Xác định tổng hàm lượng flavonolignan tính theo sily in trong dược liệu hạt cúc gai và chế phẩm từ cúc gai silybum marianum (l.) gaertn) bằng phương pháp quang phổ UV-VIS

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 241 ÁC ĐỊNH TỔNG HÀM LƢỢNG FLAVONOLIGNAN T NH THEO SILY IN TRONG DƢỢC LIỆU HẠT C C GAI VÀ CHẾ PHẨM TỪ C C GAI SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN) ẰNG PHƢƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS Thái Nguyễn hánh ằng*, Ng Thị Thanh Diệp*, a oàng nh* TÓM TẮT Mở đầu: Cây Cúc gai, tên khoa học Silybum marianum (L.) aertn. đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh gan mật v| một số bệnh ung thư từ rất l}u. Tuy t{c dụng của Cúc gai v| c{c chế phẩm từ Cúc gai đã được chứng minh v| sử dụng phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt nam nhưng dược liệu hạt Cúc gai v| c{c chế phẩm từ Cúc gai chưa có trong DĐVN IV, do đó, việc x}y dựng một quy trình định lượng hoạt chất chính l| c{c flavonolignan cho ph p đ{nh gi{ chất lượng của dược liệu hạt Cúc gai v| chế phẩm l| cần thiết. Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong dược liệu hạt cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn v| chế phẩm từ hạt Cúc gai bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis. Thẩm định c{c quy trình đã x}y dựng v| {p dụng c{c quy trình n|y để x{c định tổng h|m lượng flavonolignan trong dược liệu (hạt Cúc gai) v| một số chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường. Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu l| c{c flavonolignan (với chất đối chiếu l| flavonolignan silybin) có trong dược liệu v| chế phẩm từ Cúc gai. Tiến h|nh khảo sát các thông số cho quy trình định lượng. Từ đó, x}y dựng và thẩm định quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong hạt cúc gai nguồn gốc từ Croatia v| c{c chế phẩm trên thị trường được mã hóa LI, SA, SI bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis v| {p dụng quy trình n|y để x{c định tổng h|m lượng flavonolignan trong hạt Cúc gai v| c{c chế phẩm LI, SA, SI. Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong hạt Cúc gai v| một số chế phẩm từ hạt Cúc gai bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis với các thông số: m{y quang phổ Shimadzu Probe 2550; dung môi chiết ethanol 96%; phương ph{p chiết: đun hồi lưu ở 90 – 95 oC 3 lần, mỗi lần 30 phút; bước sóng định lượng 288 nm. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ chính x{c v| độ đúng cao. Áp dụng quy trình đã x}y dựng để x{c định tổng h|m lượng flavonolignan trong hạt Cúc gai v| một số chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường. Kết quả cho thấy tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong hạt Cúc gai l| khoảng 3,8% tính theo dược liệu khô kiệt; trong chế phẩm LI – 196 mg; trong chế phẩm SA – 243 mg; trong chế phẩm SI – 50 mg. Kết luận Quy trình định lượng đơn giản nhưng có độ đúng v| độ lặp lại cao cho ph p x{c định tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong dược liệu hạt Cúc gai v| chế phẩm từ hạt Cúc gai. Sử dụng quy trình có thể cho ph p đ{nh gi{ nhanh chất lượng của dược liệu v| chế phẩm từ hạt Cúc gai. Từ khóa: Cúc gai, milk thistle seed, silybin, quang phổ UV-Vis *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 01226671588 Email: thanhdiep73@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 242 ABSTRACT DETERMINATION OF TOTAL FLAVONOLIGNAN CALCULATED AS SILYBIN IN MILK THISTLE SEEDS (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) AND THEIR PRODUCTS BY UV-VIS SPECTROPHOTOMETRY Thai Nguyen Khanh Hang, Ngo Thi Thanh Diep, La Hoang Anh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:241 - 249 Introduction: Milk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn.) has been used to prevent liver and treat liver diseases, cancer for a long time. Althought the milk thistle seeds and their product shave been proven and widely used in the world as well as in Vietnam but there is no monograph of Silybum marianum seeds and products in the 4th edition Vietnamese Pharmacopoeia and the quality of this valuable medicinal herb and its products has not been controlled yet. Therefore, this study was conducted to develop a method for quantitative determination of active ingredients - the flavonolignans, in milk thistle seeds and their products is extremely necessary. Objectives: In this study, quantitative determination of total flavonolignan calculated as silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and their products by UV-Vis spectrophotometry was established. The method was validated and applied to determine the total content of flavonolignan in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and their products. Materials and methods: The study subjects were flavonolignans (with silybin as a reference) in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. and several corresponding products. Parameters for the quantitative procedure were determined. After that, the quantitative determination of flavonolignan calculated as silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn. (originating in Croatia) and their productson the market by UV-Vis spectrophtometry was developed and validated. The procedure was applied to determine the total content of flavonolignan in Silybum marianum (L.) Gaertn. seeds and LI, SA and SI products. Results: The quantitative determination of flavonolignan content calculated as silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products by UV-Vis spectrophotometry was developed and validated with parameters: Shimadzu Probe Spectrometer 2550; 96% ethanol for extraction (reflux at 90 - 95 °C 3 times with 30 minutes per time); absorbance of quantitative solutions was measured at wavelength 288 nm. The results illustrated that the procedure had selectivity, wide linearity, high correlation coefficient, high accuracy and precision. The validated method was applied to determine the total content of flavonolignan in Silybum marianum (L.) Gaertn. seeds and their products on the market. The results also showed that the total content of flavonolignan, calculated as silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds and LI, SA, SI products were about 3.8% of the dried material; 196 mg; 243 mg; 50 mg, respectively. Conclusion: The rapid and simple UV-Vis method, which had high-precision and high-accuracy, was suitable for testing the quality of seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products. Keywords: Silybum marianum (L.) Gaertn, Milk Thistle seed, UV-Vis spectrophotometry ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Cúc gai (còn gọi là kế sữa, kế thánh, kế đức mẹ , tên kho học Silybum marianum (L.) Gaertn. là một loài thuộc họ Cúc (Asteraceae). Cúc gai đã đƣợc sử dụng làm thuốc bảo vệ gan mật từ hơn 2000 năm trƣớc. Nhiều loại thuốc và thực phẩm chức năng từ Cúc gai đƣợc sử dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ v| ch}u u cũng nhƣ nhiều nơi trên thế giới để chữ cải thiện chức năng củ gan(1,6). Những năm gần đ}y, nhiều nghiên cứu cho thấy Cúc gai có những hoạt tính sinh học nổi trội và hứa hẹn nhiều tiềm năng điều trị mới nhƣ ổn định màng tế b|o g n, ngăn cản sự xâm nhập của các chất độc v|o bên trong g n; tăng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 243 tổng hợp protein ở tế bào gan do kích thích hoạt động của RNA polymerase, góp phần giải độc cho g n; thúc đẩy sự phục hồi các tế b|o g n đã bị hủy hoại và kích thích sự phát triển của các tế bào gan mới thay thế các tế b|o g n đã bị hủy hoại; ức chế sự biến đổi tế bào gan thành các tổ chức xơ, giảm sự hình thành và lắng đọng của các sợi collagen dẫn đến xơ g n; chống peroxyd hó lipid, tăng khả năng oxy hó cid béo của gan, làm ổn định các tế bào gây viêm, ức chế phản ứng viêm, giảm các nồng độ enzym gan, làm cải thiện các triệu chứng của bệnh g n nhƣ gan nhiễm mỡ, viêm gan. Hiện nay các nhà khoa học đã v| đ ng tiến hành nghiên cứu quy mô về cây thuốc quý này, không chỉ dừng lại ở tác dụng với các bệnh gan mật mà còn có khả năng chống ung thƣ v| điều trị cho bệnh nhân HIV(3,4,5). Trong vòng hơn 50 năm qu , c{c nh| kho học đã th|nh c ng trong việc x{c định các hoạt chất có trong c}y Cúc g i, trong đó đ{ng chú ý nhất là một nhóm hợp chất đƣợc chiết xuất từ hạt Cúc g i có tên l| silym rin gồm c{c fl vonolign n chiếm khoảng 70-80% c{c hoạt chất trong hạt Cúc g i Th|nh phần chủ yếu củ silym rin l| silybin, ngo|i r còn có silichristin, silidianin(1,5,6) . Ở Việt Nam, cây Cúc gai đã đƣợc di thực từ thế kỷ 20, hiện mới đƣợc trồng ở một số nơi với quy m nhỏ nhƣ S p , H| nội, T m Đảo, Đ| Lạt Tuy t{c dụng củ Cúc g i v| c{c chế phẩm từ cúc g i đã đƣợc chứng minh v| sử dụng phổ biến nhƣng dƣợc liệu v| c{c chế phẩm từ Cúc g i chƣ có trong DĐVN IV Do đó, việc x}y dựng một quy trình định lƣợng hoạt chất chính l| nhóm c{c fl vonolign n cho phép đ{nh gi{ chất lƣợng củ dƣợc liệu v| chế phẩm từ cúc g i l| v cùng cần thiết Đề t|i đƣợc thực hiện với c{c mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong dƣợc liệu hạt Cúc g i Silybum marianum (L.) Gaertn v| chế phẩm từ hạt Cúc g i bằng phƣơng ph{p qu ng phổ UV-Vis. - Thẩm định quy trình đã x}y dựng v| {p dụng để x{c định tổng h|m lƣợng fl vonolign n trong dƣợc liệu hạt Cúc g i v| một số chế phẩm từ hạt cúc g i trên thị trƣờng NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Hạt cúc g i có nguồn gốc từ Cro ti đƣợc cung cấp bởi c ng ty Starwest Botanicals, th{ng 4 năm 2017 C{c chế phẩm l| thực phẩm chức năng chứ silym rin có nguồn gốc từ cúc g i đƣợc thu mu trên thị trƣờng Tp HCM v|o th{ng 5/2017 đƣợc mã hó lần lƣợt l| LI, SA v| SI bảng 1 ảng : C{c chế phẩm thực phẩm chức năng được sử dụng trong nghiên cứu STT Tên chế phẩm được m h a Hàm lượng sil marin trên nh n viên Dạng bào chế 1 LI 140 mg Viên nang cứng 2 SA 140 mg Viên nén bao phim 3 SI 70 mg Viên nang cứng Chất chuẩn Silybin h|m lƣợng 91,57% C25H22O10), số lô QT198051115 do Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh cung cấp Hóa chất, dung môi Ethanol (EtOH) 96%, methanol (MeOH), ethyl acetat (EtOAc), cloroform, ether ethylic, n-hex n đạt tinh khiết loại PA do Trung Quốc sản xuất, một số hó chất v| thuốc thử th ng thƣờng kh{c trong phòng thí nghiệm Trang thiết bị M{y qu ng phổ UV-Vis Shimadzu Probe 2550, bể siêu âm Branson 8510 (USA), cân phân tích Kern ABS 220-4, c}n x{c định độ ẩm Sartorius MA 45, bể cách thủy Memmert, bản mỏng Silica gel F254 Merck. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 244 Phƣơng pháp nghiên cứu Định tính sily in trong dược liệu hạt cúc gai và chế phẩm ằng phương pháp M Khảo s{t 6 hệ dung m i: CHCl3 – MeOH – H2O (5:1:1); n-hexan – EtOAc (7:3); CHCl3 – EtOAc (3:1); CHCl3 – CH3CN (6:4); CHCl3 – MeOH (9:1); CHCl3 – EtOAc – HCOOH 5:4:1 Chọn hệ dung m i cho hiệu quả t{ch c{c vết trên sắc ký đồ củ mẫu thử tốt nhất v| gi{ trị Rf củ vết silybin trên sắc ký đồ củ mẫu chuẩn trong khoảng 0,3 đến 0,8 Xây dựng các quy trình định lượng: Xây dựng quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong dược liệu: Khảo s{t c{c th ng số: dung m i chiết, phƣơng ph{p chiết, thời gi n chiết, bƣớc sóng định lƣợng Chuẩn bị c{c dung dịch chuẩn silybin C}n chính x{c khoảng 20 mg silybin chuẩn, hò t n trong eth nol 96%, đun nóng cho t n ho|n to|n S u khi để nguội, chuyển v|o bình định mức 100 ml, thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch chuẩn A có nồng độ silybin khoảng 200 µg/ml Hút chính x{c 1 ml dung dịch chuẩn A v|o bình định mức 25 ml, thêm eth nol 96% đến vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch chuẩn C có nồng độ silybin khoảng 8 µg/ml Từ dung dịch chuẩn A ph c{c dung dịch chuẩn có nồng độ lần lƣợt l| 5, 8, 10, 20, 32 µg/ml để khảo s{t khoảng tuyến tính khi thẩm định quy trình định lƣợng Chuẩn bị dung dịch mẫu thử (dung dịch thử T): C}n chính x{c khoảng 1,00 g hạt cúc g i nghiền nhỏ đến kích thƣớc 1 mm cho v|o bình nón nút m|i loại 100 ml, chiết xuất bằng dung m i v| phƣơng ph{p đƣợc lự chọn s u khi khảo s{t Dịch chiết đƣợc chuyển to|n bộ v|o bình định mức 100 ml v| thêm dung m i dùng để chiết xuất đến vạch, thu đƣợc dung dịch Hút chính x{c 1 ml dung dịch cho v|o bình định mức 25 ml v| thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch thử T Lắc đều các mẫu, để yên trong 20 phút Đo độ hấp thu mẫu chuẩn và thử tại bƣớc sóng λmax. Ghi nhận độ hấp thụ A của mẫu chuẩn và thử, từ đó tính r tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong mẫu thử hạt cúc g i Quy trình định lƣợng sau khi xây dựng đƣợc thẩm định về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính x{c v| độ đúng theo ICH(2). Quy trình định lượng tổng h|m lượng flavonolignan tính theo silybin trong chế phẩm Chuẩn bị c{c dung dịch chuẩn: Tiến h|nh giống nhƣ trong quy trình định lƣợng củ dƣợc liệu hạt cúc g i Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: Đầu tiên, x{c định h|m lƣợng dƣợc chất trung bình trong 1 đơn vị chế phẩm, s u đó c}n một lƣợng dƣợc chất đƣợc lấy từ lƣợng dƣợc chất đƣợc l|m đồng đều từ 20 đơn vị, chiết xuất bằng dung m i đƣợc lự chọn rồi ph loãng bằng dung m i đến nồng độ thích hợp để thu đƣợc dung dịch thử T có nồng độ fl vonolign n nằm trong khoảng tuyến tính, gần với nồng độ mẫu chuẩn C Đo độ hấp thu dung dịch T và dung dịch chuẩn silybin C ở bƣớc sóng định lƣợng λmax. Từ lƣợng mẫu thử đã c}n, độ hấp thu At củ dung dịch mẫu thử T v| Ac cũng nhƣ nồng độ củ dung dịch mẫu chuẩn silybin dung dịch chuẩn C , dự v|o độ ph loãng củ c{c dung dịch mẫu thử để tính r tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong c{c chế phẩm C{c quy trình định lƣợng chế phẩm cũng đƣợc thẩm định về tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính x{c v| độ đúng theo ICH(2). KẾT QUẢ Định tính silybin trong hạt cúc g i v| chế phẩm bằng phƣơng ph{p SKLM: Với 6 hệ dung m i đƣợc khảo s{t thì hệ dung m i CHCl3 – CH3CN 6:4 cho c{c vết fl vonolign n t{ch tốt nhất, có gi{ trị Rf củ vết tƣơng ứng với vết silybin đối chiếu bằng khoảng 0,5 do đó đƣợc lự chọn l|m hệ dung m i cho SKLM Kết quả Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 245 cho thấy trên sắc ký đồ củ c{c mẫu dƣợc liệu v| chế phẩm đều có vết có cùng m|u sắc v| gi{ trị Rf với vết củ silybin đối chiếu ây dựng quy trình định lƣợng tổng h m lƣợng flavonolignan t nh theo sily in trong dƣợc liệu hạt c c gai Khảo sát dung môi chiết Chuẩn bị dung dịch T bằng phƣơng pháp chiết đun hồi lƣu, với c{c dung m i kh{c nh u Quét phổ UV - Vis củ dung dịch thử thu đƣợc trong vùng 400-200 nm v| đo độ hấp thu tại bƣớc sóng λmax Kết quả thu đƣợc cho thấy độ hấp thu A của dịch chiết bằng EtOH 50% l| c o nhất. Tuy nhiên dịch chiết bằng EtOH 96% có m|u v|ng trong suốt, độ hấp thu chỉ kém chút ít so với dịch chiết bằng EtOH 50% v| phổ UV-Vis có đỉnh hấp thu rõ ràng, trong khi dịch chiết bằng c{c dung m i EtOH 30%, EtOH 50% v| EtOH 70% bị đục và phổ UV-Vis hình răng cƣ , kh ng có đỉnh rõ r|ng Vì vậy, chọn EtOH 96% làm dung môi chiết xuất cho quy trình định lƣợng. Khảo sát phương pháp chiết: Chuẩn bị dung dịch thử T bằng 2 phƣơng ph{p siêu }m v| đun hồi lƣu với dung m i chiết đã đƣợc chọn l| EtOH 96% Quét phổ UV - Vis củ dung dịch thử T thu đƣợc trong vùng 200- 400 nm v| đo độ hấp thu tại bƣớc sóng λmax. Ghi nhận độ hấp thu A Kết quả cho thấy phƣơng ph{p đun hồi lƣu cho độ hấp thu c o hơn phƣơng ph{p siêu }m nên chọn phƣơng ph{p chiết đun hồi lƣu cho quy trình định lƣợng. hảo sát thời gian chiết: Với dung m i l| EtOH 96% v| phƣơng ph{p chiết đun hồi lƣu đã khảo s{t, tiến h|nh chiết xuất trong c{c khoảng thời gi n kh{c nh u l| 20, 30 v| 45 phút Kết quả thu đƣợc cho thấy thời gi n chiết mẫu dƣợc liệu l| 30 phút x 3 lần l| tối ƣu do đã chiết kiệt đƣợc c{c hoạt chất, thời gi n chiết cũng kh ng qu{ d|i hảo sát ước sóng định lượng: Tiến h|nh quét phổ hấp thu UV-Vis củ c{c dung dịch thử T với c{c điều kiện chiết xuất đã lự chọn v| dung dịch chuẩn C củ silybin trong khoảng 200-400 nm Kết quả cho thấy phổ củ dung dịch thử v| chuẩn đều có đỉnh hấp thu cực đại λmax = 288 nm hình 1 Do đó chọn bƣớc sóng định lƣợng l| 288 nm ình : Phổ hấp thu UV-Vis của dung dịch mẫu thử v| dung dịch silybin chuẩn Nhƣ vậy quy trình định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong dƣợc liệu hạt cúc g i qu kết quả nghiên cứu nhƣ s u: Chuẩn ị các dung dịch mẫu thử và chuẩn Dung dịch chuẩn silybin C C}n chính x{c khoảng 20 mg silibin chuẩn, chuyển v|o trong bình định mức dung tích 100 ml, thêm khoảng 40 ml eth nol 96%, đun c{ch thủy ở 70 - 80 0C cho đến khi t n ho|n to|n S u khi để nguội, thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch chuẩn A Hút chính x{c 1 ml dung dịch A v|o bình định mức 25 ml, thêm eth nol 96% đến vạch, lắc đều, thu đƣợc dung dịch chuẩn C Dung dịch thử T C}n chính x{c khoảng 1,00 g dƣợc liệu nghiền nhỏ đến kích thƣớc 1mm cho v|o bình nón nút m|i loại 100 ml, thêm 30 ml eth nol 96%, đun hồi lƣu ở 90-95 oC trong 30 phút Để nguội rồi s u đó lọc qu giấy lọc v|o bình định mức thể tích 100 ml Lặp lại qu{ trình chiết xuất 2 lần nữ , gộp dịch lọc trong bình u ị ử u ị uẩ C Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 246 định mức 100 ml v| thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch Hút chính x{c 1 ml dung dịch cho v|o bình định mức 25 ml v| thêm eth nol 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch T Đo mẫu Lắc đều, để yên trong 20 phút Đo độ hấp thu củ dung dịch mẫu thử T v| mẫu chuẩn C tại bƣớc sóng λmax = 288 nm. Ghi nhận độ hấp thu A của mẫu chuẩn và thử. Công thức tính tổng hàm lượng flavonolignan tính theo sily in trong g hạt Cúc gai: X= Trong đó: X – H|m lƣợng tổng flavonolignan theo silybin trong 100 g Cúc gai, % At – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu thử dung dịch T Ac – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu chuẩn silybin (dung dich C) mt – Khối lƣợng mẫu thử, g mc – Khối lƣợng chuẩn silybin, g W – Mất khối lƣợng do l|m kh củ dƣợc liệu, % Kết quả thẩm định quy trình định lƣợng tổng h m lƣợng flavonolignan t nh theo sily in trong hạt C c gai Phổ UV-Vis của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn đều có đỉnh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 288 nm giống nhƣ mẫu chuẩn silybin. Khi thêm dung dịch chuẩn silybin vào mẫu thử, độ hấp thu của mẫu thử thêm chuẩn tăng lên rõ rệt tại đỉnh hấp thu này so với lúc chƣ thêm chuẩn silybin. Mẫu trắng kh ng có đỉnh hấp thu độ hấp thu xấp xỉ bằng 0 trong vùng 200 – 400 nm Nhƣ vậy, quy trình định lƣợng có tính đặc hiệu Có sự tƣơng qu n tuyến tính giữ độ hấp thu A và nồng độ của các dung dịch mẫu chuẩn theo phƣơng trình ŷ = 0,0511x; R2 = 0,9999 trong khoảng nồng độ silybin từ 5 – 32 µg/ml Độ lặp lại đƣợc khảo s{t trên 6 mẫu thử hạt Cúc g i cho thấy quy trình có độ lặp lại tốt với RSD% l| 3,1% H|m lƣợng tổng fl vonolign n tính theo silybin trong hạt Cúc g i tính theo gi{ trị trung bình củ 6 lần định lƣợng l| 3,8% Độ đúng đƣợc thẩm định bằng phƣơng ph{p thêm chuẩn silybin cho thấy quy trình có độ đúng c o với khoảng tỷ lệ phục hồi l| 102,2% với RSD l| 2,7% Quy trình định lƣợng tổng flavonolignan t nh theo sily in trong các mẫu chế phẩm đơn giản hơn về phƣơng pháp xử l mẫu thử vì nền mẫu t phức tạp hơn d chiết xuất hoạt chất hơn Chuẩn ị dung dịch mẫu chuẩn C Tiến h|nh nhƣ trong quy trình định lƣợng dƣợc liệu hạt cúc g i Chuẩn bị dung dịch mẫu thử Lấy 20 đơn vị chế phẩm để tính khối lƣợng trung bình củ dƣợc chất trong mỗi chế phẩm. Đối với viên nang cứng LI v| SI: C}n khối lƣợng 1viên nang, ghi nhận kết quả. Tách vỏ n ng, đổ dƣợc chất r , l u sạch vỏ nang rồi đem c}n lại vỏ nang, ghi nhận kết quả Hiệu giữ h i lần c}n l| khối lƣợng dƣợc chất trong một viên n ng Tiến hành cho 20 viên và tính khối lƣợng trung bình củ dƣợc chất trong một viên Đối với viên nén bao phim SA: Bóc lớp m|ng b o phim bên ngo|i từng viên nén rồi đem c}n, ghi nhận kết quả. Tiến h|nh lần lƣợt cho 20 viên và tính khối lƣợng trung bình củ 1 viên nh}n Trộn đều dƣợc chất từ 20 đơn vị chế phẩm, c}n 1 lƣợng tƣơng ứng khối lƣợng trung bình củ 1 đơn vị đối với chế phẩm SI c}n lƣợng bột viên tƣơng ứng với 2 lần khối lƣợng trung bình củ dƣợc chất trong một viên , chuyển vào bình định mức 100 ml Thêm khoảng 50 ml EtOH 96%, siêu âm trong 30 phút. Thêm EtOH 96%, điền đến vạch. Trộn đều, lọc qua giấy lọc, bỏ khoảng 10 ml dịch lọc đầu, thu đƣợc dịch lọc D1. Hút chính xác 5 ml dịch lọc D1 cho v|o bình định mức 100 ml, thêm EtOH 96% đến vạch, thu đƣợc dung dịch D2. Hút chính xác 2 ml dung dịch D2 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 247 cho v|o bình định mức 25 ml, thêm EtOH 96 % đến vạch thu đƣợc dung dịch thử T - Đo độ hấp thu dung dịch T và dung dịch chuẩn silybin C ở bƣớc sóng 288 nm. - Công thức tính tổng h|m lƣợng fl volign n tính theo silybin trong chế phẩm: Х = =10× Trong đó X – Lƣợng flavonolignan theo sylibin trong 1 viên chế phẩm, mg At – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu thử dung dịch T Ac – Độ hấp thu củ dung dịch mẫu chuẩn silybin (dung dich C) mt – Khối lƣợng mẫu thử, g mc – Khối lƣợng chuẩn silybin, g – Khối lƣợng trung bình 1 viên, mg Dt – Độ pha loãng của mẫu thử Dc – Độ pha loãng của mẫu chuẩn Kết quả thẩm định về độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại v| độ đúng cho cả 3 chế phẩm LI, SA v| SI cho thấy quy trình có độ đặc hiệu c o, độ lặp lại tốt RSD% củ độ lặp lại đối với c{c chế phẩm LI, SA, SI lần lƣợt l| 1,9%; 1,2%; 1,8% , độ đúng c o khoảng tỷ lệ phục hồi đối với c{c chế phẩm LI, SA, SI lần lƣợt l| 98,4%; 99,6%; 99,5% với RSD% tƣơng ứng: 1,7%; 2,0%; 1,9%). Kết quả định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong c{c mẫu chế phẩm đƣợc tính bằng trung bình cộng củ 6 lần thực nghiệm Tổng h|m lƣợng củ fl vonolign n tính theo silybin trong c{c chế phẩm LI, SA v| SI tính cho một đơn vị viên chế phẩm thu đƣợc lần lƣợt l|: 196,5 mg; 243,0 mg; 50,4 mg. BÀN LUẬN Chọn dung m i chiết mâ u thư : Kết quả thu đươ c cho thấy độ hấp thu A của dịch chiết bằng dung m i EtOH 50% l| c o nhất. Tuy nhiên dịch chiết bằng EtOH 96% có m|u v|ng trong suốt, độ hấp thu chỉ kém chút ít so vơ i dịch chiết bă ng EtOH 50% và phổ UV-Vis có đỉnh hấp thu rõ ràng, trong khi dịch chiết bằng c{c dung m i EtOH 30%, EtOH 50% v| EtOH 70% bị đục và phổ UV-Vis hình răng cư , kh ng có đỉnh rõ r|ng Vì vậy, EtOH 96% đươ c chọn làm dung môi chiết xuất cho quy trình định lượng. Quy trình định lươ ng tổng fl vonolign n tính theo silybin trong c{c m â u chê phâ m đơn giản hơn về phương ph{p xư lý mẫu thư vì nền mâ u ít phư c tạp hơn, dễ chiê t xuất hoạt châ t hơn. Phương ph{p định lươ ng kh{ đơn giản nhưng có độ chính x{c v| độ đúng c o, tuy nhiên do l| phương ph{p qu ng phổ n ên độ chọn lọc kh ng c o, khi tiến h|nh định lươ ng bă ng phương ph{p qu ng phổ UV-Vis n|y phải đi k m vơ i định tính bă ng phương ph{p SKLM để đảm bảo lươ ng hoạt chất trong mâ u thư đươ c đo quang ơ 288 nm chủ yếu l| silybin v| c{c fl vonolign n kh{c có trong mẫu. KẾT LUẬN Đã x}y dựng đƣợc quy trình x{c định tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong hạt cúc g i v| chế phẩm Kết quả thẩm định quy trình cho thấy c{c quy trình đều có độ đặc hiệu c o, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại tốt v| độ đúng c o Áp dụng c{c quy trình đã đƣợc thẩm định để x{c định đƣợc tổng h|m lƣợng fl vonolign n tính theo silybin trong hạt cúc g i l| 3,8% tính trên dƣợc liệu kh kiệt ; trong c{c chế phẩm LI, SA, SI lần lƣợt l| 196,5 mg; 243,0 mg v| 50,4 mg trong 1 viên chế phẩm Kết quả thu đƣợc trên c{c mẫu chế phẩm đều có sự kh{c biệt lớn so với h|m lƣợng silym rin ghi trên nhãn tƣơng ứng l| 140 mg; 140 mg; v| 70 mg Điều n|y cho thấy rất cần thiết đƣ chỉ tiêu định lƣợng tổng h|m lƣợng fl vonolign n v|o tiêu chuẩn củ c{c thực phẩm chức năng từ hạt Cúc g i để góp phần Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 248 kiểm so{t đƣợc chất lƣợng củ c{c thực phẩm chức năng n|y TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ajit KK (2011), Milk thistle (Silybum marianum): A review, pp. 3- 7. 2. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp. 1 - 13. 3. Jane MM, Mary C, Kathi JK (2000), Milk thistle (Silybum marianum), pp. 3 - 11 4. Ramawat KG, Merillon JM (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants, pp. 131 - 137. 5. Venketeshwer R (2012), Phytochemicals – A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, pp. 213-216, pp. 261-264. 6. Võ Văn Chi 2012 , Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Hà Nội, tr. 670-671. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018