol, tốc độ pha động 1,0 ml/phút. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ƣu điều kiện máy LC/MS/MS 3.1.1 Điều kiện khối phổ Điều kiện phân mảnh, điều kiện của nguồn và khí đƣợc tự động tối ƣu trên hệ thống MS thu đƣợc các ion con đặc trƣng (bảng 1) Mảnh ion con m/z có cƣờng độ lớn nhất đƣợc chọn dùng để định lƣợng, mảnh con thứ 2 có cƣờng độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích 118 Bảng 1: Các thông số tối ưu cho ESI-MS/MS Chất Ion mẹ Ion con DP (V) CE (V) CXP (V) Ochratoxin A 402 358 -100 -24 -25 166,9 -35 -25 Ochratoxin B 368 324 -24 -21 220 -32 -15 3.1.2 Điều kiện sắc ký: Ochratoxin A và B tách khỏi nhau khi đƣợc rửa giải theo chế độ gradient. Chƣơng trình gradient tối ƣu đƣợc đƣa ra trong bảng 2 .Các thu pic đƣợc cân đối các chất đƣợc tách ra khỏi nhau, pic thu đƣợc không bị tù, không bị chẻ Bảng 2: Chương trình gradient tối ưu Thời gian (phút) 0,01 4 6 6,01 10 % CH3COONH4 10mM 95 0 0 95 95 % MeOH 5 100 100 5 5 Nồng độ amoni acetat ảnh hƣởng đến khả năng tách và tín hiệu của các ochratoxin. Khảo sát nồng độ amoniacetat trong pha động trong khoảng 5mM – 0,1%. Khi nồng độ amoniacetate cao, số lƣợng ion đi vào buồng ion của detector MS tăng, gây cạnh tranh với các ion của chất phân tích, làm giảm tín hiệu. Đồng thời nồng độ muối cao sẽ gây hại đến hiệu lực và tuổi thọ của cột. Tại nồng độ amoniacetate 10 mM các chất đều cho tín hiệu cao nhất, hình dạng pic đẹp, không bị chẻ, doãng chân. 3.2. Tối ƣu h a điều kiện xử lý mẫu Tiến hành khảo sát quá trình chiết các ochratoxin: Cân chính xác khoảng 5g mẫu ngô đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 100 µl chuẩn hỗn hợp 100 ng/ml, thêm 30 ml CHCl3, lắc xoáy. Lấy lớp hữu cơ sang ống ly tâm khác, thêm 10ml NaHCO3 1%, lắc xoáy, ly tâm 6000v/p trong 3 phút. Lấy lớp nƣớc đem qua cột chiết pha rắn C18. Cột chiết pha rắn đƣợc hoạt hóa bằng 5ml MeOH, 5 ml H2O. Sau đó, cột chiết đƣợc rửa tạp bằng 2 ml H2O, 2 ml MeOH:H2O (6:4). Chất phân tích đƣợc rửa giải bằng 2 ml MeOH:CH3COOH (99,5:0,5, v/v). Dịch rửa giải đƣợc bơm vào hệ thống LC- MS/MS. Khảo sát các thể tích chloroform 5, 10, 15ml dùng cho quá trình chiết cho thấy:khi sử dụng 15,0ml CHCl3 ,chiết một lần, hiêu suất chiết đạt 64%-70%, nếu tiến hành lặp lại lần hai hiệu suất đạt 82%-84% , nếu tiếp tục chiết lần ba hiệu suất chiết cũng chỉ đạt 82%.Do đó để tiết kiệm dung môi, chọn chiết lặp 2 lần mỗi lần 15 ml CHCl3. Vì Ochratoxin có tính axit yếu nên chọn 2 loại cột để khảo sát: cột C18 và cột 119 Polydivinylbezen-N-vinylpyrolidon HLB Oasis (hydrophile lyophile balance). Kết quả chỉ ra rằng để chiết Ochratonin A, B việc sử dụng cột chiết pha rắn C18 thì tốt hơn so với cột oasis HLB (74-86%). Cột HLB nhồi các phân tử có hai đầu một đầu ƣa nƣớc, một đầu kỵ nƣớc nên có độ phân cực lớn hơn so với cột chiết C18. Trong khi Ochratoxin là chất ít phân cực nên nó bị lƣu giữ trên cột C18 tốt hơn cột HLB trong suốt quá trình nạp mẫu lên cột và quá trình rửa giải. Do đó, chọn cột chiết C18 để làm sạch dịch chiết. Khảo sát các thể tích rửa giải khác nhau là: 1, 2, 6 ml dung dịch MeOH-acid acetic (99,5:0,5, v/v). Dịch rửa giải 6 ml sẽ đƣợc đem thổi khô dƣới dòng khí N2, rồi hòa cặn 1 ml pha động đem đo máy. Kết quả cho thấy khi rửa giải với thể tích 2 ml dung dịch MeOH-acid acetic (99,5:0,5) hiệu suất thu hồi các chất phân tích là cao nhất. Ochratoxin có độ phân cực trung bình nên pH chiết ảnh hƣởng lớn đến khả năng chiết. Acid hóa mẫu bằng HCl để tạo các pH khác nhau từ 1-10. Kết quả cho thấy ochratoxins chỉ đƣợc chiết tốt vào cloroform trong môi trƣờng axit. Tại môi trƣờng pH=1-2 ochratoxins ở trạng thái đẳng điện, dạng cation và anion ngang bằng, dẫn đến khả năng phân cực giảm. Do đó giúp nó dễ tan vào trong các loại dung môi không phân cực nhƣ cloroform. Mặt khác việc axit hóa còn giúp làm ẩm cơ chất, giúp chiết mẫu vào môi trƣờng hữu cơ triệt để hơn. 3.3 Đánh giá phƣơng pháp Khoảng tuyến tính và đư ng chuẩn: Diện tích pic Ochratoxin tuyến tính với nồng độ trong khoảng 1-500 ng/ml với hệ số tƣơng quan R2 > 0,999. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp: Giới hạn phát hiện của các Ochratoxin là 0,1 ng/ml và giới hạn định lƣợng là 0,3 ng/ml Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi): Theo kết quả thực nghiệm hiệu suất thu hồi đạt 76% - 79%, hệ số biến thiên CV từ 7,2 - 11% tại 3 mức thêm chuẩn 2,5; 5; 10 ng/ml. Các kết thu đƣợc đáp ứng theo qui định của Châu Âu 2002/657/EC. 3.4 Phân tích mẫu thực Sau khi nghiên cứu các điều kiện tách chiết, chúng tôi tiến hành phân tích trên các mẫu thực khác nhau. Các mẫu chúng tôi tiến hành khảo sát bao gồm: ngũ cốc và các sản phẩm chế biến từ ngũ cốc và các loại rƣợu lên men. Các mẫu đƣợc đồng nhất, sau đó đƣợc đem cân và tiến hành phân tích nhƣ qui trình đã tối ƣu hóa ở trên. Mỗi mẫu tiến hành làm lặp lại 3 lần , lấy kết quả trung bình và tính độ lệch chuẩn. Chúng tôi đã tiến hành phân tích trên 20 mẫu rƣợu nhập ngoại lên men từ hoa quả, xuất xứ Chi Lê, Pháp, Colombia và các mẫu ngô, lạc lấy ngẫu nhiên trên địa bàn các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An. Kết quả phát hiện một số mẫu có chứa ochratoxin , B, tuy nhiên đều ở dƣới ngƣỡng cho phép. Hiệu suất thu hồi các mẫu thêm chuẩn đều nằm trong khoảng 70-110%. 120 Bảng 3: Kết quả phân tích mẫu thực tế STT Đối tƣợng m (g) /V(ml) Diện tích OTA Diện tích OTB C-OTA (ng/g. ng/ml) C-OTB (ng/g. ng/ml) 1 Rƣợu L'estaminet - Pháp 5 KPH KPH KPH KPH 2 Rƣợu Raiz - Chi Lê 5 KPH KPH KPH KPH 3 Rƣợu Mirabeau- Pháp 5 KPH KPH KPH KPH 4 Rƣợu Piraat - Bỉ 5 KPH KPH KPH KPH 5 Rƣợu Bordeaux -Pháp 5 KPH KPH KPH KPH 6 LN-BG-01 5,12 KPH KPH KPH KPH 7 LN-BG-02 5,24 KPH KPH KPH KPH 8 LN-BG-03 5,23 3500 KPH 3,9 KPH 9 LC-BG-04 6,12 KPH KPH KPH KPH 10 LN-BG-05 5,02 KPH KPH KPH KPH 11 LN-BG-06 5,95 KPH KPH KPH KPH 12 LN-TH-01 5,78 KPH KPH KPH KPH 13 LC-TH-02 5,21 KPH KPH KPH KPH 14 Ngo-TH-03 5,06 3700 1560 4,1 2,2 15 LN-TH-04 5,23 KPH KPH KPH KPH 16 LN-TH-05 5,62 KPH KPH KPH KPH 17 LN-NA-01 5,14 KPH KPH KPH KPH 18 LC-NA-02 5,42 KPH KPH KPH KPH 19 LN-NA-03 5,33 KPH KPH KPH KPH 20 LN-NA-04 5,27 KPH KPH KPH KPH Ghi chú: LN: lạc nhân, LC: lạc củ, BG: Bắc Giang, TH: Thanh Hóa, NA: Nghệ An 121 Kết quả phát hiện 2 mẫu có chứa ochratoxin , B, tuy nhiên đều ở dƣới ngƣỡng cho phép. Hiệu suất thu hồi các mẫu thêm chuẩn đều nằm trong khoảng 70-110%. XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample 7 (LN-BG-03-5.12g) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.6e5 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 I n t e n s i t y , c p s 7.30 XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample 7 (LN-BG-03-5.12g) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.6e5 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 I n t e n s i t y , c p s 7.30 XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample 7 (LN-BG-03-5.12g) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.1e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 I n t e n s i t y , c p s 8.62 7.07 Hình 2: Sắc đồ mẫu lạc có Ochratoxin A XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample 9 (ngo-TH-03-5.23) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.9e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.5e4 2.9e4 I n t e n s i t y , c p s 6.37 7.18 XIC of -MRM (4 pairs): 368.000/324.000 Da ID: OTB1 from Sample 9 (ngo-TH-03-5.23) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 2.9e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.5e4 2.9e4 I n t e n s i t y , c p s 6.37 7.18 XIC of -MRM (4 pairs): 402.000/358.000 Da ID: OTA1 from Sample 9 (ngo-TH-03-5.23) of DataSET1.wiff (Turbo Spray) Max. 1.8e4 cps. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 Time, min 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 1.8e4 I n t e n s i t y , c p s 6.61 6.97 Hình 3: Sắc đồ mẫu ngô có Ochratoxin A, B 4. KẾT LUẬN Từ các kết quả nghiên cứu đã lựa chọn đƣợc điều kiện phân tích phù hợp để tách và định lƣợng đồng thời 2 loại ochratoxin trong các loại ngũ cốc và sản phẩm từ ngũ cốc: Tối ƣu hoá điều kiện MS/MS, tối ƣu hoá điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao, khảo sát quy trình xử lý mẫu và thẩm định phƣơng pháp, áp dụng vào phân tích mẫu thực tế. Thực trạng nhiễm ochratoxins vẫn còn hiện hữu mặc dù đã có những cảnh báo về khả năng nhiễm độc và độc tính cao của loại độc tố này. Kết quả phân tích cho thấy có 2 mẫu nhiễm ochratoxins trong tổng số 20 mẫu (chiếm 10%). Các mẫu nhiễm ochratoxin đều nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế. Đặc biệt là sự có mặt của ochratoxin B – loại độc chất chƣa đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam và cũng chƣa có quy định nào về mức giới hạn cho phép của nó trong thực phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Joan M. Sáez , Ángel Medina, José V. Gimeno- delantado, Rufino Mateo, Misericordia Jiménez (2004), “Comparison of different sample treatments for the analysis of ochratoxin 122 A in must, wine and beer by liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 1029, pp. 125–133 2. Eduardo Beltrán, María Ibáñez, Juan Vicente Sancho, Miguel Ángel Cortés, Vicent Yusà , Félix Hernández (2011), “Simultaneous determination of aflatoxin M, ochratoxin A, zearalenoneanda-zearalenol in milk by UHPLC–MS/MS”, Food Chemistry, 126, pp.737–744 3.Mario Vega, Katherine Muñoz, Carolina Sepúlveda, Mario Aranda, Victor Campos, Ricardo Villegas Orialis Villarroel (2009), “Solid-phase extraction and HPLC determination of Ochratoxin A in cereals products on Chilean market”, Food Control, 20, pp. 631-634. 4.L.C. Huang, N. Zheng, B.Q. Zhen, F. Wen, J.B. Cheng, R.W. Han, X.M. Xu , S.L. Li J.Q. Wang (2013), “Simultaneous determination of aflatoxin M, ochratoxin A, zearalenoneanda-zearalenol in milk by UHPLC–MS/MS”, Food Chemistry, 146, pp. 242-249. 5.Lizhi Wang, Zhen Wang, Weiwei Gao, Juan Chen, Meihua Yang, Ying Kuang, Linfang Huang, Shilin Chen (2013), “Simultaneous determination of aflatoxin B and ochratoxin A in licorice roots and fritillary bulbs by solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography– tandem mass spectrometry”, Food Chemistry, 138, pp. 1048-1054. NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ XỬ LÝ 2,4-D.(tiếp theo tr.114) 7. Robert Zona, Sonja Solar, Knud Sehested (2012), OH-radical induced degradation of 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) and 4-chloro-2-methylphenoxyacetic acid (MCPA): A pulse radiolysis and gamma- radiolysis study, Radiation Physics and Chemistry, pp. 152–159, No 81. 8. Valerie J. Brown. Environmental Health Perspectives. Fe-TAML (2006): Catalyst for Cleanup, Vol.114, No.11. 9. Y.R. Wang, W. Chu (2012), Photo- assisted degradation of 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid by Fe(II)- catalyzed activation of Oxone process: The role of UV irradiation, reaction mechanism and mineralization, Applied Catalysis B: Environmental, pp.151– 161, No 123– 124.