Xác định và phân tích in silico các gen DREB2 ở cây quýt (citrus clementina)

JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE DOI: 10.18173/2354-1059.2015-00018 Natural Sci. 2015, Vol. 60, No. 4, pp. 127-131 This paper is available online at Ngày nhận bài: 2/3/2015. Ngày nhận đăng: 17/5/2015. Tác giả liên lạc: Cao Phi Bằng, địa chỉ e-mail: phibang.cao@hvu.edu.vn 127 XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TÍCH IN SILICO CÁC GEN DREB2 Ở CÂY QUÝT (Citrus clementina) Cao Phi Bằng Khoa Sinh học, Trường Đại học Hùng Vương, Phú Thọ Tóm tắt. Các gen DREB2 thuộc về phân nhóm A2 của họ tác nhân phiên mã DREB (dehydration- responsive element binding), giữ vai trò quan trọng trong trả lời với các stress vô sinh ở thực vật. Trong công trình này, chúng tôi sử dụng cách tiếp cận in silico để xác định và phân tích bốn gen DREB2 của cây quýt (Citrus clementina). Chúng đều có chứa vùng bảo thủ AP2 (PF00847) và motif đặc trưng KGCM[RK]GKGGPxN. Các gen DREB2 có độ dài từ 633 tới 1581 pb. Chỉ gen CclDREB2-2 có một intron, ba gen còn lại mã hóa liên tục. Các protein suy diễn có độ dài từ 210 tới 339 axit amin. Các protein này có tính axit với các giá trị pI dao động trong khoảng từ 4,80 tới 6,99. Cây di truyền cho thấy các gen này phân bố trên ba nhánh khác nhau. Trong các protein suy diễn DREB2, không tìm thấy motif PEST nhưng lại có các axit amin là các vị trí phosphoryl hóa tiềm năng của các protein kinase. Bên cạnh đó, các axit amin đặc trưng cho vị trí ubiquitin hóa được tìm thấy ở các protein DREB2, ngoại trừ CclDREB2-3. Từ khóa: Gen DREB2, cây di truyền, đặc điểm hóa - lí, in silico, quýt. 1. Mở đầu Cây quýt (Citrus clementina) thuộc họ Cam, họ cây ăn quả quan trọng trên thế giới. Sản lượng của các cây trong họ Cam đạt 122,3 triệu tấn năm 2009 (FAO 2009). Ở Việt Nam, sản lượng hàng năm của các cây thuộc họ cam đạt khoảng 700 nghìn tấn (Thống kê Việt Nam 2012). Một trong những con đường trả lời các stress mất nước và nhiệt độ cao ở thực vật được biết là con đường phụ thuộc axit abxixic (ABA) thông qua các tác nhân phiên mã DREB2 [1]. Các DREB2 thuộc về nhóm A2 của họ tác nhân phiên mã DREB (dehydration-responsive element binding) [2]. Giống như các protein cùng họ khác, các DREB2 có một vùng bảo thủ có khả năng gắn với ADN gọi là vùng AP2 nhưng chúng khác với các protein cùng họ DREB bởi sự có mặt của motif đặc trưng GKGGPxN nằm phía trước vùng AP2. Các DREB2 gắn với yếu tố cis GCCGAC, được gọi tên là DRE (Dehydration Responsive Element), trong vùng khởi động của các gen đích và kích hoạt sự biểu hiện của chúng. Các DREB2 có khối lượng phân tử biến đổi trong một phạm vi rộng tùy loài thực vật. Phân tích cây di truyền của các DREB2 nhiều loài thực vật khác nhau cho thấy chúng có thể được xếp vào ba phân nhóm khác nhau. Các nghiên cứu về biểu hiện gen cho thấy các DREB2 thuộc phân nhóm 1 biểu hiện dưới tác động của điều kiện mất nước, nhiệt độ cao. Các DREB2 thuộc phân nhóm 2 và 3 hầu như không bị cảm ứng bởi điều kiện mất nước. Nghiên cứu chức năng bằng cách chuyển gen DREB2 làm tăng khả năng chống chịu với các stress vô sinh như khô hạn, nhiệt độ cao và mặn ở các cây chuyển gen của nhiều loài thực vật [3]. Sự có mặt của các vị trí phosphoryl hóa và ubiquitin hóa gợi ý Cao Phi Bằng 128 về các cơ chế điều hòa sau phiên mã và sau dịch mã [1]. Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đáng kể đã được thực hiện để xác định các gen DREB2 trong hệ gen của thực vật cùng với toàn bộ các gen thuộc siêu họ AP2, trong đó có các loài thân gỗ hay thực vật khác [2, 4]. Do có vai trò đặc biệt quan trọng trong trả lời với các stress vô sinh của các DREB2, trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới xác định trình tự của bốn DREB2 của cây quýt. Các đặc trưng, các motif bảo thủ cũng như cấu trúc của chúng cũng được xác định nhờ các phương pháp in silico. Bên cạnh đó, kết quả phân tích cây phả hệ cũng sẽ được giới thiệu trong công trình này. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Phương pháp nghiên cứu * Cơ sở dữ liệu: Trình tự hệ gen của cây quýt được lấy từ Wu và nnk (2014) [5]. Các trình tự DREB2 của cây Arabidopsis được lấy từ Sakuma và nnk (2002) [2]. * Xác định các gen DREB2 ở cây quýt: Các protein DREB2 của cây Arabidopsis [2] được dùng làm khuôn dò, chương trình TBLASTN được sử dụng để tìm kiếm các gen tương đồng trên dữ liệu hệ gen của cây quýt với giá trị e-value ở mức e-5. * Xác định các motif bảo thủ: Các motif từ các DREB2 ở cây quýt và một số thực vật khác được tìm bằng phần mềm MEME [6]. * Tạo cây phả hệ: Các trình tự protein DREB2 được sắp dãy bằng cách dùng phần mềm MAFFT [7]. Cây phả hệ được xây dựng từ các DREB2 đã sắp dãy bằng phần mềm MEGA5 nhờ sử dụng phương pháp Maximum Likelihood, dữ liệu được xử lí là tất cả các vị trí và phương pháp Bootstrap với 1000 lần lặp lại [8]. * Các đặc điểm hóa - lí và cấu trúc không gian: Các đặc điểm vật lí, hóa học của các gen/protein được khảo sát nhờ các phần mềm của ExPASy [9]. Cấu trúc không gian của vùng AP2 được xây dựng nhờ phần mềm Phyre2 [10]. Các vị trí phosphoryl hóa trong phân tử protein suy diễn được xác định bằng các phần mềm Musite [11]. Các vị trí ubiquitin hóa được xác định bằng chương trình UbPred [12]. 2.2. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 2.2.1. Xác định bốn gen DREB2 ở cây quýt Bước đầu chúng tôi xác định được bốn gen có thể mã hóa cho các DREB thuộc phân nhóm A2 (Bảng 1). Như vậy, số lượng gen DREB2 được tìm thấy ở cây quýt ít hơn ở cây Arabidopsis, cây dương, cây nho hay cây táo [2, 4]. Bảng 1. Các DREB2 ở cây quýt và đặc điểm của chúng Tên Locus Kích thước Gen (bp) Kích thước protein (aa) Khối lượng phân tử (kDa) pI Số lượng Intron CclDREB2-1 Ciclev10022244m.g 633 210 23,25 6,09 0 CclDREB2-2 Ciclev10032029m.g 1581 339 38,20 4,80 0 CclDREB2-3 Ciclev10002280m.g 747 248 27,12 6,99 0 CclDREB2-4 Ciclev10005549m.g 882 293 32,64 6,27 1 2.2.2. Đặc điểm của các DREB2 của cây quýt Các gen DREB2 của cây quýt có độ dài từ 633 tới 1581 bp, quy định các protein có kích thước từ 210 tới 339 axit amin, tương ứng với khối lượng phân tử từ 23,25 kD tới 38,20 kD, trong đó, DREB2- 2 có kích thước lớn nhất. Các CclDREB2 có tính axít yếu với các giá trị điểm đẳng điện (pI) dao động từ 4,80 tới 6,99 (Bảng 1). Những kết quả nghiên cứu này khá phù hợp với các nghiên cứu về các DREB2 của một số loài khác [2, 4]. Xác định và phân tích in silico các gen DREB2 ở cây quýt (Citrus clementina) 129 2.2.3. Xác định các motif bảo thủ và cấu trúc không gian của các DREB2 của cây quýt Hình 1. Biểu tượng trình tự axit amin của vùng bảo thủ AP2 (A) và motif đặc trưng (B) của các DREB2 Hình 2. Kết quả sắp dãy các DREB2 của cây quýt Vùng bảo thủ AP2 nằm trong ô có đường kẻ liền. Motif đặc trưng nằm trong ô có đường kẻ đứt. Dấu sao: các axit amin bảo thủ, dấu sao trong ô tròn: các vị trí gắn AND, kí tự in đậm, nghiêng: vị trí phosphoryl hóa, kí tự in đậm, gạch chân: vị trí ubiquitin hóa. Vùng bảo thủ AP2 (PF00847) và motif đặc trưng cho các DREB thuộc phân nhóm A2 được tìm thấy ở cả bốn DREB2 của cây quýt. Trình tự của vùng bảo thủ cũng như motif đặc trưng được giới thiệu trong Hình 1 và Hình 2. Kết quả sắp dãy các CclDREB2 nhờ sử dụng phần mềm MAFFT minh họa rõ hơn về các motif và vị trí của chúng trong phân tử protein. Các axit amin có khả năng gắn với ADN cũng được xác định nằm trong vùng bảo thủ AP2 (Hình 2). Các vị trí phosphoryl hóa và ubiquitin hóa được tìm thấy trong cả bốn protein DREB2 của cây quýt. Kết quả này phù hợp với nhiều báo cáo trước đó về các gen DREB2 [3]. Đồng thời, gợi ý rằng các gen DREB2 của cây quýt có thể được điều hòa bằng các cơ chế điều hòa sau phiên mã. Cao Phi Bằng 130 Cấu trúc không gian vùng bảo thủ AP2 của các DREB2 được xây dựng nhờ chương trình Phyre2 (Hình 3). Kết quả chỉ ra cả bốn DREB2 đều có 3 chuỗi  và 1 xoắn . Cấu trúc này tương đồng với các DREB thuộc nhóm A1, các DREB cũng có khả năng gắn lên yếu tố cis GCCGAC giống như các DREB2 [1, 2]. Hình 3. Mô hình 3D cấu trúc bậc hai của các DREB2 của cây quýt. (A) DREB2-1, (B): DREB2-2, (C): DREB2-3, (D): DREB2-4 2.2.4. Phân tích cây phả hệ và phân loại các DREB2 Hình 4. Cây phả hệ được xây dựng từ các DREB2 của cây quýt (Ccl), cây táo (Md), cây dương (Pt), cây nho (Vv) và cây Arabidopsis (At) Cây phả hệ được thiết lập từ các protein DREB2 của câu quýt, cây táo, cây dương và cây Arabidopsis được thể hiện ở Hình 4. Kết quả cho thấy các DREB2 của cây quýt nằm trên ba nhánh khác nhau của cây di truyền. Điều này gợi ý rằng các DREB2 của cây quýt có thể được xếp vào ba phân nhóm khác nhau. Kết quả này phù hợp với sự phân loại các DREB2 ở nhiều loài thực vật khác [1]. Cây phả hệ cũng cho thấy ở cây quýt không có sự kiện nhân gen nào xảy ra sau thời điểm biệt hóa loài như ở các cây Arabidopsis, cây dương và đặc biệt là cây táo. Đây có thể là nguyên nhân giải thích tại sao số lượng gen DREB2 ở cây quýt ít hơn so với ở các loài cây trên. 3. Kết luận Trong công trình này chúng tôi đã xác định được bốn gen DREB2 của cây quýt. Đặc điểm lí-hóa của các gen này đã được khảo sát. Các motif bảo thủ và cấu trúc của chúng cũng được báo cáo trong bài báo này. Hơn nữa, kết quả phân tích cây phả hệ cho phép kết luận các DREB2 của cây quýt được chia thành ba nhóm. Đây là những kết quả bước đầu có ý nghĩa quan trọng, mở đường cho việc nghiên cứu chức năng của các DREB2 ở loài cây này. Xác định và phân tích in silico các gen DREB2 ở cây quýt (Citrus clementina) 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mizoi J., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K., 2012. AP2/ERF family transcription factors is plant abiotic stress responses. Biochem Biophys Acta, 1819(2), pp. 86-96. [2] Sakuma Y., Liu Q., Dubouzet J. G., et al., 2002. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and cold- inducible gene expression. Biochem Biophys Res Commun, 290(3), pp. 998-1009. [3] Agarwal P., Reddy M. and Sopory S., 2006. Role of DREB transcription factors in abiotic and biotic stress tolerance in plants. Plant Cell Rep, 25(12), pp. 1263-1274. [4] Girardi C. L., Rombaldi C. V., Dal Cero J., et al., 2013. Genome-wide analysis of the AP2/ERF superfamily in apple and transcriptional evidence of ERF involvement in scab pathogenesis. Sci Hort, 151(0), pp. 112-121. [5] Wu G. A., Prochnik S., Jenkins J., et al., 2014. Sequencing of diverse mandarin, pummelo and orange genomes reveals complex history of admixture during citrus domestication. Nat Biotech, 32(7), pp. 656-662. [6] Bailey T. L., Williams N., Misleh C. and Li W. W., 2006. MEME: discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs. Nucleic Acids Res, 34(suppl 2), pp. W369-W373. [7] Katoh K. and Standley D. M., 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol Biol Evol, 30(4), pp. 772-780. [8] Tamura K., Peterson D., Peterson N., et al., 2011. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 28(10), pp. 2731-2739. [9] Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., et al., 2005. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server. The proteomics protocols handbook. Springer. pp. 571-607. [10] Kelley L. A. and Sternberg M. J., 2009. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat Protoc, 4, pp. 363-371. [11] Wong Y. H., Lee T. Y., Liang H. K., et al., 2007. KinasePhos 2.0: a web server for identifying protein kinase-specific phosphorylation sites based on sequences and coupling patterns. Nucleic Acids Res, 35, pp. W588-594. [12] Radivojac P., Vacic V., Haynes C., et al., 2010. Identification, analysis, and prediction of protein ubiquitination sites. Proteins, 78(2), pp. 365-380. ABSTRACT Identification and in silico analysis of DREB2 genes in Clementine oranges (Citrus clementina) DREB2 genes belong to the A2 subgroup of DREB (dehydration-responsive element binding) transcription factor family which plays an important role in the response to abiotic stress in plants. In this work, we used the in silico approach to identify and analyze four DREB2 genes in Clementine oranges (Citrus clementina). These genes contain an AP2 conserved domain (PF00847) and typical KGCM[RK]GKGGPXN motif. The full-length genomic sequence of clementine DREB2 genes includes those from 633 to 1581 pb. Clementine DREB2 genes are a continously coding gene except for CclDREB2-2 which has an intron region. In silico analysis results showed that the full-length predicted protein sequences contain 387 to 392 amino acids. All of the DREB2 proteins are acidic or neutral with a pI value ranging from 4.80 to 6.99. A phylogenetic tree analysis showed four CclDREB2 genes distributed on three different branches. We did not find any PEST motif in the CclDREB2 proteins, however, the potentially targeted sites of protein kinases were present on all four proteins. In addition, characterized residues for the ubiquitination sites were found in the DREB2 proteins, except for CclDREB2-3. Keywords: DREB2 genes, phylogenetic tree, physico-chemical properties, in silico, Clementine.