KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thiết lập thành công quy trình xây dựng bộ mẫu HT có nồng độ vi-rút DEN chuẩn cho chẩn
đoán vi-rút học bệnh SD/SXHD bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và RT-PCR. Kết quả thu
được như sau:
Xác định nồng độ vi-rút DEN từ mẫu HT nghiên cứu ban đầu với độ tin cậy cao và ổn định trong điều kiện bảo
quản -700C.
Bộ mẫu HT có nồng độ vi-rút chuẩn được xây dựng cho từng týp vi-rút DEN riêng rẽ với thang nồng độ từ 101
đến 105 TCID50/mL.
Bộ mẫu HT có nồng độ vi-rút chuẩn đã xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi tế bào
muỗi C6/36 và định danh vi-rút bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián tiếp (IFA) cũng như kỹ
thuật RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti.
Bộ mẫu HT có nồng độ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình
chuẩn hoá phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh
SD/SXHD.
5 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 08/02/2022 | Lượt xem: 46 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng bộ mẫu huyết thanh có nồng độ vi-rút chuẩn cho chẩn đoán vi-rút học bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 274
XÂY DỰNG BỘ MẪU HUYẾT THANH CÓ NỒNG ĐỘ VI-RÚT CHUẨN CHO CHẨN ĐOÁN
VI-RÚT HỌC BỆNH SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE
Phan Thị Kim Liên*, Cao Minh Thắng*, Huỳnh Thị Kim Loan*, Hoàng Thị Như Đào*,
Huỳnh Phương Thảo*, Nguyễn Thị Công Dung*, Đoàn Thị Minh Tâm*, Vũ Thị Quế Hương*
TÓM TẮT
Đặt vấn ñề: Bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) là bệnh cấp tính ở người do vi-rút Dengue (DEN) gây ra và
lan truyền qua muỗi Aedes aegypti. Trong Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống SXHD, giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD
chủ yếu ñược tiến hành ở các viện khu vực. Việc chuẩn hóa kết quả xét nghiệm và kiểm tra chất lượng nội bộ dựa trên bộ mẫu huyết
thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñang ñược quan tâm giữa các viện.
Mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập quy trình xây dựng và ñánh giá bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-
rút học bệnh SD/SXHD.
Phương pháp nghiên cứu: Huyết thanh (HT) cấp tính của bệnh nhân SD/SXHD xác ñịnh bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào
muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 và RT-PCR ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút ñể thiết lập bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho
phân lập vi-rút và RT-PCR.
Kết quả nghiên cứu: Các mẫu HT nghiên cứu có hiệu giá vi-rút DEN-1, -2, -3 là 105,77, 105,68, 105,77TCID50/mL tương ứng với
CV < 1 % và ± 1 SD. Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD ñược thiết lập cho từng týp vi-
rút DEN riêng biệt với bộ thang nồng ñộ từ 101 ñến 105 TCID50/mL. Bộ mẫu HT chuẩn cho phép phân lập vi-rút DEN trên nuôi cấy
tế bào C6/36 sau 7 ngày ở nồng ñộ 103-104 TCID50/mL và sau 14 ngày ở nồng ñộ 101– 103 TCID50/mL theo phương pháp cấy, mật ñộ
tế bào ban ñầu và týp vi-rút DEN tương ứng. Ngoài ra, bộ mẫu HT chuẩn còn ñược phát hiện bằng RT-PCR DEN ở nồng ñộ 102
TCID50/mL.
Kết luận: Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình
chuẩn hóa phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD.
Từ khóa: Mẫu huyết thanh virus chuẩn, chẩn ñoán vi rút Dengue, vi rút Dengue, bệnh sốt xuất huyết Dengue.
ABSTRACT
SET-UP OF STANDARD SERUM PANELS WITH VIRUS TITRATIONS FOR VIROLOGICAL
DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER/DENGUE HEMORRHAGIC FEVER.
Phan Thi Kim Lien, Cao Minh Thang, Huynh Thi Kim Loan, Hoang Thi Nhu Da,
Huynh Phuong Thao, Nguyen Thi Cong Dung, Doan Thi Minh Tam, Vu Thi Que Huong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 274 - 279
Background: Dengue fever/Dengue hemorrhagic fever (DF/DHF) is acute human diseases caused by dengue (DEN) viruses
transmitting by Aedes aegypti. In National Program for Dengue control, virological surveillance of DF/DHF is mainly performed in
regional institutes. The standardization of test results and internal quality control based on standard serum panels with virus
titrations is considering between institutions.
Objectives: To establish the procedures for set-up and assessment of standard serum panels with virus titrations using in
virological diagnosis of DF/DHF.
Method: Acute sera of DF/DHF patients confirmed by virus isolation in C6/36 clone Aedes albopictus mosquito cell culture
and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were titrated to establish the standard serum panels with virus
titrations for virus isolation and RT-PCR methods.
Result: Study acute sera infected DEN-1, -2, -3 virus serotypes having the virus titers of 105,77, 105,68, 105,77TCID50/mL,
respectively with Coefficient of Variation (CV) < 1 %, and ± 1 SD (Standard Deviation). The standard serum panels with virus
titrations using in DF/DHF virological diagnosis were establish for each DEN virus serotype and virus titrations from 101 to 105
TCID50/mL. The standard serum panels can be detected at 103-104 TCID50/mL after 7 infectious days and at 101–103 TCID50/mL after
14 infectious days by virus isolation technique using different inoculated methods, primary mosquito cell culture concentrations and
DEN virus serotypes, respectively. Moreover, this standard serum panels can also be detected at 102 TCID50/mL by DEN
RT-PCR.
Conclusion: Standard serum panels with virus titrations have an important part in internal quality control and laboratory
standardization process in regional institutions as well as improving the effective virological surveillance of DF/DHF.
*
Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh
Địa chỉ liên lạc:TS. Vũ Thị Quế Hương ĐT: 0903 618 809 Email: quehuong@pasteur-hcm.org.vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 275
Keywords: Standard serum panels virus, diagnosis Dengue virus, Dengue virus, Dengue hemorrhagic fever disease.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi-rút Dengue (DEN) là vi-rút ARN thuộc nhóm
Flavivirus họ Flaviviridae, có 4 týp vi-rút khác nhau về mặt
kháng nguyên (gọi là DEN-1, -2, -3, -4). Vi-rút DEN gây bệnh
cấp tính cho người lan truyền qua trung gian muỗi Aedes
aegypti. Theo tổ chức Y tế thế giới, hằng năm có khoảng 100
triệu ca nhiễm vi-rút DEN trong ñó 90% là trẻ em và 50.000 ca
tử vong trên toàn thế giới. Bệnh nhiễm vi-rút DEN có phổ lâm
sàng rất rộng từ không triệu chứng ñến sốt DEN (SD), sốt xuất
huyết DEN (SXHD), hội chứng sốc DEN (HCSD) và tử vong.
Do ñó, việc chẩn ñoán xác ñịnh bệnh DEN chủ yếu dựa vào
chẩn ñoán phòng thí nghiệm bao gồm vi-rút học (phân lập vi-
rút trên nuôi cấy tế bào), huyết thanh học (phản ứng MAC-
ELISA) và sinh học phân tử (RT-PCR).
Trong Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống
SXHD (CTMTQG PCSXHD), công tác giám sát vi-rút học
bệnh SD/SXHD chủ yếu ñược tiến hành ở các viện khu vực
bằng kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế bào muỗi
Aedes aegypti dòng C6/36 và ñịnh danh týp vi-rút DEN
bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với các kháng
thể ñơn dòng ñặc hiệu. Đôi khi, kỹ thuật RT-PCR cũng
ñược áp dụng trong những trường hợp khẩn cấp nhằm xác
ñịnh dịch bệnh DEN hoặc xác ñịnh căn nguyên trường hợp
tử vong. Hiện nay, việc chuẩn hoá phòng xét nghiệm theo
tiêu chuẩn iso-15189 ñang tiến hành ở các viện khu vực. Do
ñó, việc xây dựng bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút
DEN chuẩn nhằm kiểm tra chất lượng nội bộ các xét
nghiệm chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD ñang ñược
quan tâm ở các viện khu vực.
Mục tiêu nghiên cứu
Thiết lập quy trình xây dựng và ñánh giá bộ mẫu huyết
thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học
(bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi Aedes aegypti
và RT-PCR) bệnh SD/SXHD.
VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Mẫu HT cấp tính của bệnh nhân (BN) nhiễm vi-rút DEN
(DEN-1, -2, -3) nhập bệnh viện 115-TP. HCM năm 2007 ñược
xác ñịnh bằng hai phương pháp phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế
bào muỗi C6/36 rồi ñịnh danh bằng miễn dịch huỳnh quang
gián tiếp với kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu týp huyết thanh vi-
rút DEN (do Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Colorado, Hoa kỳ
cung cấp) và RT-PCR với mồi ñặc hiệu týp vi-rút DEN của
Lanciotti(4).
Phương pháp nghiên cứu
Nồng ñộ vi-rút DEN (TCID50/ml) hiện diện trong mẫu HT
nghiên cứu ñược xác ñịnh bằng phương pháp chuẩn ñộ vi-rút
trên nuôi cấy tế bào muỗi C6/36 và ño lường mật ñộ quang
(OD) phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể (3,5). Bộ
mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược thiết lập riêng rẽ cho
từng týp vi-rút DEN với thang nồng ñộ từ 101-105 (TCID50/ml).
Bộ mẫu HT chuẩn này sử dụng ñể khảo sát giới hạn phát
hiện vi-rút DEN của phương pháp phân lập vi-rút trên nuôi cấy
tế bào muỗi Aedes aegypti dòng C6/36 và ñịnh danh bằng miễn
dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp trên các thông số kỹ
thuật: mật ñộ tế bào nuôi cấy ban ñầu, kỹ thuật gây nhiễm bệnh
phẩm vào tế bào, ngày gặt bệnh phẩm(3,8).
Đồng thời, bộ mẫu HT chuẩn này cũng ñược khảo sát giới
hạn phát hiện vi-rút DEN của phương pháp RT-PCR với bộ
mồi của Lanciotti sau khi chiết xuất ARN vi-rút DEN bằng bộ
sinh phẩm QIAGEN(2,4,8). Vẽ ñồ thị và xử lý số liệu bằng phần
mềm Microsoft Excel(Error! Reference source not found.).
KẾT QUẢ & BÀN LUẬN
Về chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút trong HT nghiên cứu
Hiệu giá vi-rút DEN của mẫu HT nghiên cứu
Các mẫu HT cấp tính của BN nhiễm vi-rút DEN-1, -2, -3
ñược pha loãng bậc 10 ra 9 ñộ pha loãng khác nhau. Mỗi ñộ
pha loãng vi-rút ñược gây nhiễm trên 6 giếng tế bào muỗi
C6/36. Sau 7 ngày, tính hiệu giá ñơn vị TCID50/mL bằng
phương pháp miễn dịch enzyme trên khay nhựa 96 giếng.
Giếng nào có giá trị OD > OD trung bình chứng âm + 3 ñộ
lệch chuẩn (SD) là dương tính và tính hiệu giá vi-rút theo công
thức Reed và Muench(6). Mỗi HT nhiễm từng týp vi-rút DEN
ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút DEN 3 lần, cho kết quả trong
bảng 1.
Bảng 1: Hiệu giá vi-rút của các HT nhiễm vi-rút DEN-1, -2, -3
theo log10 TCID50/mL
Hiệu giá vi-rút (log10
TCID50/mL)
Mẫu
HT
nhiễm
vi-rút Lần 1 Lần 2 Lần 3
Trun
g vị
hiệu
giá
Trung
bình
hiệu
giá
SD (ñộ
lệch
chuẩn)
CV
(Hệ số
phân
tán)
(%)
DEN-1 5,70 5,80 5,80 5,80 5,77 0,0579 1
DEN-2 5,70 5,70 5,63 5,70 5,68 0,0406 0,72
DEN-3 5,80 5,70 5,80 5,80 5,77 0,0579 1
Hiệu giá vi-rút của các mẫu HT nhiễm týp vi-rút DEN
khác nhau có hệ số phân tán (CV) dao ñộng từ 0,72 (HT nhiễm
vi-rút DEN-2) ñến 1 (HT nhiễm vi-rút DEN-1 và DEN-3), nhỏ
hơn 30%. Mặt khác, theo ñồ thị Shewhat và Levey-Jening và
quy tắc Westgard, hiệu giá vi-rút DEN trong các mẫu HT
nghiên cứu ñược xác ñịnh là ñáng tin cậy vì sự dao ñộng của
hiệu giá vi-rút sau 3 lần xét nghiệm ñều nằm trong khoảng ±
1SD (Biểu ñồ 1) với hiệu giá vi-rút DEN-1, -3 là (5,7-5,8) và
DEN-2 là (5,63-5,7), không xảy ra trường hợp shift hay
trend(5).
Tính ổn ñịnh của hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên
cứu (sau 3 tháng bảo quản ở -700C)
Các mẫu HT nghiên cứu ñược bảo quản ở -700C trong 3
tháng rồi chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút lặp lại 3 lần cho kết quả ở
bảng 2.
Bảng 2: Hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu trước
(T0) và sau 3 tháng (T3) bảo quản ở -700C theo ñơn vị log10
TCID50/mL.
Hiệu giá vi-rút T0 Hiệu giá vi-rút T3
Mẫu
HT
nhiễm
vi-rút Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Trung
bình
hiệu giá
T0
Trung
bình
hiệu giá
T3
DEN-1 5,70 5,80 5,80 5,70 5,73 5,73 5,77 5,72
DEN-2 5,70 5,70 5,63 5,70 5,63 5,63 5,68 5,65
DEN-3 5,80 5,70 5,70 5,70 5,73 5,70 5,77 5,71
Mẫu HT nhiễm vi-rút DEN-1 và DEN-3 giảm hiệu giá
0,05 log10 TCID50/mL, còn mẫu HT nhiễm vi-rút DEN-2 giảm
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 276
hiệu giá 0,03 log10 TCID50/mL. CV của 3 lần chuẩn ñộ hiệu giá
vi-rút các mẫu HT nghiên cứu ñều nhỏ hơn 30%. Hiệu giá vi-
rút giảm không ñáng kể sau 3 tháng bảo quản ở -700C (< 0,2
log10 TCID50 /mL). Phân tích T-test cho thấy mẫu HT DEN-1:
T =1,34 < t 0,05 = 2,91, HT DEN-2: T = 0,707 < t 0,05 = 2,13 và
HT DEN-3: T = 1,63 < t 0,05 = 2,9 và F-test cho thấy HT DEN-
1,-3: F= 11,11< F 0,05= 19 còn HT DEN-2: F= 1< F 0,05=
19(Error! Reference source not found.). Kết quả phân tích thống kê cho
thấy hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu trước và
sau khi bảo quản 3 tháng không khác biệt. Như vậy, quy trình
bảo quản HT nhiễm vi-rút DEN ở -700C ñảm bảo không làm
giảm hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu cũng như
trong bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn sau này.
Biểu ñồ 1: Độ lặp lại hiệu giá vi-rút DEN theo ñơn vị log10 TCID50/mL (Trái: hiệu giá vi-rút DEN-1, -3; Phải: hiệu giá vi-rút DEN-
2)
Về quy trình thiết lập bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-
rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học (phân lập vi-rút trên
nuôi tế bào C6/36 và RT-PCR)
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược thiết lập cho
chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD phải riêng biệt cho từng
týp vi-rút DEN và chia theo thang nồng ñộ từ 101 ñến 105
TCID50/mL. Từ mẫu HT nghiên cứu nhiễm từng týp vi-rút
DEN ñã ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút, bộ mẫu HT có nồng ñộ
vi-rút chuẩn từ 101 ñến 105 TCID50/mL ñược chuẩn bị cho từng
týp vi-rút DEN bằng cách pha loãng HT nghiên cứu trong môi
trường DMEM 2% huyết thanh bào thai bê (FCS) (ñối với
phân lập vi-rút trên nuôi tế bào C6/36) hoặc nước cất vô trùng
(ñối với RT-PCR). Sau ñó, chia nhỏ và bảo quản ở -700C.
Về ñánh giá thông số kỹ thuật của bộ HT có nồng ñộ vi-rút
chuẩn
Đối với phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và ñịnh
danh bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián
tiếp (IFA)
Bộ HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn của từng týp vi-rút DEN
ñược xác ñịnh giới hạn phát hiện dương tính của DFA và IFA
theo: 1- mật ñộ tế bào ban ñầu (2.104 tế bào/mL và 2.105 tế
bào/mL), 2- kỹ thuật gây nhiễm HT vào tế bào (cấy hấp phụ và
cấy bề mặt) và 3- thời gian gặt tế bào gây nhiễm (sau 7 ngày
hoặc sau 14 ngày). Kết quả ñược trình bày trong bảng 3.
6.66
6.37
185
+2SD
+1SD
TB
-1SD
-2SD
-3SD
+3SD 6.67
5.17
4.8
185
5.47
5.77
185
Lần 1 Lần 2 Lần 3
(Trái)
5.68
6.29
6.08
185
5.88
5.48
5.07
5.28 -2SD
-3SD
Lần 1 Lần 2 Lần 3
(Phải)
+3SD
+2SD
+1SD
-1SD
TB
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 277
Bảng 3: Giới hạn phát hiện dương tính của DFA và IFA theo typ vi-rút, kỹ thuật gây nhiễm tế bào, mật ñộ tế bào ban
ñầu và thời gian gặt tế bào nhiễm
HT nhiễm vi-rút Kỹ thuật gây nhiễm Mật ñộ tế bào (TB/mL)
Thời gian gặt
(ngày) DFA (TCID50/mL) IFA (TCID50/mL)
Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105
Cấy bề mặt 2.105
7 104 103
2.105 101 101 Cấy hấp phụ
2.104 102 102
DEN-1
Cấy bề mặt 2.105
14
103 103
Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105
Cấy bề mặt 2.105
7 103 103
2.105 101 101 Cấy hấp phụ
2.104 102 102
DEN-2
Cấy bề mặt 2.105
14
102 102
Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105
Cấy bề mặt 2.105
7 104 103
2.105 101 101 Cấy hấp phụ
2.104 102 102
DEN-3
Cấy bề mặt 2.105
14
103 103
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn của cả 3 týp DEN sau 7 ngày gặt cho ngưỡng phát hiện là 104 TCID50/mL
(với DFA) và 103 TCID50/mL (với IFA), còn sau 14 ngày gặt thì ngưỡng phát hiện là 101 - 103 TCID50/mL (với DFA
và IFA). Như vậy, không có sự khác biệt giữa các thông số kỹ thuật khảo sát sau 7 ngày gặt nhưng sự khác biệt thể
hiện rõ khi gặt tế bào gây nhiễm sau 14 ngày. So sánh kết quả phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 ở hai thời
ñiểm gặt tế bào gây nhiễm (7 và 14 ngày) cho thấy tỷ lệ dương tính của DFA và IFA cao nhất khi cấy hấp phụ ở mật ñộ
2.105 tế bào/mL và gặt sau 14 ngày, ñồng thời tỷ lệ % tế bào nhiễm quan sát cũng cao hơn các thông số khác.
Đối với RT-PCR DEN sử dụng bộ mồi Lanciotti
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược chiết xuất ARN bằng bộ sinh phẩm Qiagen và khuếch ñại ñoạn gen ñặc
hiệu cho týp vi-rút DEN bằng RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti. Kết quả trình bày trong hình 1.
Hình 1: Kết quả ñịnh týp vi-rút DEN và giới hạn phát hiện của RT-PCR với mồi Lanciotti trên bộ mẫu HT có nồng ñộ
vi-rút chuẩn
Trong quy trình RT-PCR và PCR bán tổ, yếu tố quyết ñịnh ñộ ñặc hiệu và ñộ nhạy là mồi. Mồi của
Lanciotti thiết kế nằm trong vùng gien cấu trúc C và PrM cho thấy ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu cao nhất, vì thế
phù hợp cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD từ HT bệnh nhân(4,8). ARN vi-rút DEN ñược chiết xuất
bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA mini kit của Qiagen. Đây là bộ sinh phẩm thương mại có quy trình
ñơn giản, nhanh, tinh chế ARN triệt ñể giúp tăng ñộ nhạy của RT-PCR(8). Khi xét nghiệm trên bộ mẫu HT
có nồng ñộ vi-rút chuẩn, RT-PCR DEN cho kết quả dương tính ở nồng ñộ vi-rút 102 TCID50/mL (ñối với
týp vi-rút DEN-2, -3), phù hợp với kết quả của Vũ Thị Quế Hương(8). Riêng bộ HT có nồng ñộ vi-rút DEN-
1 chuẩn thì RT-PCR chỉ dương tính từ nồng ñộ 104 TCID50/mL trở ñi. Độ nhạy của RT-PCR ñối với týp vi-
rút DEN-1 bị giảm so với 2 týp vi-rút DEN khác, có thể lý giải là do: 1-sai số khi pha loãng HT, 2- mồi
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học
Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 278
giảm ñộ nhạy do ñiều kiện bảo quản, 3- mồi giảm ñộ nhạy do chủng vi-rút DEN-1 ñã bị ñột biến ở vùng
thiết kế mồi.
Phân tích hồi quy tương quan tuyến tính giữa nồng ñộ vi-rút và hàm lượng ARN cho thấy nồng ñộ vi-rút
tương quan tuyến tính với hàm lượng ARN tinh chế, thể hiện qua các phương trình hồi quy là: DEN-1 Y1 =
2,03X + 0,48; DEN-2 Y2 = 2,88X + 0,48; DEN-3 Y3 = 2,03X + 0,48(Error! Reference source not found.). Hơn nữa,
giá trị OD A260nm của ARN 3 týp vi-rút DEN ở nồng ñộ 102 TCID50/mL ñều là 0,48-0,49 µg/µL, như vậy
không thể do sai số pha loãng HT. Đồng thời, ñiều kiện bảo quản các mồi của Lanciotti là như nhau. Do ñó,
kết quả ñộ nhạy RT-PCR giảm ñối với bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút DEN-1 là do chủng vi-rút DEN-1
phân lập trong giai ñoạn này ñã bị ñột biến ở vùng thiết kế mồi, gây cản trở cho sự bắt cặp, phù hợp với kết
quả của Jean-Marc Reynes(7). Chúng tôi sẽ tiến hành giải trình tự vùng thiết kế mồi của týp vi-rút DEN-1
trên chủng vi-rút DEN-1 nghiên cứu ñể khẳng ñịnh kết quả này.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu ñã thiết lập thành công quy trình xây dựng bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút DEN chuẩn cho chẩn
ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và RT-PCR. Kết quả thu
ñược như sau:
Xác ñịnh nồng ñộ vi-rút DEN từ mẫu HT nghiên cứu ban ñầu với ñộ tin cậy cao và ổn ñịnh trong ñiều kiện bảo
quản -700C.
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược xây dựng cho từng týp vi-rút DEN riêng rẽ với thang nồng ñộ từ 101
ñến 105 TCID50/mL.
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñã xác ñịnh giới hạn phát hiện của kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi tế bào
muỗi C6/36 và ñịnh danh vi-rút bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián tiếp (IFA) cũng như kỹ
thuật RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti.
Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình
chuẩn hoá phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh
SD/SXHD.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đặng Văn Giáp (1997). Phân tích dữ liệu khoa học bằng phần mềm Microsoft Excel. Nhà xuất bản giáo dục. Tr:
41-42.
2. Figueiredo L.T., Batista W.C., Igarashi A. (1997). Detection and identification of dengue virus isolates from
Brazil by a simplified reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Revista do Instituto de
Medicina Tropical de Sao Paulo, 39(2): 79-83.
3. Figueiredo L.T.M., Shope R.E. (1987). An enzyme immunoassay for dengue antibody using infected cultured
cells as antigen. J. Virol. Methods, 17: 191-198.
4. Lanciotti R.S, C.H. Calisher, D.J. Gubler, G. Chang, V. Vordam (1992). Rapid detection and typing of dengue
viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 30: 545-
551.
5. NSH (2008). Quality assurance in the diagnostic virobiology and serology laboratory. Standard Unit, Evaluations
and standards laboratory center for infections.
6. Reed L.J. and H. Muench (1938). A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints. Am J Epidemiol, 27:
493-497.
7. Reynes Jean-Marc, Sivuth Ong, Channa Mey, Chantha Ngan, Stefan Hoyer, Amadou A. Sall (2003). Improved
Molecular Detection of Dengue Virus Serotype 1 Variants. J. Clin. Microbiol., 41(8): 3864-3867.
8. Vũ Thị Quế Hương (2001). Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn ñoán sốt xuất huyết và nghiên cứu dịch tể
học phân tử vi-rút dengue. Luận án tiến sĩ y học, chuyên ngành dịch tể học.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
xay_dung_bo_mau_huyet_thanh_co_nong_do_vi_rut_chuan_cho_chan.pdf