Xác định tên khoa học của cây đinh lăng lá tròn bằng phương pháp giải trình tự gen RBCL

Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 148 XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY ĐINH LĂNG LÁ TRÒN BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN RBCL Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình và Trần Công Luận* Khoa Dược - Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô (Email: dvmai@tdu.edu.vn) Ngày nhận: 03/9/2019 Ngày phản biện: 17/9/2019 Ngày duyệt đăng: 24/9/2019 TÓM TẮT Dựa vào cơ sở hình thái thực vật thì khó phân biệt được loài và chưa đủ cơ sở khoa học để định danh đúng loài đối với một số loài thực vật có hình thái giống nhau. Trong các tài liệu về cây thuốc, tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn được xác định dựa vào hình thái thực vật là Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Mục tiêu nghiên cứu của đề tài nhằm phân tích đặc điểm hình thái, giải trình tự gen RBCL để xác định tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn. Mẫu lá Đinh lăng lá tròn được thu thập ở vườn dược liệu Trường đại học Tây đô. Kết quả giải trình tự đoạn gen RBCL của cây Đinh lăng lá tròn cho thấy có sự tương đồng trình tự gen của loài P. balfouriana (Andre) L.H.Bailey đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu đến 99%. Do đó, bằng phương pháp giải trình tự gen ADN đã xác định được tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn là Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Kết quả này giúp khẳng định tên khoa học của Đinh lăng lá tròn được định danh dựa trên cơ sở phân loại theo hình thái thực vật trước đây. Từ khóa: ADN, Đinh lăng lá tròn, Polyscias balfouriana, trình tự gen RBCL. Trích dẫn: Đỗ Văn Mãi, Thiều Văn Đường, Vũ Thị Bình và Trần Công Luận, 2019. Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn bằng phương pháp giải trình tự gen RBCL. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô. 07: 148-156. *PGS. TS. Trần Công Luận - Trưởng Khoa Dược & Điều dưỡng, Trường Đại học Tây Đô Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 149 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Đinh lăng thuộc chi Polyscias, trên thế giới có khoảng 150 loài, chủ yếu phân bố ở châu Phi, châu Á nhiệt đới, New Guinea, Thái Bình Dương (trừ Australia và New Zealand). Cây Đinh lăng có nguồn gốc ở Thái Bình Dương, lần đầu được phát hiện tại đảo Polynésie (Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh, 2015).Theo điều tra của Trung tâm Sâm Việt Nam ở các tỉnh phía Nam, Đinh lăng có 6 loài: Polyscias fruticosa (L) Harm, Polyscias balfouriana Bailey, Polyscias filicifolia (Merr et Fourn ) Bailey, Polyscias guilfeyleivar lacinita Bailey, Polyscias guilfeylei (Cogh et March) Bailey), Polyscias scutellarie (N.L.Burn) Fosberg (Nguyễn Thượng Dong và cs, 2007). Để xác định tên khoa học của một loài cây, có thể thông qua phân tích đặc điểm hình thái, so sánh với khóa phân loại thực vật hoặc phân tích mã gen ADN và so sánh với gen ADN gốc trong ngân hàng gen. Để khẳng định chính xác tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn, nghiên cứu được thực hiện qua phương pháp giải trình tự gen ADN của loài cây này. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Mẫu lá non của cây Đinh lăng lá tròn trồng ở vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô được thu thập để chiết và phân tích ADN giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen của loài thuộc chi Polyscias. Hình 1. Đinh lăng lá tròn Hóa chất ly trích DNA: CTAB Buffer (2% CTAB, 100 mM Tris pH 8.0, 20 mMEDTApH8.0,1.4MNaCl), β- mercaptoethanol, Chloroform: Isoamy- lalcohol (24:1), Enzyme RNase, Isopropanol, ethanol (70%). Tất cả hóa chất sử dụng trong thí nghiệm có nguồn gốc từ công ty Merck, Đức. Hóa chất PCR và điện di: PCRMix (NEXpro, Korea), PCR 2X MasterMix, agarose tinh khiết, thuốc nhuộm GelRed, TAE 1X, Loading dye 6x, Ladder 1 kb plus (Thermo Scientific, USA), TE, nước tinh sạch (nước cất 2 lần và đã qua thanh trùng ở 121oC trong 20phút). Thiết bị: Điện di ATTO CORPORATION AE 7344, máy điện di Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 150 gel Polyacrylamide ATTA Compact PAGE-Twin (ATTA, Nhật), máy PCR GeneAmp PCR System 2700 (Amplied Biosystems – Malaysia), máy đọc gel bằng tia UV (BioBlockScientific, Pháp). 2.2. Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp mô tả hình thái Quan sát và mô tả hình thái bên ngoài của cây Đinh lăng. Dựa vào phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có cải tiến, các bộ phận mô tả bao gồm: thân, lá * Tách chiết tổng số và tinh sạch ADN toàn phần được tách từ lá tươi theo quy trình tách chiết bằng phương pháp CTAB có cải tiến (Doyle and Doyle, 1990). Trước tiên cân 100 mg mẫu lá cây cho vào cối và tiến hành nghiền mịn trong 1 mL dung dịch CTAB 2X đã được ủ ở 65oC trong 15 phút. Cho mẫu đã được nghiền trong CTAB vào tuýp và cho thêm CTAB, chuẩn lên vạch 1,5 mL. Trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Sau khi ly tâm xong, rút lần lượt mỗi tuýp 1000 µL lớp dịch trong bên trên và cho vào tuýp mới. Sau đó thêm vào 10 µL β-mercapto- ethanol/tuýp. Tiến hành ủ ở nhiệt độ 65 oC trong 60 phút (mỗi 10 phút trộn đều mẫu 1 lần). Tiếp theo cho thêm vào mỗi tuýp 500 µL chloroform, trộn đều và đem ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Hút 750 µL phần dung dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó tiếp tục thêm vào 500 µL chloroform, trộn đều và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Chuyển 550 µL dung dịch bên trên và cho vào tuýp mới, sau đó thêm 500 µL chloroform vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Rút 350 µL lớp dịch bên trên cho vào tuýp mới, sau đó thêm 5 µL RNase vào mỗi tuýp, lắc đều và ủ mẫu ở nhiệt độ 37 oC trong 2 giờ. Sau 2 giờ ủ mẫu, tiếp tục thêm 300 µL CTAB 2X và 500 µL chloroform vào mỗi tuýp. Đem mẫu đi ly tâm 13000 vòng trong 10 phút. Tiếp theo rút mỗi tuýp 400 µL lớp dịch bên trên và cho vào tuýp mới, đồng thời thêm 400 µL isopropanol (tỉ lệ 1:1), trộn đều và ủ lạnh ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút. Mẫu được ly tâm 13000 vòng trong phút, tiến hành đổ bỏ cẩn thận phần dung dịch bên trên, giữ lại phần kết tủa lắng tụ bên dưới. Thêm 500 µL ethanol 70% vào mỗi tuýp và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút để rửa sạch mẫu, sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa. Thêm tiếp tục 500 µL ethanol 70% vào mỗi tuýp để rửa sạch mẫu lần hai và ly tâm 13000 vòng trong 5 phút. Sau đó đổ bỏ phần cồn và chừa lại kết tủa. Dùng micropipet hút sạch phần cồn còn sót lại trong mỗi tuýp và để mẫu khô (phơi dưới quạt trần) trong 1 giờ. Cuối cùng thêm vào mỗi tuýp 30 µL TE (pH = 8,0) để hòa tan ADN và trữ lạnh ở nhiệt độ -20 oC. * Khuếch đại ADN bằng phản ứng PCR Đoạn trình tự AND được khuếch đại sử dụng cặp mồi rbcLa-F: 5’- ATGTCACCACAAACAGAGACTAA AGC-3’ (Levin et al., 2003) và rbcLa-R: 5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’ (Kress and Erickson, 2007). Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 151 Chu trình nhiệt cho một phản ứng CPR: Thực hiện trong 35 chu kỳ gia nhiệt, bao gồm 5 phút ở 95 oC, 30 giây ở 95 oC, 30 giây ở 60 oC, 30 giây ở 72 oC, kéo dài chuỗi trong 5 phút ở 72 oC và sản phẩm được trữ ở 10 oC trong 20 phút. * Điện di ADN trên gel agarose ADN sau khi được ly trích và tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%. Sau khi điện di, gel được nhuộm bằng thuốc nhuộm redsafe (Biobasic, UK), và ghi nhận kết quả * Điện di sản phẩm PCR và giải trình tự Điện di sản phẩm PCR rồi tinh chế bằng bộ kit Wizard SV Gel và PCR Clean-up System (Promega). Dựa theo phương pháp Sanger (Sanger et al., 1977). Mỗi loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau. Nhờ vậy tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một dideoxynucleotid sẽ có cùng một màu. ADN được giải trình tự bởi công ty Phù Sa Biochem (thành phố Vĩnh Long) trên máy đọc trình tự tự động. * Phân tích số liệu và so sánh trình tự ADN Trọng lượng phân tử được tính toán bằng phần mềm Gel Analyzer. Kết quả giải trình tự được lưu trữ ở dạng FASTA và phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên bản cập nhật mới nhất 7.0.5 (Hall, 1999). Sau đó bằng phương pháp BLAST trên hệ thống ngân hàng gene NCBI (National Center for Biotechnology Information) dùng cho việc nhận diện loài. 3. KẾT QUẢ * Đặc điểm hình thái cây Đinh lăng lá tròn Cây bụi cao, có mùi thơm. Thân màu đồng thanh lốm đốm những điểm xám. Lá kép thường mang 3 lá phụ trên một cuống dài, lá phụ đầu đôi khi xuất hiện những lá có kích thước lớn hơn những lá phụ còn lại; phiến lá tròn, hình tim ở gốc đầu tà, xanh đậm, không lông, bìa có răng nhọn, khía tai bèo, viền mép hoặc có vân trắng; gân lá hình chân vịt, cuống phụ 1 cm; cuống có đáy thành bẹ, ôm thân. Chùm tụ tán mang tán to 1 – 1,5 cm. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 152 Hình 2. Hình thái Đinh lăng lá tròn Kết quả về hình thái của cây Đinh lăng lá tròn tương tự như mô tả trong tài liệu tham khảo (Phạm Hoàng Hộ, 2003). Mẫu lá tươi cây Đinh lăng được chiết xuất, phân tách ADN, giải trình tự gen, so sánh với mẫu trình tự gen đã công bố của các loài thuộc chi Polyscias cho kết quả như sau: * Tách chiết ADN tổng số và thực hiện phản ứng nhân gen PCR ADN tổng số sau khi tách được điện di trên gel agarose 1% cho vạch ADN rõ, băng điện di sạch, không lẫn ARN. ADN tổng số sau khi thực hiện phản ứng nhân gen với đoạn rbcL được điện di so sánh với thang ladder chuẩn 1000 bp, cho thấy kích thước đoạn trình tự thu được vào khoảng 600 bp. Vạch sản phẩm trên băng điện di đậm, rõ nét, nguyên vẹn không bị đứt gãy nên đủ điều kiện để tiếp tục tinh sạch để thực hiện phản ứng giải trình tự. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 153 Hình 3. Điện di AND tổng số Hình 4. Điện di sản phẩm PCR * Trình tự đoạn gen rbcL Trình tự ADN sau khi giải trình tự thu được gồm 545 bp (Hình 4) trong đó có 542 bp hiện rõ, được đưa vào để so sánh với trình tự công bố, trong đó tỷ lệ G-C là 42 %, tỷ lệ A-T là 58 %. Công cụ NCBI/Blast được sử dụng để so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (mã hiệu ngân hàng gen: KX783977.1) cho thấy trình tự gen thu được tương đồng với trình tự loài Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey đã công bố với số nucleotid tương đồng là 541/542 (tương ứng tỷ lệ tương đồng 99%). Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 154 Hình 4. So sánh trình tự đoạn gen rbcL của mẫu nghiên cứu với trình tự loài đã công bố trên thế giới Trong đó: Query là trình tự mẫu nghiên cứu và Sbjct là trình tự loài P. balfouriana (Andre) L.H.Bailey đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (mã hiệu ngân hàng gen: KX783977.1) (Elansary, et al, 2017). Kết quả giải trình tự gen và so sánh trình tự gen của cây Đinh lăng lá tròn với trình tự gen loài là P. balfouriana (Andre) L.H. Bailey là cơ sở tin cậy để khẳng định tên khoa học của cây Đinh lăng lá tròn là: Polyscias balfouriana (Andre)L.H. Bailey. Họ Nhân sâm (Araliaceae). 4. THẢO LUẬN Do các loài thuộc chi Polyscias được đặt tên khác nhau và trước kia không công bố rộng rãi nên một loài lại có thể có nhiều tên khác nhau. Mặt khác căn cứ vào đặc điểm thực vật để phân loại cũng gặp một số trở ngại như một số loài có hình thái rất giống nhau, rất khó khăn phân biệt hai loài khác nhau, do đặc Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 155 điểm giữa các loài khác nhau không nhiều; trường hợp khác cùng một loài sống trong các điều kiện khác nhau, có thể có sự thay đổi về hình thái. Để góp phần hỗ trợ xác định tên khoa học của loài đinh lăng lá tròn, ngoài phương pháp phân tích đặc điểm hình thái thực vật, chúng tôi đã sử dụng ADN mã vạch, tiến hành giám định ADN của mẫu cây này. Đây là một phương pháp tiên tiến đã được sử dụng thành công định danh loài trên thế giới. Đối với cây Đinh lăng lá tròn, đây là lần đầu tiên phương pháp định danh qua giám định ADN được sử dụng để giám định tên khoa học của cây. Sau khi chiết xuất, phân tách ADN và giải trình tự gen của mẫu lá cây Đinh lăng, cho kết quả trình tự gen. So sánh trình tự đoạn gen RBCL này với trình tự gen đã công bố của loài P. balfouriana (Andre) L.H.Bailey (Elansary et al, 2017) cho thấy có sự trùng khớp nhau đến 99 %. Do đó, nghiên cứu xác định tên các loài Polyscias bằng ADN, đây là phương pháp có độ tin cậy và tính chọn lọc cao. 5. KẾT LUẬN Tóm lại, bằng phương pháp ADN mã vạch kết hợp với đặc điểm hình thái cho thấy cây Đinh lăng lá tròn (thu thập và trồng tại vườn Dược liệu Trường Đại học Tây Đô, Thành Phố Cần Thơ) có tên khoa học là Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Kết quả này giúp nhận định chính xác tên khoa học của các đối tượng được nghiên cứu bằng phương pháp ADN mã vạch. Kết quả cũng khẳng định về định danh cây Đinh lăng lá tròn của Phạm Hoàng Hộ (2003) và của một số tác giả trước đây. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Doyle J.J., Doyle J.L., 1990. Isolation of Plant DNA from fresh tissue. Focu, 12(6), 13 – 15. 2. Elansary H.O., Ashfaq M., Yessoufou K. and Hebert P.D.N., 2017. Polyscias balfouriana voucher Hosam00272 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast. GenBank: KX783977.1 3. Hall T.A., 1999. BioEdit: a user- friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98. 4. Kress W.J, Erickson D.L, 2007. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcLa gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. PLoS One, 6:1-10. 5. Levin R.A., Wagner W.L., Hoch P.C., Nepokroeff M, Pires J.C, Zimmer E.A, Sytsma K.J., 2003. Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcLa and ndhF data. American Journal of Botany, vol 90:107-115. 6. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận và Nguyễn Thị Thu Hương, 2007. Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm. NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tr. 293. Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô Số 07 - 2019 156 7. Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phương Anh, 2015. Đặc điểm hình thái các chi trong họ ngũ gia bì ở Việt Nam. Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 6, tr. 69- 75. 8. Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006. Các phương pháp nghiên cứu thực vật. NXB Giáo dục. 9. Phạm Hoàng Hộ, 2003. Cây cỏ Việt Nam, tập 1. NXB Trẻ, Hà Nội. Tr. 516 – 518. 10. Sanger S., Nicklen S., Coulson A.R, 1977. DNA sequencing with chain- terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 74 (12): 5463–5467. SCIENTIFIC NAME DETERMINATION OF POLYSCIAS BALFOURIANA (ANDRE) L.H.BAILEY BY USING DNA SEQUENCING Do Van Mai, Thieu Van Duong, Vu Thi Binh and Tran Cong Luan Faculty of Pharmacy and Nursery, Tay Do University (Email: dvmai@tdu.edu.vn) ABSTRACT Relying on plant morphology, it is difficult to classify species and It’s not sufficient scientific basis to identidy the right species which are very similar in morphology. In previous documents of medicinal plants, the scientific name of “Dinh lang” has been determined, based on plant morphology, as Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey, belongs to the Araliace family. The objectives of this study were to analyse the morphological characteristics, sequenced RAPD to determine the scientific name of “Dinh lang la tron”. Plant samples were collected from the medicinal garden of Tay Do University. The results obtained the genomic sequence of “Dinh lang la tron” plant which was similar to the genetic sequences of P. balfouriana (Andre) L.H.Bailey published on data banks to 99%. Thus by using method of DNA sequencing, the scientific name of “Dinh lang la tron” have identified as Polyscias balfouriana (Andre) L.H.Bailey, belongs to the Araliace family. Our result confirmed the scientific name of “Dinh lang la tron” which was documented as identified by using plant morphology for plant classification. Keywords: DNA, Polyscias balfouriana, sequencing RBCL