Xây dựng bộ chỉ thị phân tử RAPD và ISJ để xác định độ đa hình và tần số đột biến ở ngô

46 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 XÂY DỰNG BỘ CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ ISJ ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐA HÌNH VÀ TẦN SỐ ĐỘT BIẾN Ở NGÔ Trần Thị Thúy1, Đậu Thị Ngọc Ngà1, Nguyễn Thị Loan1, Bùi Hồng Ngọc1, Trần Hồng Quân1, Trần Thị Ngọc Diệp1, Trần Đăng Khánh1, Khuất Hữu Trung1, Vi Lạng Sơn1 TÓM TẮT Nghiên cứu đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD và ISJ để đánh giá và xác định tần số đột biến của quần thể ở ngô được tạo ra từ gây đột biến hạt phấn với hóa chất EMS. Kết quả sử dụng 50 mồi RAPD và 2 mồi ISJ với DNA của giống ngô ML10 (giống nền sử dụng để tạo quần thể đột biến) đã xác định được 10 mồi đa hình từ 3 - 4 băng. Trong 10 mồi sử dụng, có 5 mồi chạy ổn định và lặp lại tốt giữa 186 mẫu DNA được tách từ 186 cá thể M1 từ quần thể đột biến. Tần số đột biến trung bình cho cả 5 mồi là 1/34,3 kb. Nghiên cứu này là bước đầu tiên đánh giá chất lượng quần thể đột biến bằng chỉ thị phân tử. Kết quả mở đường cho các nghiên cứu khác như sàng lọc kiểu hình, giải mã hệ genome, để đánh giá sâu hơn quần thể đột biến EMS ở ngô ML10 làm cơ sở cho nghiên cứu cơ bản chức năng gene và chọn giống. Từ khóa: RAPD, ISJ, tần số đột biến 1 Viện Di truyền Nông nghiệp I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây ngô là một cây trồng có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Vì vậy, có rất nhiều các nghiên cứu trên thế giới sử dụng cây ngô làm cây mô hình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. Rất nhiều gene ở ngô đã được làm sáng tỏ chức năng dựa vào việc tìm và nghiên cứu các biến dị tự nhiên/nhân tạo. Phần lớn các đột biến nhân tạo trên ngô được tạo ra bằng hai cách: dùng EMS xử lí hạt phấn, hoặc lai với dòng có transposon đang có khả năng “nhảy” (transpose) mạnh (Candela and Hake, 2008). Gerald Neuffer đã tạo ra rất nhiều đột biến được sử dụng bởi các nhà khoa học trên thế giới cho đến nay (Neuffer, 1994). Để đánh giá chất lượng của một quần thể đột biến, người ta có thể dựa vào tần số tìm thấy các đột biến kiểu hình khác dạng so với dòng gốc. Đánh giá này dễ dàng và trực quan nhưng lại không thể phát hiện các đột biến điểm không gây ra kiểu hình. Vì vậy người ta sẽ kết hợp với phương pháp dùng chỉ thị phân tử để kiểm tra ước tính tần số đột biến. Mồi RAPD (random amplified polymorphic DNA) là những đoạn nucleotide (oligonucleotide) 10bp có thể bám vào DNA khuôn và nhân lên sản phẩm PCR. Sự xuất hiện thêm băng mới hay mất đi một băng là kết quả của việc vị trí bám mồi trên DNA khuôn bị thay đổi ít nhất 1 bp hoặc hơn. Trong trường hợp gây đột biến bằng EMS, phần lớn sự thay đổi là đột biến điểm (thay 1 nucleotide). Chen và cộng tác viên (2012) đã sử dụng RAPD để ước tính tần số đột biến trên quần thể đột biến lúa mì bằng EMS. Mồi ISJ (Intron-exon Spliced Junction) là loại mồi được thiết kế dựa trên trình tự bảo thủ của nơi tiếp giáp và cắt giữa intron và exon theo Weining và cộng tác viên (1991); Zeng và cộng tác viên (2010). Mồi ISJ thường có 15 nucleotit và vì thế nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi này thường cao hơn (Tm khoảng 46ºC) mồi RAPD (10 bp Tm khoảng 31ºC). Vì vậy, khả năng lặp lại của phản ứng PCR tốt hơn mồi RAPD. Cách tính tần số đột biến với mồi ISJ giống với mồi RAPD. Bằng xử lí hạt phấn với EMS trên dòng ngô nội thuần chủng ML10, chúng tôi đã tạo được quần thể đột biến. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuẩn hóa điều kiện PCR và sàng lọc các mồi RAPD chạy ổn định ở dòng ngô ML10, từ đó xác định được tần số đột biến của quần thể đột biến EMS trên giống ngô ML10. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Dòng mẹ ML10 của giống lai đơn LVN10 được lựa chọn để xử lí đột biến. Giống ngô lai đơn LVN10 có nguồn gốc của Viện Nghiên cứu Ngô, được công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật tháng 8 năm 1994. Mặc dù đã được tạo ra cách đây 25 năm nhưng hiện giống LVN10 vẫn là giống được nhiều hộ nông dân chọn lựa vì năng suất cao và khả năng thích ứng với mọi vùng sinh thái trong cả nước. - Các mồi RAPD và ISJ. 47 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Bảng 1. Danh sách các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) 1 OPO01 GGC ACG TAA 18 OPO18 CTC GCT ATC 35 OPN15 CAG CGA CTG 2 OPO02 ACG TAG CGT 19 OPO19 GGT GCA CGT 36 OPN16 AAG CGA CCT 3 OPO03 CTG TTG CTA 20 OPO20 ACA CAC GCT 37 OPN17 CAT TGG GGA 4 OPO04 AAG TCC GCT 21 OPN01 CTC ACG TTG 38 OPN18 GGT GAG GTC 5 OPO05 CCC AGT CAC 22 OPN02 ACC AGG GGC 39 OPN19 GTC CGT ACT 6 OPO06 CCA CGG GAA 23 OPN03 GGT ACT CCC 40 OPN20 GGT GCT CCG 7 OPO07 CAG CAC TGA 24 OPN04 GAC CGA CCC 41 OPF01 ACG GAT CCT G 8 OPO08 CCT CCA GTG 25 OPN05 ACT GAA CGC 42 OPAA03 TTA GCG CCC C 9 OPO09 TCC CAC GCA 26 OPN06 GAG ACG CAC 43 OPAA04 AGG ACT GCT C 10 OPO10 TCA GAG CGC 27 OPN07 CAG CCC AGA 44 OPAB01 CCG TCG GTA G 11 OPO11 GAC AGG AGG 28 OPN08 ACC TCA GCT 45 OPAH03 GGT TAC TGC C 12 OPO12 CAG TGC TGT 29 OPN09 TGC CGG CTT 46 OPAJ01 ACG GGT CAG A 13 OPO13 GTC AGA GTC 30 OPN10 ACA ACT GGG 47 OPAJ05 CAG CGT TGC C 14 OPO14 AGC ATG GCT 31 OPN11 TCG CCG CAA 48 OPBA01 TTC CCC ACC C 15 OPO15 TGG CGT CCT 32 OPN12 CAC AGA CAC 49 OPBB01 ACA CTG GCT G 16 OPO16 TCG GCG GTT 33 OPN13 AGC GTC ACT 50 OPBB05 AACAGGGCCG 17 OPO17 GGC TTA TGC 34 OPN14 TCG TGC GGG Bảng 2. Danh sách các mồi ISJ sử dụng trong nghiên cứu (trình tự mồi thiết kế theo Weining và cộng tác viên, 1991). STT Tên mồi Trình tự mồi (5’3’) 1 E2 GGAATTCCA CGTCCA 2 R2 TGCTGGTTTGCA GGT 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xử lí đột biến Ngô được trồng hai vụ ở Hà Nội: vụ Xuân trồng vào tháng 2, vụ Mùa trồng vào tháng 8. Phương pháp gây đột biến được thực hiện theo (Neuffer (1994). Hạt phấn ngô được thu thập mới vào buổi sáng trong túi bao cờ (cờ đã được bọc từ chiều hôm trước đó). Khoảng 1220 ml phấn được ủ với 70 ml dầu Mineral oil (Sigma) chứa EMS (Sigma) ở nồng độ 0,05% trong 30 phút. Sau đó, dung dịch hạt phấn trong dầu được nhỏ vào râu ngô. Các hạt ngô thu được từ bắp xử lí gọi là các hạt M1. Trong nghiên cứu này sử dụng 186 cá thể M1 ngẫu nhiên từ quần thể đột biến từ dòng ML10. 2.2.2. Phương pháp PCR, điện di - Mẫu lá được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Doyle JJ và Dolyl JL, 1990). - Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96 well Thermal cycler. Tổng thể tích phản ứng là 15 µl, bao gồm: Taq2X Mastermix (NEB): 7,5 µl; DNA khuôn: 3 µl; mồi (5 µM): 3 µl, H2O: 1,5 µL. Chu trình nhiệt: 95ºC: 5 phút; sau đó lặp lại 40 chu kì: 95ºC: 30 giây, 31ºC (với mồi RAPD) hoặc 46ºC (với mồi ISJ): 1 phút, 68ºC: 2 phút và kết thúc bằng 68ºC: 10 phút. - Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,0%. Gel được nhuộm ethidium bromide 0,5 mg/ml và soi trên máy Alpha Imager 1220 (Alpha Innotech, CA, USA). - Công thức tính tần số đột biến dựa vào số nucleotide đã được sàng lọc nhờ chạy RAPD, ISJ như sau: Với mỗi mồi RAPD có chiều dài là “n”, có số băng nhân lên ở dòng wild-type (chưa gây đột biến) là “X”, số băng mới xuất hiện thêm (hoặc bớt) là “Y”, và chạy kiểm tra “Z” cá thể. Tần số đột biến = Y/((nx2) ˟ X ˟ Z). Đơn vị 1/base pair (1/bp) theo Chen và cộng tác viên (2012). 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2018 tại Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp. 48 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả chuẩn hoá PCR mồi RAPD và ISJ ở ngô 50 mồi RAPD đã được sử dụng với DNA của giống ngô ML10 (giống nền sử dụng để tạo quần thể đột biến) và cho kết quả như hình 1. Hình 1. Kết quả chạy kiểm tra các mồi RAPD cho mẫu ngô ML10 Ghi chú: M là thang DNA O’Generuler 1kb của Thermo; (-) là đối chứng âm (có mồi OPN16) nhưng thay thế DNA khuôn bằng nước cất; (+) đối chứng dương: mồi OPN16, DNA ML10. Nhằm lựa chọn các mồi có nhiều điểm bám để phục vụ kiểm tra được nhiều vị trí trong hệ gene của ngô, chúng tôi chọn những mồi có lên từ ba băng trở lên để chạy lại và cho kết quả như hình 2. Các mồi RAPD cho từ 3 băng trở lên và ổn định qua hai lần lặp lại là: OPO3, OPO6, OPO7, OPO10, OPO11, OPO12, OPN3, OPN4, OPN11, OPN13, OPN16, OPN18, OPF01, OPAA03, OPAA04, OPAB01, OPAH03, OPBA01, OPBB01 (Hình 2). Trong số các mồi RAPD chạy ổn định này, các mồi có số băng rõ và có từ 4 băng trở lên là tám mồi: OPN4, OPN11, OPN16, OPN18, OPAA03, OPAB01, OPBA01, OPAH03. Hai mồi ISJ chạy khá ồn định là E2 và R2. Chúng tôi sẽ ưu tiên sử dụng 10 mồi này trước để sàng lọc quần thể đột biến. Hình 2. Kết quả chạy lặp lại các mồi RAPD với DNA của giống ngô ML10 Ghi chú: M (1) thang DNA O’Generuler 1kb của Thermo. 3.2. Xác định tần số đột biến bằng chỉ thị phân tử RAPD và ISJ 3.2.1. Tần số đột biến trên dòng ML10 Trong 10 mồi sử dụng, xác định được 5 mồi chạy ổn định và lặp lại tốt trên 186 mẫu cá thể M1 từ quần thể đột biến. Các mồi khác phản ứng PCR lên kém hoặc không có độ lặp lại ổn định giữa các mẫu DNA nên chúng tôi không sử dụng kết quả để tính tần số đột biến. Kết quả được tóm tắt trong bảng 2 và hình 3. Chúng tôi chỉ sử dụng các băng nào rõ, lặp lại được ở các mẫu chạy để tính tần số đột biến. 49 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Ví dụ: mồi R2 có thêm một số băng kích thước từ 500 - 700 bp nhưng không rõ và không lặp lại được ở tất cả các mẫu nên chúng tôi chỉ tính là có 3 băng rõ ở đối chứng (Hình 3). Kết quả bảng 2 cho thấy chỉ có 3 mồi (OPN16, E2, R2) chúng tôi phát hiện được cá thể có băng đột biến, hai mồi OPN18, OPAH03 không xuất hiện cá thể đột biến. Mồi OPN16, E2, R2 đều xuất hiện 1 vị trí đột biến (1 cá thể/186 cá thể kiểm tra). Tần số đột biến của 3 mồi OPN16, E2, R2 lần lượt là 1/26,7 kb; 1/27,9 kb; 1/16,7 kb. Như vậy, tính chung cho cả 5 mồi (tổng số đột biến (3)/tổng số nucleotide đã sàng lọc từ cả 5 mồi (103 kb): tần số đột biến là 1/34,3 kb. Lu và cộng tác viên (2018) dùng EMS đột biến hạt phấn trên giống ngô B73, sau đó đã giải mã exon (exon capture) các dòng M1, từ đó tính trung bình 4585 đột biến trên một dòng M1. Với hệ genome ngô là 2,300,000 kb, tần số đột biến của quần thể trong nghiên cứu bởi Lu và cộng tác viên (2018) là 1/500 kb. Tuy nhiên, đây là dựa trên giải mã chỉ đoạn exon chứ không phải genomic nên tần số đột biến của Lu và các cộng tác viên (2018) trên cả hệ genome có thể cao hơn. Hình 3. Hình ảnh chạy điện di sản phẩm PCR có xuất hiện băng đột biến của các mồi E2, R2 và OPN16 Ghi chú: Mũi tên chỉ mẫu có số băng thêm/bớt do đột biến. Bảng 2. Kết quả xác định tần số đột biến bằng chỉ thị phân tử Tên mồi Trình tự (5’-3’) Số Nu của mồi (n) Số băng PCR rõ ở đối chứng (X) Số băng thêm/bớt xuất hiện (Y) Số cá thể kiểm tra (Z) Tần số đột biến (F) OPN16 AAGCGACCT 9 8 1 186 1/26,7 kb OPN18 GGTGAGGTC 9 5 0 186 0/16,7 kb OPAH03 GGTTACTGCC 10 4 0 186 0/14,9 kb E2 GGAATTCCA CGTCCA 15 5 1 186 1/27,9 kb R2 TGCTGGTTTGCA GGT 15 3 1 186 1/16,7 kb Ở các loài khác sử dụng các phương pháp đột biến khác cho ra các tần số đột biến khác nhau. Theo nghiên cứu của Chen và cộng tác viên (2012), sử dụng phân tích các đoạn mồi RAPD và ISJ phát hiện tần số đột biến trong lúa mì là 1/34 kb, Uauy và cộng tác viên (2009) - là 1/49,4 kb và Parry và cộng tác viên (2009) - là 1/49 kb. Những mật độ đột biến cao hơn trong lúa mì sử dụng cùng nồng độ EMS như Slade và cộng tác viên (2005) là 1/24 kb và Dong và cộng tác viên (2009) - là 1/30 kb. Có nhiều các yếu tố có thể ảnh hưởng đến tần số đột biến, chẳng hạn như nồng độ đột biến, thời gian tiếp xúc, tác động môi trường và kiểu gen của loài mục tiêu (Song và Henry, 1995). IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Tầm soát và xây dựng bộ chỉ thị bao gồm 50 chỉ thị RAPD và 2 chỉ thị ISJ. Chọn được mười mồi chạy ổn định và băng rõ nét trên giống ngô nội ML10 là OPN4, OPN11, OPN16, OPN18, OPAA03, OPAB01, OPBA01, OPAH03, E2 và R2. Kết quả chạy 3 chỉ thị phân tử RAPD (OPN16, OPN18 và OPAH03) và 2 chỉ thị ISJ (E2, R2) trên 186 cá thể của quần thể đột biến cho thấy tần số đột biến trung bình là 1/34,3 kb. 4.2. Đề nghị Ứng dụng bộ chỉ thị RAPD để sàng lọc nền di truyền cho chọn giống, để kiểm tra đa hình quần thể. 50 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Để bổ sung làm rõ cho kết quả này, chúng tôi sẽ tiến hành giải mã trình tự cả hệ gene của một số cá thể đột biến để xác định cụ thể có bao nhiêu đột biến trong một cá thể. TÀI LIỆU THAM KHẢO Candela H, Hake S., 2008. The art and design of genetic screens: maize. Nature reviews Genetics, 9: 192-203. Chen L, Huang L, Min D, Phillips A, Wang S, Madgwick PJ,  Parry MA,  Hu YG., 2012. Development and Characterization of a New TILLING Population of Common Bread Wheat (Triticum aestivum L.). PLoS ONE, 7 (7): e41570.doi:10.1371/journal.pone. 0041570. Dong C, Dalton-Morgan J, Vincent K, Sharp P, 2009. A Modified TILLING Method for Wheat Breeding. Plant Gen., 2: 39-47. Doyle JJ, Doyle JL, 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13-15. Lu, X., Liu, J., Ren, W., Yang, Q., Chai, Z., Chen, R., Wang, L., Zhao, J., Lang, Z., Wang, H., Fan, Y., Zhao, J. and Zhang, C., 2018. Gene-Indexed Mutations in Maize.  Molecular Plant, 11(3), pp. 496-504. Neuffer M.G., 1994. Mutagenesis. In: Freeling M., Walbot V. (eds) The Maize Handbook. Springer Lab Manuals. Springer, New York, NY, pp 212-219. Parry MA,  Madgwick PJ,  Bayon C,  Tearall K,  Hernandez-Lopez A,  Baudo M,  Rakszegi M, Hamada W, Al-Yassin A, Ouabbou H, Labhilili M, Phillips AL, 2009. Mutation discovery for crop improvement. Journal of Experimental Botany, 60: 2817-2825. Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeffler D, Steine MN, Facciotti D, 2005. A reverse genetic, nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING. Nat Biotechnol, 23: 75-81. Song W, Henry RJ, 1995. Molecular analysis of the DNA polymorphism of wild barley (Hordeum spontaneum) germplasm using the polymerase chain reaction. Genetic Resources and Crop Evolution, 42: 273-281. Uauy C, Paraiso F, Colasuonno P, Tran RK, Tsai H, B Steve, C Luca, D Jorge., 2009. A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat. BMC plant Biology, 9: 115. Weining S and Langridge P., 1991. Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theoretical and Applied Genetics, 82 (2): 209-216. Zeng X, Wang Y, Li W, Wang C, Liu X. and Ji W., 2010. Comparison of the genetic diversity between Triticum aestivum ssp. tibetanum Shao and Tibetan wheat landraces (Triticum aestivum L.) by using intron-splice junction primers.  Genetic Resources and Crop Evolution, 57 (8): 1141-1150. Development of RAPD and ISJ markers for analyzing mutation rate in a Vietnamese maize EMS-induced mutant population Tran Thi Thuy, Dau Thi Ngoc Nga, Nguyen Thi Loan, Bui Hong Ngoc, Tran Hong Quan, Tran Thi Ngoc Diep, Tran Dang Khanh, Khuat Huu Trung, Vi Lang Son Abstract EMS-induced pollen mutagenesis have been used to create a mutant population in a Vietnamese inbred ML10. RAPD and ISJ molecular markers were used to evaluate the mutation frequency of Vietnamese maize EMS-induced mutant population. Fifty RAPD and two ISJ markers were used to screen ML10 for robust markers that amplified consistently more than 3 bands across tested samples. Ten such markers were identified and were used to screen a subset population of 186 random individuals M1 plants. The average mutation frequency was estimated to be 1/34.3 kb. These results are the first step to show that the mutagenesis was effective allowing other methods such as phenotyping and genome sequencing for further evaluation of EMS population in the ML10. Keywords: RAPD, ISJ, Mutation frequency, maize mutagenesis, EMS Ngày nhận bài: 15/12/2019 Ngày phản biện: 9/01/2020 Người phản biện: TS. Vũ Thị Thu Hiền Ngày duyệt đăng: 13/01/2020