Xác định thời gian và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với các chủng e. coli gây bệnh phân lập được tại bệnh viện Da liễu trung ương

49Số 28 (Tháng 05/2019) 'A /,ӈ8 HӐ& NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XAÙC ÑÒNH THÔØI GIAN VAØ NOÀNG ÑOÄ DIEÄT KHUAÅN TOÁI THIEÅU CUÛA NANO BAÏC ÑOÁI VÔÙI CAÙC CHUÛNG E. COLI GAÂY BEÄNH PHAÂN LAÄP ÑÖÔÏC TAÏI BEÄNH VIEÄN DA LIEÃU TRUNG ÖÔNG Mai Thu Phương*, Lê Hạ Long Hải*, Hoàng Thị Thanh Hoa*, Lê Văn Hưng** TÓM TẮT Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn gây bệnh hàng đầu trong viêm đường tiêu hóa và sinh dục - tiết niệu. E. coli có tỷ lệ kháng kháng sinh cao gây khó khăn nhiều cho việc điều trị. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định thời gian và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với các chủng E. coli gây bệnh được phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng các kỹ thuật pha loãng và cấy đếm, thử nghiệm trên 30 chủng E. coli với 10 nồng độ của dung dịch nano bạc và 5 mốc thời gian ủ, từ đó xác định thời gian và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với các chủng E. coli. Kết quả: Ở nồng độ rất thấp (0,98 mg/L), nano bạc có khả năng tiêu diệt 99,86% các chủng vi khuẩn E. coli khi được ủ tới 4 giờ. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với các chủng E. coli phân lập được xác định là 31,25 mg/L ngay khi tiếp xúc. Kết luận: Khả năng diệt các chủng E. coli gây bệnh của nano bạc tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc. Từ khóa: Nano bạc, E. coli. Phản biện khoa học: PGS.TS. Nguyễn Hữu Sáu *Bộ môn Vi sinh-Ký sinh trùng lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội. **Bộ môn Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trước khi có kháng sinh, bạc được sử dụng như một chất kháng khuẩn tự nhiên từ rất sớm [1]. Đến thời kỳ hoàng kim của kháng sinh, việc sử dụng bạc đã giảm đáng kể. Tuy nhiên, trong vài thập kỷ gần đây, sự kháng kháng sinh ngày càng gia tăng, đặc biệt là các dòng đa kháng dẫn đến nhu cầu cần thay đổi các kháng sinh mới trong điều trị, thì lúc này việc sử dụng bạc lại trở thành mối quan tâm hấp dẫn của ngành y dược [2]. Cùng với sự phát triển của công nghệ và kĩ thuật hiện đại, công nghệ nano trên thế giới đã được sử dụng trong nghiên cứu y khoa để chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh tật vì vật liệu nano tác động sâu đến tế bào và các mô của con người với tính độc hại thấp hơn các chất diệt khuẩn khác [3]. Ứng dụng công nghệ nano giúp chia nhỏ phân tử bạc ở kích thước nhỏ tầm nano-mét, làm giảm kích thước hạt, tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích tăng dẫn đến tăng hoạt tính diệt khuẩn [4],[5]. Không chỉ có tác dụng kháng khuẩn hiệu quả mà còn có khả năng chống viêm tốt, nano 50 'A /,ӈ8 HӐ& Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC bạc được ứng dụng để phát triển các miếng dán, kem trị vết thương, vết bỏng, chế tạo mỹ phẩm, chất khử mùi và các dung dịch hỗ trợ tăng cường miễn dịch [6]. E. coli là trực khuẩn đường ruột Gram âm, hiếu kỵ khí tùy điều kiện, là vi khuẩn thuộc vi hệ bình thường của đường tiêu hóa. Tuy nhiên, E. coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng hàng đầu trong các trường hợp tiêu chảy, viêm đường mật và nhiễm khuẩn huyết [7]. Hơn nữa, việc điều trị nhiễm khuẩn E. coli cũng gặp khó khăn do tình trạng E. coli kháng kháng sinh ngày càng phổ biến. Tại các nước phát triển thuộc tổ chức Hợp tác và Phát triển kinh tế (OECD), tỷ lệ kháng một số kháng sinh thông dụng được kê đơn cho trẻ em đối với nhiễm khuẩn tiết niệu do E. coli rất cao (tỷ lệ kháng ampicilin là 53,4%, kháng trimethoprim 23,6%), chưa kể đến đối với các nước ngoài tổ chức OECD có sự tràn lan trong việc sử dụng kháng sinh không kê đơn [4]. Trong bối cảnh E. coli có tỷ lệ kháng kháng sinh rất cao như hiện nay, việc tìm ra các biện pháp diệt khuẩn an toàn và hiệu quả là vô cùng cấp thiết. Nghiên cứu này giúp xác định thời gian tác động diệt khuẩn và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với chủng E. coli gây bệnh trên bệnh nhân được phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng 30 chủng E. coli được xác định là căn nguyên gây bệnh, phân lập từ bệnh phẩm dịch niệu đạo, âm đạo của các bệnh nhân đến xét nghiệm tại Khoa Xét nghiệm Vi sinh - Nấm - Ký sinh trùng, Bệnh viện Da liễu Trung ương. 2.2. Vật liệu (1) Dung dịch nano bạc nồng độ 500 mg/L được cung cấp bởi Viện Công nghệ môi trường với các hạt nano bạc có kích thước 10 - 30 nm được điều chế bằng phương pháp dùng Sodium Borohydride (NaBH4) khử dung dịch bạc nitrat. (2) Môi trường giữ chủng Skim milk. (3) Môi trường thạch thường. (4) Que cấy, đèn cồn, tủ ấm CO2, tủ an toàn sinh học, tủ lạnh thường, tủ âm sâu, máy đo độ đục, máy vortex, bộ nhuộm Gram. (5) Chủng vi khuẩn E. coli. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Sử dụng các kỹ thuật xét nghiệm labo nhằm xác định thời gian và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của dung dịch nano bạc từ dung dịch gốc có nồng độ 500 mg/L đối với chủng E. coli gây bệnh được phân lập từ bệnh phẩm dịch niệu đạo, âm đạo. 2.3.2. Quy trình thực hiện 30 chủng E. coli được thu thập từ bệnh phẩm dịch niệu đạo, âm đạo, làm thuần nhất và bảo quản trong môi trường Skim milk ở nhiệt độ -800C. Cấy chuyển lần thứ nhất trên đĩa thạch thường, điều kiện 35-370C/5-7% CO2 trong 24 giờ. Lấy một khuẩn lạc thuần trên đĩa thạch thường và cấy chuyển lần 2 trên môi trường thạch ống nghiêng trong điều kiện tương tự. Nhận định khuẩn lạc: Trên môi trường cấy chuyển, sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc có đường kính 1 - 1,5 mm, dạng S: tròn, lồi, nhẵn bóng, bờ đều, màu trắng đục, nhuộm soi kiểm tra hoặc làm thêm thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học nếu có nghi ngờ. Từ khuẩn lạc thuần, pha huyền dịch để thực hiện thử nghiệm. 51Số 28 (Tháng 05/2019) 'A /,ӈ8 HӐ& NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Nghiên cứu được tiến hành với 10 độ pha loãng của dung dịch bạc nano gốc. Nồng độ pha loãng được chia như sau: Độ pha loãng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tỷ lệ 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Nồng độ (mg/L) 500 250 125 62,5 31,25 15,625 7,81 3,90 1,95 0,98 Pha ống chứng: Cho 2 ml nước cất tiệt trùng vào một ống nghiệm vô trùng đã được đánh dấu. Dùng ăng cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc E. coli hòa vào ống dung dịch nano bạc trên rồi trộn đều đến khi độ đục đạt 0,5 McFarland. Chia đều hỗn hợp sang 5 ống nghiệm vô trùng, tương ứng với 5 điều kiện: không ủ, ủ trong 15 phút, 1 giờ, 2 giờ và 4 giờ. Ghi thông tin lên ống và tiến hành thử nghiệm. Sau khi hết thời gian ủ, trộn đều và sử dụng pipet bán tự động hút 100 µl hỗn hợp từ mỗi ống nhỏ lên bề mặt thạch. Dùng ăng cấy vô trùng cấy trải đều lên môi trường. Đặt đĩa cấy vào tủ ấm ở điều kiện 370C/5 - 7% CO2. Sau 24 giờ lấy đĩa ra đọc kết quả. Phương pháp đếm khuẩn lạc Sau 24 giờ, đĩa nuôi cấy được lấy ra quan sát và đếm khuẩn lạc. Chụp ảnh đĩa môi trường và chia ảnh thành các ô vuông có diện tích 1 cm2. Đếm số lượng khuẩn lạc trên từng ô vuông nhỏ và tính tổng số lượng khuẩn lạc. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC) là nồng độ thấp nhất của một chất kháng khuẩn làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn ban đầu [5]. Trong nghiên cứu này, nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của dung dịch nano bạc được xác định khi lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy ≤ 0,1% lượng khuẩn lạc trên mẫu chứng. 3. KẾT QUẢ 3.1. Tác động diệt khuẩn theo thời gian ủ và nồng độ của nano bạc đối với E. coli Biểu đồ 3.1: Khả năng diệt khuẩn của nano bạc đối với E. coli theo thời gian và nồng độ Nhận xét: Thời gian ủ càng lâu và nồng độ càng cao, khả năng diệt khuẩn của nano bạc càng tốt hơn. 3.2. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với E. coli Kết quả thu được khi thử nghiệm trên 30 chủng E. coli phân lập từ bệnh nhân cho thấy, nano bạc với nồng độ 31,25 mg/L có khả năng diệt khuẩn 100% ngay khi vừa tiếp xúc và ở mọi thời gian ủ được thực hiện. Khả năng diệt khuẩn vẫn ở mức trên 99,9% đối với nồng độ nano bạc là 3,90 mg/L ở mọi mốc thời gian thực hiện. Khả 52 'A /,ӈ8 HӐ& Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC năng diệt khuẩn này giảm đáng kể khi nồng độ nano bạc giảm xuống còn 1,95 mg/L. Tuy nhiên, khi nano bạc ở nồng độ này và thậm chí là 0,98 mg/L khi được ủ với E. coli trong 2 giờ và 4 giờ thì tỷ lệ diệt khuẩn tăng lên tương ứng là 99,87% và 99,86%. 4. BÀN LUẬN 4.1. Tác động diệt khuẩn của nano bạc theo thời gian ủ và nồng độ của nano bạc đối với chủng E. coli phân lập được Thí nghiệm trên cho thấy, dung dịch nano bạc gốc và các dung dịch được pha loãng tới nồng độ 3,90 mg/L đều có tác dụng tiêu diệt đến 99,9% đối với các chủng E. coli khi không cần ủ (thời điểm 0h). Từ nồng độ 1,95 mg/L, tác dụng diệt khuẩn của nano bạc đối với các chủng E. coli đạt được sau khi ủ 1 giờ (< 102 CFU). Khi tiếp tục giảm nồng độ nano bạc xuống 0,98 mg/L, tác dụng ức chế E. coli chỉ đạt hiệu quả khi ủ với khoảng thời gian 2h và 4h. Bạc là một tác nhân kháng khuẩn phổ rộng, có khả năng tiêu diệt trên một lượng lớn các chủng vi sinh vật gây bệnh như nấm và vi khuẩn, bao gồm các chủng E. coli là một trong những loài được nghiên cứu nhiều nhất. Shahverdi và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng nano bạc làm tăng tác dụng diệt khuẩn của nhiều loại kháng sinh trên Staphylococcus aureus và Escherichia coli [9]. Theo nghiên cứu của Nguyễn Như Lâm và cộng sự (2009), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc với E.coli là 3,125 mg/L sau 2 giờ tiếp xúc [10]. Nghiên cứu của chúng tôi cũng khẳng định lại khả năng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc trên các chủng E. coli phân lập được trên bệnh nhân, đặc biệt khả năng diệt khuẩn này tăng theo thời gian ủ và nồng độ với các chủng vi khuẩn trên, thời gian ủ tối ưu cho khả năng diệt khuẩn của nano bạc trong nghiên cứu này là từ 2 đến 4 giờ. 4.2. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với các chủng E. coli phân lập được trên bệnh nhân Cơ chế tác động của nano bạc lên vi sinh vật vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đã nêu quan điểm thống nhất rằng chúng phá hủy chức năng hô hấp hoặc một số chức năng khác của tế bào, hoặc liên kết với DNA của tế bào vi sinh vật. Điều này khiến chúng ta băn khoăn rằng nano bạc có thể tác dụng lên tế bào cơ thể người và gây hại đến sức khỏe hay không. Các tế bào động vật cấp cao có lớp màng bảo vệ hoàn toàn khác so với tế bào vi sinh vật với hai lớp lipoprotein giàu liên kết đôi có khả năng cho điện tử, do đó không cho phép các ion bạc xâm nhập. Vì vậy chúng không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này. Mặt khác, người ta cho rằng vì các hạt nano bạc tác động đến nhiều khía cạnh của sinh lý vi khuẩn nên vi khuẩn sẽ khó phát triển tính kháng đối với chúng. Tuy vậy, có nghiên cứu chỉ ra rằng, E. coli dễ dàng phát sinh đột biến kháng với nano bạc tích lũy chỉ trong 100 thế hệ và ở thế hệ thứ 200 đã có 3 đột biến kháng nano bạc với tần suất cao [11]. Mặc dù không tránh được những nguy cơ từ vi khuẩn đột biến với gen kháng, việc tìm ra một nồng độ nano bạc tối thiểu vừa diệt khuẩn vừa an toàn với tế bào cơ thể là nhiệm vụ cần thiết. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy các chủng E. coli phân lập được từ bệnh nhân khá nhạy cảm với nano bạc ngay từ nồng độ 31,25 mg/L khi cho tiếp xúc với nano bạc với tỷ lệ diệt khuẩn là 100%. Khả năng diệt khuẩn vẫn 53Số 28 (Tháng 05/2019) 'A /,ӈ8 HӐ& NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ở mức trên 99,9% đối với nồng độ nano bạc là 3,90 mg/L ở mọi mốc thời gian thực hiện. Khả năng diệt khuẩn này giảm đáng kể khi nồng độ nano bạc giảm xuống còn 1,95 mg/L. Tuy nhiên, khi nano bạc ở nồng độ này và thậm chí là 0,98 mg/L khi được ủ với E. coli trong 2 giờ và 4 giờ thì tỷ lệ diệt khuẩn tăng lên tương ứng là 99,87% và 99,86%. Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Ruparelia và cộng sự (2008) công bố nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano tiểu phân bạc trên nhiều chủng E. coli là 60 - 220 mg/L [12]. 5. KẾT LUẬN Khả năng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc đối với E. coli tăng theo thời gian ủ, ngay cả ở nồng độ rất thấp (0,98 mg/L), nano bạc có khả năng tiêu diệt 99,86% các chủng vi khuẩn E. coli khi được ủ tới 4 giờ. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với E. coli được xác định là 31,25 mg/L ngay khi tiếp xúc. Tác dụng diệt khuẩn của nano bạc với E. coli là rất tốt, nghiên cứu này đã góp phần mở ra hướng điều trị mới đối với các bệnh trong chuyên ngành Da liễu như: viêm kẽ, viêm âm hộ, loét da và niêm mạc do E. coli và các loài vi khuẩn kháng thuốc khác. Ngoài ra, có thể ứng dụng nano bạc để sản xuất các dung dịch sát trùng, kem bôi, miếng dán, gạc đắp các vết thương và nhiều sản phẩm khác như băng vệ sinh, bỉm cho trẻ em và người già. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Roe, A.L. et al (1915). Collosol argentum and its ophthalmic uses. British Med. J, 1(2820), 104. 2. Rai, M.K. et al (2012). Silver nanoparticles: the powerful nanoweapon against multidrug-resistant bacteria. J. Appl. Microbiol, 112(5), 841-852. 3. SCENIHR (2014). “Are silver nanoparticles safe? Implications for health, the environment and microbial resistance”. 4. Bryce, Ashley et al (2016). Global Prevalence of Antibiotic Resistance in Paediatric Urinary Tract Infections Caused by Escherichia coli and Association with Routine Use of Antibiotics in Primary Care: Systematic Review and Meta- Analysis. The BMJ, 15,352: i939. 5. La Vũ Thùy Linh và cộng sự (2010). Công nghệ nano - cuộc cách mạng trong khoa học kỹ thuật thế kỷ 21. Tạp chí Khoa học và Ứng dụng, số 12-2010, 47-49. 6. Chử Thị Thu Huyền và cộng sự (2014). Nano tiểu phân bạc và triển vọng ứng dụng trong Dược học. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 30 (2), 23-32. 7. Nguyễn Vũ Trung (2014). Vi sinh - Ký sinh trùng lâm sàng, tập I. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 134. 8. Amyes S et al (1996). Antimicrobial Chemotherapy: Pocketbook. CRC Press, 25. 9. Shahverdi AR et al (2007). Rapid synthesis of silver nanoparticles using culture supernatants of Enterobacteria: A novel biological approach. Process Biochem, 42(5), 919–23. 10. Nguyễn Như Lâm và cộng sự (2009). Nghiên cứu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu và độc tính cấp của dung dịch nano bạc. Tạp chí Y học thảm họa và Bỏng. 11. Graves, Joseph L. et al (2015). Rapid Evolution of Silver Nanoparticle Resistance in Escherichia coli. Frontiers in Genetics, 6 (42). 12. Ruparelia J.P. et al (2008). Strain Specificity in Antimicrobial Activity of Silver and Copper Nanoparticles. Acta Biom. 54 'A /,ӈ8 HӐ& Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SUMMARY DETERMINE THE MINIMUM BACTERICIDAL CONCENTRATION AND TIME-DEPENDENT MANNER OF SILVER NANOPARTICLES TO ESCHERICHIA COLI ISOLATED FROM PATIENTS AT THE NATIONAL HOSPITAL OF DERMATOLOGY AND VENEREOLOGY E. coli is the most common cause of diarrhea, cholangitis, genital infections, urinary tract infections, and sepsis. It is also established as the main cause of high rates of antibiotic resistance that makes infections untreatable or difficult-to-treat. Purpose: To determine the minimum bactericidal concentration and time-dependent manner of silver nanoparticles for E. coli isolated from patients at the National Hospital of Dermatology and Venereology. Method: The laboratory diagnostic techniques were used to test 30 pathogenic E. coli strains with 10 different concentrations of silver nanoparticles during 5 different incubation periods, thus evaluating the minimum incubation time and minimum bactericidal concentration to observe a significant effect on E. coli. Results: At a very low concentration (0.98 mg/L), silver nanoparticles were capable of killing 99.86% of E. coli strains when incubated for 4 hours. The minimum bactericidal concentration of silver nanoparticles for E. coli isolates was determined to be 31.25 mg/L at all times of exposure. Conclusion: Silver nanoparticles capacity to kill the tested E.coli strains is proportionally time- and concentration-dependent. Key words: Silver nanoparticle, Escherichia coli.