Xác định sự đa dạng của các loài nấm mốc trên ống nhòm quân sự

Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 78 XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC LOÀI NẤM MỐC TRÊN ỐNG NHÒM QUÂN SỰ NGUYỄN THU HOÀI (1), CHU THANH BÌNH (1), NGÔ CAO CƯỜNG (1), ĐỖ THỊ THU HỒNG (1), ĐỖ TẤT THỊNH (1), VŨ QUỐC HẢI (2) 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và mưa nhiều của nước ta là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc, từ đó gây ảnh hưởng đến công tác duy trì và bảo dưỡng vũ khí, trang bị quân sự. Ống nhòm quân sự là một trong những trang bị phục vụ huấn luyện sẵn sàng chiến đấu của quân đội có khả năng bị nhiễm nấm trong quá trình sử dụng và bảo quản. Sự phá hủy và gây nhiễm của các chủng nấm mốc phụ thuộc vào đặc tính sinh học của các loài nấm khác nhau xuất hiện trên các chi tiết, linh kiện của ống nhòm mà chủ yếu trên bề mặt kính quang học. Sự sinh trưởng của nấm mốc trên bề mặt kính làm giảm độ truyền qua và tăng độ phân tán ánh sáng, từ đó hạn chế khả năng nhìn và phát hiện mục tiêu. Việc phân loại các loài nấm bằng hình thái, cấu trúc sinh bào tử được nhiều tác giả thực hiện, tuy nhiên phương pháp truyền thống không thể định tên được các loài không có cấu trúc sinh bào tử ở hầu hết các loài nấm thuộc ngành nấm đảm Basidiomycota. Bên cạnh đó, phương pháp sinh học phân tử PCR (Polymerase Chain Reaction) có thể sử dụng để khuếch đại các phân đoạn điển hình của DNA với ưu điểm có kết quả nhanh, chính xác về các loài nấm. Các đoạn rDNA thường được lựa chọn đọc trình tự nucleotide là: 5S rDNA, 5,8S rDNA,18S rDNA, 26S rDNA và ITS. Trong đó vùng ITS (internal transcribed spacer) được giải trình tự rộng rãi nhất trong giới nấm. ITS là vùng tiêu biểu trở thành đối tượng được quan tâm đối với nghiên cứu tiến hóa, phát sinh loài (Mitchell et al., 1995), trong đó cặp mồi ITS1F/ITS4 được sử dụng để khuếch đại (Gardes & Bruns, 1993; White et al., 1990). Những nghiên cứu này đã cung cấp nền tảng cho việc xác định nhanh và chính xác sự đa dạng của các chủng nấm. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng - Thu thập 15 mẫu ống nhòm bị nhiễm nấm ở cấp độ 5 tại một số kho bảo quản của Cục Quân khí ở Hòa Bình, Nghệ An và Biên Hòa để phân lập các chi nấm. - Sử dụng các chủng nấm phân lập trên mẫu kính bị nhiễm cho định danh các loài nấm dựa trên trình tự tương đồng với cặp mồi ITS1F/ITS4. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp lấy mẫu, phân lập: Các mẫu kính được xác định vùng bị nhiễm nấm, dùng tăm bông sạch đã khử trùng quết lên bề mặt kính bị nhiễm nấm (thấu kính, thị kính, lăng kính) và ria cấy trên các đĩa thạch chứa môi trường thích hợp cho nấm sinh trưởng. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, trong thời gian 48 ÷ 72 giờ. Sau đó các chủng nấm được tách riêng rẽ thuần khiết trên môi trường đặc trưng cho nấm. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 79 Phương pháp quan sát hình thái và cấu trúc sinh bào tử nấm: Chủng nấm thuần khiết được quan sát màu sắc khuẩn ty và hình thái cấu trúc cơ quan sinh bào tử (Katsuhiko Ando, 2003). Phương pháp tách DNA, PCR và điện di: Tách DNA của các chủng nấm phân lập bằng Kit (Fungi/Yeast DNA Extraction, Norgen/Canada); trình tự ITS rDNA (~ 570 bp) được khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi ITS1F (5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3’) (Gardes & Bruns, 1993) và ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (White et al., 1990). Chu trình PCR được chạy với chế độ nhiệt: 95°C/2 phút, 35 chu kỳ của 95°C/30 giây, 55°C/30 giây và 72°C/1 phút; 72°C/10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1% agarose, đệm TAE, 110 V, 15 phút. Gel điện di được nhuộm với edithidium bromide (5 mg/ml) trên máy soi gel Nyxtechnix/Mỹ. Giải trình tự và xử lý số liệu: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 - Avant Genetic Analyzer tại công ty 1st BASE (Singapore). Kết quả giải trình tự gen được kiểm tra bằng phần mềm phân tích BioEdit (ver.6.0.7, Mỹ), so sánh với trình tự ITS các loài đã được xác định trong ngân hàng gene (GenBank) bằng chương trình BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Định danh của các loài nấm thu được đã tham chiếu với hệ thống phân loại nấm (Hibbett et al., 2007). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập nấm mốc trên ống nhòm bị hỏng tại khu vực miền Bắc, miền Trung và miền Nam Các kho bảo quản ở Hòa Bình, Nghệ An, Biên Hòa là các địa điểm được khảo sát và lựa chọn mẫu ống nhòm có những dấu hiệu hư hỏng do nấm gây nên (mẫu ở cấp độ 5). Các địa điểm được khảo sát này có điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm khác nhau đặc trưng cho 3 miền Bắc, miền Trung, miền Nam. Tiến hành quan sát và thu 5 mẫu có dấu hiệu hỏng do nấm phá hủy với từng địa điểm khảo sát. Đã phân lập được 61 chủng nấm từ 15 mẫu tại 3 kho bảo quản (bảng 1). Bảng 1. Số lượng chủng nấm phân lập từ kính quang học nhiễm nấm cấp độ 5 Địa điểm lấy mẫu Loại ống nhòm, nơi sản xuất Số chủng xuất hiện Ghi chú HÒA BÌNH MB1_ON 8x30 (Hungari) 5 Tổng 22 chủng MB2_ NVA 7x40 (Đức) 4 MB3_B41 (Đức) 5 MB4_ON 7x50 (Đức) 4 MB5_ON 6x30 (Liên Xô) 4 NGHỆ AN MT1_ ON 15x50 (Liên Xô) 6 Tổng 23 chủng MT2_ ON 7x50 (Triều Tiên) 4 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 80 MT3_ ON 6x30 (Liên Xô) 4 MT4_ ON 6x30 (Hungari) 5 MT5_ ON 6x30 (Tiệp Khắc) 4 BIÊN HÒA MN1_ON D6 (Đức) 2 Tổng 16 chủng MN2_ ON 6x30 (Z133/VN) 3 MN3_ON 6x30 (Z133/VN) 5 MN4_ON 6x30 (Liên Xô) 3 MN5_ ON 6x30 (Liên Xô) 3 Dựa trên hình thái, màu sắc của khuẩn lạc nấm, đã xác định các chủng nấm xuất hiện trong từng mẫu kính riêng biệt với số lượng khác nhau, trong đó Hòa Bình - 22 chủng, Nghệ An - 23 chủng, Biên Hòa - 16 chủng. Số lượng chủng nấm tại các kho lấy mẫu ở miền Nam thấp hơn so với số lượng nấm của hai địa điểm miền Bắc và miền Trung trên hầu hết các kính có nguồn gốc sản xuất trong nước và ngoài nước. Để làm rõ sự khác biệt về số lượng cũng như thành phần các loài nấm xuất hiện trên kính nhiễm tại ba địa điểm lấy mẫu, đã phân loại bằng hình thái nhằm xác định các chi nấm đã được thực hiện. 3.2. Đa dạng các chi nấm của 3 địa điểm thu mẫu Sau khi các chủng nấm đã được phân lập và thuần khiết, hình dạng cấu trúc sinh bào tử, bào tử được so sánh trên kính hiển vi có độ phóng đại 40× (Katsuhiko Ando, 2003) để xác định thành phần chi, kết quả thu được ở bảng 2. Bảng 2. Đa dạng thành phần chi nấm phân lập trên mẫu kính nhiễm Địa điểm lấy mẫu Số mẫu nghiên cứu Đa dạng chi nấm Ký hiệu chi Số lượng chủng Tần suất xuất hiện* (%) Hòa Bình 5 Culvularia sp. 2 9,09 Paecilomyces sp. 2 9,09 Aspergillus sp. 8 36,36 Penicillium sp. 6 27,27 Chưa xác định 4 18,19 Nghệ An 5 Culvularia sp. 2 8,70 Aspergillus sp. 9 39,10 Penicillium sp. 1 4,35 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 81 Trichodesma sp. 1 4,35 Chaetomium sp. 1 4,35 Chưa xác định 9 39,10 Biên Hòa 5 Culvularia sp. 2 12,50 Aspergillus sp. 2 12,50 Cladosporium sp. 1 6,25 Trichodesma sp 1 6,25 Fusarium sp. 2 12,50 Chưa xác định 8 50,00 Chú thích (*): Dựa trên số lượng chi nấm phân lập trong các mẫu kính khác nhau, tính trên tổng số chi nấm thu được tại cùng địa điểm nghiên cứu. Các chủng nấm ở cả 3 địa điểm nghiên cứu được xác định bằng hình thái cho kết quả gồm hầu hết các chi nấm thuộc ngành Ascomycota như: Aspergillus, Penicillium, Culvularia, Paecilomyces, Chaetomium, Cladosporium, Fusarium. Đã xác định được thành phần các chi nấm bằng hình thái cấu trúc sinh bào tử cho 81,8% số chi nấm (Hòa Bình), 60,9% (Nghệ An) và 50% (Biên Hòa) (bảng 2). Tuy nhiên một số chủng nấm chưa xác định được bằng hình thái cấu trúc sinh bào tử do các chủng phát triển chủ yếu là thể sợi, điều này rất khó khăn trong việc xác định tên chi cho các chủng nấm. Kết quả bảng 2 cho thấy số lượng các chi nấm trên kính nhiễm chưa được xác định bằng hình thái chiếm đa số trên tổng số chủng nấm đã phân lập ở hai địa điểm Biên Hòa (chiếm 50%) và Nghệ An (chiếm 39,1%). Điều này có thể bước đầu khẳng định được các chi nấm phân lập được trên kính nhiễm tại hai địa điểm này có sự đa dạng đáng kể. Tại địa điểm Hòa Bình với số lượng chi nấm đã định tên bằng hình thái và cấu trúc có thể thấy chúng đa số thuộc nhóm nấm túi, có khả năng hình thành bào tử để có thể nhận biết sơ bộ các chi bằng hình thái cấu trúc sinh bào tử. 3.3. Giải trình tự ITS rDNA của các chủng nấm đã phân lập Để xác định tên cho các chủng nấm đến loài, ngoài việc sử dụng hình thái của các chủng nấm trên một trong những kỹ thuật được sử dụng ngày càng phổ biến để xác định thành phần loài nấm là giải trình tự đoạn 18S rDNA, vùng ITS rDNA (White et al., 1990; Mitchell et al., 1995; Liễu Như Ý và Trần Nhân Dũng, 2012). Dựa vào trình tự ITS, đặc trưng trên các loài nấm làm cơ sở cho việc xác định thành phần loài của các chi nấm, đã phân lập trên kính quang học tại 3 địa điểm nghiên cứu. Sử dụng Kit tách DNA của hãng Norgen/Canada, DNA được tách từ các chủng nấm và khuếch đại trình tự ITS rDNA, sử dụng cặp mồi ITS1F & ITS4 (White et al., 1990). Sản phẩm PCR đã kiểm tra trên gel agarose, có so sánh với thang chuẩn DNA (hình 1). Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 82 Hình 1. Sản phẩm PCR khuếch đại ITS rDNA chủng nấm bằng cặp mồi ITS1F & ITS4; M - Thang chuẩn DNA Kết quả trên hình 1 cho thấy sản phẩm PCR được khuếch đại từ DNA các chủng nấm đã có cùng một băng với kích thước tương ứng ~ 570 bp. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự. Sử dụng phần mềm Blast Search để so sánh với các trình tự ITS rDNA sẵn có trên ngân hàng dữ liệu Genbank, các chủng nấm đã được phân loại đến loài với trình tự tương đồng trên 99%. 3.4. Đa dạng thành phần loài nấm nhiễm trên kính bằng phân tích trình tự ITS rDNA So sánh trình tự ITS rDNA của các chủng nấm đã phân lập trên kính quang học với các loài nấm đã định danh trên ngân hàng GenBank có mức độ tương đồng trên 99%, tiến hành định tên các loài nấm và thành phần đa dạng của các loài nấm của cả 3 địa điểm lấy mẫu được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Đa dạng loài nấm mốc phân lập trên mẫu kính nhiễm ở ba địa điểm TT Mẫu kính Kết quả so sánh trên Blast Ngành HÒA BÌNH (07 chi, 13 loài) 1 HB1 Penicillium brevissimum_B01 Ascomycota 2 HB4, HB5 Penicillium ramusculum_B15 3 HB4 Penicillium brevissimum_B08 4 HB3, HB5 Penicillium oxalium_B07 5 HB2 Paecilomyces variotii_B04 6 HB1 Paecilomyces variotii_B02 7 HB1, HB3 Aspergillus tritici_B13 8 HB1, HB4 Aspergillus sydowii_B16 9 HB1, HB3 Aspergillus sydowii_B09 10 HB5 Aspergillus niger_ B10 11 HB3 Aspergillus flavus_B03 1000 bp 500 bp 570 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 83 12 HB2 Curvularia veruculosa_B05 13 HB3 Curvularia lunata_B14 14 HB2 Phomopsis sp. _B06 Basidiomycota 15 HB2 Coprinellus radians_B19 16 HB4, HB5 Perenniporia tephropora_B18 NGHỆ AN (12 chi, 16 loài) 1 NA2, NA3 Aspergillus flavus_T04 Ascomycota 2 NA1, NA4 Aspergillus sclerotium _T10 3 NA4, NA5 Aspergillus versicolor_T08 4 NA2, NA4 Aspergillus niger_ T02 5 NA1 Aspergillus versicolor_T18 6 NA4 Penicillium citrinum_T12 7 NA1 Curvularia sp._T01 8 NA3 Curvularia clavata_T05 9 NA5 Hypoxylon monticulosum_T22 10 NA3 Nigrospora sp._T06 11 NA5 Trichodesma harzianum_T14 12 NA1 Chaetomium globusum_T15 13 NA5 Lasiodiplodia pseudotheobromae_T13 14 NA4 Lasiodiplodia pseudotheobromae_T11 15 NA3 Coprinellus radians_T17 Basidiomycota 16 NA2 Coprinellus diseminatus _T19 17 NA1 Lentinus squarrosulus_T20 18 NA1 Phanerochaete chrysosporium_T16 19 NA2 Schyzophyllum commune_T03 BIÊN HÒA (10 chi, 10 loài) 1 BH1, BH2 Aspergillus fumigatus_N02 Ascomycota 2 BH3, BH4 Curvularia lunata_N05 3 BH3 Periconia byssoides_N06 4 BH3, BH4 Humicola grisea_N11 5 BH1, BH5 Fusarium roliferatum_N15 6 BH4 Trichodesma harzianum_N12 7 BH4 Acremonium sp._N10 8 BH3, BH5 Leptosphaerulina chartarum_N08 9 BH2 Cladosporium cladosporioides_N04 10 BH1, BH5 Agaricomycetes sp._N14 Basidiomycota Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 84 Tại 3 địa điểm Hòa Bình, Nghệ An, Biên Hòa các mẫu nấm mốc nhiễm trên ống nhòm cho thấy sự đa dạng đáng kể của thành phần các loài nấm. 61 chủng nấm phân lập được đều thuộc hai ngành nấm túi (Ascomycota) và ngành nấm đảm (Basidiomycota). Đặc điểm của hai ngành nấm này đều có hệ sợi nấm phát triển, điều này cho thấy mức độ nguy hiểm của chúng khi xuất hiện trên kính quang học làm hạn chế sự truyền qua của ánh sáng. Số lượng nấm nhiễm trên kính thu mẫu ở Nghệ An đa dạng hơn cả với 16 loài thuộc 12 chi; tiếp đó là ở Biên Hòa xuất hiện 10 loài thuộc 10 chi, Hòa Bình có 13 loài thuộc 7 chi. Kết quả ở bảng 3 cho thấy sự đa dạng về số lượng và chủng loài của các chi nấm thu được ở Nghệ An (khu vực miền Trung), điều này chứng tỏ với đặc điểm của bào tử hoặc hệ sợi nấm gây nhiễm trên bề mặt kính có khả năng tồn tại bền vững trên bề mặt vật liệu trong những điều kiện khắc nghiệt (khí hậu khô, nóng) và gây ảnh hưởng trực tiếp đến việc quan sát mục tiêu. Bên cạnh đó, với khu vực miền Bắc (Hòa Bình) có khí hậu đặc trưng của 4 mùa khí hậu trong năm, số lượng lớn các chủng nấm đều thuộc ngành nấm túi có hệ sợi nấm phát triển cùng với sự hình thành bào tử. Với đặc điểm này các bào tử khá bền vững và sẽ nảy mầm khi có điều kiện thuận lợi (độ ẩm, dinh dưỡng, nhiệt độ). 4. KẾT LUẬN - Đã thu được 61 chủng nấm xuất hiện trên 15 mẫu kính nhiễm nấm mốc tại các kho Cục Quân khí ở Hòa Bình, Nghệ An, Biên Hòa. - Bằng phân tích giải trình tự ITS rDNA (sử dụng cặp mồi ITS1F, ITS4) và so sánh với các trình tự tương đồng trên ngân hàng Genbank, đã xác định được thành phần loài nấm phá hủy trên ống nhòm quân sự tại 3 kho bảo quản thuộc hai ngành nấm túi (Ascomycota) và ngành nấm đảm (Basidiomycota). Trong đó, tại Nghệ An thu được 23 chủng nấm gồm 16 loài thuộc 12 chi; Biên Hòa phân lập được 16 chủng gồm 10 loài, 10 chi; Hòa Bình xuất hiện 22 chủng gồm 13 loài, 07 chi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Liễu Như Ý, Trần Nhân Dũng, Đa dạng di truyền một số loài nấm ăn dựa trên trình tự ITS (internal transcribed spacer), Tạp chí Khoa học, 2012, 22:18-25. 2. Gardes M., Bruns T., ITS primer with enhanced specificcity for basidiomycetes- application to the identification of mycorrhizae and rusts, Molecular Ecology, 1993, 2:113-118. 3. Hibbett et al., A higher - level phylogenetic classification of the Fungi, Mycological research, 2007, 111:509-547. 4. Katsuhiko Ando, Workshop on taxonomy and identification of fungi, 2003. 5. Mitchell J.I., Robert P.J., Moss S.T., Sequence or structure: a short review on the application of nucleic acid sequence information to fungal taxonomy, Mycologist, 1995, 9:67-75. Nghiên cứu khoa học công nghệ Tạp chí Khoa học và Công nghệ nhiệt đới, Số 09, 12 - 2015 85 6. White T.J., Bruns T., Lee S., Taylor J., Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, In: PCR protocols: a guide to methods and applications. (Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J., eds), Academic Press, San Diego, USA, 1990, p.315-322. SUMMARY IDENTIFYING THE DIVERSITY OF DIFFERENT FUNGI SPECIES ON MILITARY BINOCULARS In this study, sixty one fungi strains were isolated from fifteen fungi- contaminated binoculars samples in 3 storages in Hoa Binh, Nghe An and Bien Hoa. DNA of the strains was isolated and ITS rDNA region (~ 570 bp) was amplified by ITS1F/ITS4 primer pairs. The diversity of the fungus of the 3 places was found by comparing ITS rDNA sequences similar to the species on Genbank database. On contaminated binoculars in Nghe An we found 23 strains belonging to 16 species and 12 genus; In Bien Hoa and Hoa Binh 16 strains belonging to 10 species and 10 genus and 22 strains belonging to 13 species and 7 genus were identified. Từ khóa: ITS rDNA regions, classification, fungi, trình tự chuỗi ITS rDNA, phân loại, nấm. Nhận bài ngày 22 tháng 7 năm 2015 Hoàn thiện ngày 21 tháng 9 năm 2015 (1) Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga (2) Cục Quân khí, Tổng cục Kỹ thuật