Xây dựng bộ mẫu huyết thanh có nồng độ vi-rút chuẩn cho chẩn đoán vi-rút học bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 274 XÂY DỰNG BỘ MẪU HUYẾT THANH CÓ NỒNG ĐỘ VI-RÚT CHUẨN CHO CHẨN ĐOÁN VI-RÚT HỌC BỆNH SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE Phan Thị Kim Liên*, Cao Minh Thắng*, Huỳnh Thị Kim Loan*, Hoàng Thị Như Đào*, Huỳnh Phương Thảo*, Nguyễn Thị Công Dung*, Đoàn Thị Minh Tâm*, Vũ Thị Quế Hương* TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD) là bệnh cấp tính ở người do vi-rút Dengue (DEN) gây ra và lan truyền qua muỗi Aedes aegypti. Trong Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống SXHD, giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD chủ yếu ñược tiến hành ở các viện khu vực. Việc chuẩn hóa kết quả xét nghiệm và kiểm tra chất lượng nội bộ dựa trên bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñang ñược quan tâm giữa các viện. Mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập quy trình xây dựng và ñánh giá bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi- rút học bệnh SD/SXHD. Phương pháp nghiên cứu: Huyết thanh (HT) cấp tính của bệnh nhân SD/SXHD xác ñịnh bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 và RT-PCR ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút ñể thiết lập bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho phân lập vi-rút và RT-PCR. Kết quả nghiên cứu: Các mẫu HT nghiên cứu có hiệu giá vi-rút DEN-1, -2, -3 là 105,77, 105,68, 105,77TCID50/mL tương ứng với CV < 1 % và ± 1 SD. Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD ñược thiết lập cho từng týp vi- rút DEN riêng biệt với bộ thang nồng ñộ từ 101 ñến 105 TCID50/mL. Bộ mẫu HT chuẩn cho phép phân lập vi-rút DEN trên nuôi cấy tế bào C6/36 sau 7 ngày ở nồng ñộ 103-104 TCID50/mL và sau 14 ngày ở nồng ñộ 101– 103 TCID50/mL theo phương pháp cấy, mật ñộ tế bào ban ñầu và týp vi-rút DEN tương ứng. Ngoài ra, bộ mẫu HT chuẩn còn ñược phát hiện bằng RT-PCR DEN ở nồng ñộ 102 TCID50/mL. Kết luận: Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình chuẩn hóa phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD. Từ khóa: Mẫu huyết thanh virus chuẩn, chẩn ñoán vi rút Dengue, vi rút Dengue, bệnh sốt xuất huyết Dengue. ABSTRACT SET-UP OF STANDARD SERUM PANELS WITH VIRUS TITRATIONS FOR VIROLOGICAL DIAGNOSIS OF DENGUE FEVER/DENGUE HEMORRHAGIC FEVER. Phan Thi Kim Lien, Cao Minh Thang, Huynh Thi Kim Loan, Hoang Thi Nhu Da, Huynh Phuong Thao, Nguyen Thi Cong Dung, Doan Thi Minh Tam, Vu Thi Que Huong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 274 - 279 Background: Dengue fever/Dengue hemorrhagic fever (DF/DHF) is acute human diseases caused by dengue (DEN) viruses transmitting by Aedes aegypti. In National Program for Dengue control, virological surveillance of DF/DHF is mainly performed in regional institutes. The standardization of test results and internal quality control based on standard serum panels with virus titrations is considering between institutions. Objectives: To establish the procedures for set-up and assessment of standard serum panels with virus titrations using in virological diagnosis of DF/DHF. Method: Acute sera of DF/DHF patients confirmed by virus isolation in C6/36 clone Aedes albopictus mosquito cell culture and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were titrated to establish the standard serum panels with virus titrations for virus isolation and RT-PCR methods. Result: Study acute sera infected DEN-1, -2, -3 virus serotypes having the virus titers of 105,77, 105,68, 105,77TCID50/mL, respectively with Coefficient of Variation (CV) < 1 %, and ± 1 SD (Standard Deviation). The standard serum panels with virus titrations using in DF/DHF virological diagnosis were establish for each DEN virus serotype and virus titrations from 101 to 105 TCID50/mL. The standard serum panels can be detected at 103-104 TCID50/mL after 7 infectious days and at 101–103 TCID50/mL after 14 infectious days by virus isolation technique using different inoculated methods, primary mosquito cell culture concentrations and DEN virus serotypes, respectively. Moreover, this standard serum panels can also be detected at 102 TCID50/mL by DEN RT-PCR. Conclusion: Standard serum panels with virus titrations have an important part in internal quality control and laboratory standardization process in regional institutions as well as improving the effective virological surveillance of DF/DHF. * Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh Địa chỉ liên lạc:TS. Vũ Thị Quế Hương ĐT: 0903 618 809 Email: quehuong@pasteur-hcm.org.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 275 Keywords: Standard serum panels virus, diagnosis Dengue virus, Dengue virus, Dengue hemorrhagic fever disease. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi-rút Dengue (DEN) là vi-rút ARN thuộc nhóm Flavivirus họ Flaviviridae, có 4 týp vi-rút khác nhau về mặt kháng nguyên (gọi là DEN-1, -2, -3, -4). Vi-rút DEN gây bệnh cấp tính cho người lan truyền qua trung gian muỗi Aedes aegypti. Theo tổ chức Y tế thế giới, hằng năm có khoảng 100 triệu ca nhiễm vi-rút DEN trong ñó 90% là trẻ em và 50.000 ca tử vong trên toàn thế giới. Bệnh nhiễm vi-rút DEN có phổ lâm sàng rất rộng từ không triệu chứng ñến sốt DEN (SD), sốt xuất huyết DEN (SXHD), hội chứng sốc DEN (HCSD) và tử vong. Do ñó, việc chẩn ñoán xác ñịnh bệnh DEN chủ yếu dựa vào chẩn ñoán phòng thí nghiệm bao gồm vi-rút học (phân lập vi- rút trên nuôi cấy tế bào), huyết thanh học (phản ứng MAC- ELISA) và sinh học phân tử (RT-PCR). Trong Chương trình Mục tiêu Quốc gia Phòng chống SXHD (CTMTQG PCSXHD), công tác giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD chủ yếu ñược tiến hành ở các viện khu vực bằng kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế bào muỗi Aedes aegypti dòng C6/36 và ñịnh danh týp vi-rút DEN bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với các kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu. Đôi khi, kỹ thuật RT-PCR cũng ñược áp dụng trong những trường hợp khẩn cấp nhằm xác ñịnh dịch bệnh DEN hoặc xác ñịnh căn nguyên trường hợp tử vong. Hiện nay, việc chuẩn hoá phòng xét nghiệm theo tiêu chuẩn iso-15189 ñang tiến hành ở các viện khu vực. Do ñó, việc xây dựng bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút DEN chuẩn nhằm kiểm tra chất lượng nội bộ các xét nghiệm chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD ñang ñược quan tâm ở các viện khu vực. Mục tiêu nghiên cứu Thiết lập quy trình xây dựng và ñánh giá bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi-rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học (bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi Aedes aegypti và RT-PCR) bệnh SD/SXHD. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Mẫu HT cấp tính của bệnh nhân (BN) nhiễm vi-rút DEN (DEN-1, -2, -3) nhập bệnh viện 115-TP. HCM năm 2007 ñược xác ñịnh bằng hai phương pháp phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế bào muỗi C6/36 rồi ñịnh danh bằng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu týp huyết thanh vi- rút DEN (do Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Colorado, Hoa kỳ cung cấp) và RT-PCR với mồi ñặc hiệu týp vi-rút DEN của Lanciotti(4). Phương pháp nghiên cứu Nồng ñộ vi-rút DEN (TCID50/ml) hiện diện trong mẫu HT nghiên cứu ñược xác ñịnh bằng phương pháp chuẩn ñộ vi-rút trên nuôi cấy tế bào muỗi C6/36 và ño lường mật ñộ quang (OD) phức hợp miễn dịch kháng nguyên-kháng thể (3,5). Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược thiết lập riêng rẽ cho từng týp vi-rút DEN với thang nồng ñộ từ 101-105 (TCID50/ml). Bộ mẫu HT chuẩn này sử dụng ñể khảo sát giới hạn phát hiện vi-rút DEN của phương pháp phân lập vi-rút trên nuôi cấy tế bào muỗi Aedes aegypti dòng C6/36 và ñịnh danh bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp và gián tiếp trên các thông số kỹ thuật: mật ñộ tế bào nuôi cấy ban ñầu, kỹ thuật gây nhiễm bệnh phẩm vào tế bào, ngày gặt bệnh phẩm(3,8). Đồng thời, bộ mẫu HT chuẩn này cũng ñược khảo sát giới hạn phát hiện vi-rút DEN của phương pháp RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti sau khi chiết xuất ARN vi-rút DEN bằng bộ sinh phẩm QIAGEN(2,4,8). Vẽ ñồ thị và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel(Error! Reference source not found.). KẾT QUẢ & BÀN LUẬN Về chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút trong HT nghiên cứu Hiệu giá vi-rút DEN của mẫu HT nghiên cứu Các mẫu HT cấp tính của BN nhiễm vi-rút DEN-1, -2, -3 ñược pha loãng bậc 10 ra 9 ñộ pha loãng khác nhau. Mỗi ñộ pha loãng vi-rút ñược gây nhiễm trên 6 giếng tế bào muỗi C6/36. Sau 7 ngày, tính hiệu giá ñơn vị TCID50/mL bằng phương pháp miễn dịch enzyme trên khay nhựa 96 giếng. Giếng nào có giá trị OD > OD trung bình chứng âm + 3 ñộ lệch chuẩn (SD) là dương tính và tính hiệu giá vi-rút theo công thức Reed và Muench(6). Mỗi HT nhiễm từng týp vi-rút DEN ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút DEN 3 lần, cho kết quả trong bảng 1. Bảng 1: Hiệu giá vi-rút của các HT nhiễm vi-rút DEN-1, -2, -3 theo log10 TCID50/mL Hiệu giá vi-rút (log10 TCID50/mL) Mẫu HT nhiễm vi-rút Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trun g vị hiệu giá Trung bình hiệu giá SD (ñộ lệch chuẩn) CV (Hệ số phân tán) (%) DEN-1 5,70 5,80 5,80 5,80 5,77 0,0579 1 DEN-2 5,70 5,70 5,63 5,70 5,68 0,0406 0,72 DEN-3 5,80 5,70 5,80 5,80 5,77 0,0579 1 Hiệu giá vi-rút của các mẫu HT nhiễm týp vi-rút DEN khác nhau có hệ số phân tán (CV) dao ñộng từ 0,72 (HT nhiễm vi-rút DEN-2) ñến 1 (HT nhiễm vi-rút DEN-1 và DEN-3), nhỏ hơn 30%. Mặt khác, theo ñồ thị Shewhat và Levey-Jening và quy tắc Westgard, hiệu giá vi-rút DEN trong các mẫu HT nghiên cứu ñược xác ñịnh là ñáng tin cậy vì sự dao ñộng của hiệu giá vi-rút sau 3 lần xét nghiệm ñều nằm trong khoảng ± 1SD (Biểu ñồ 1) với hiệu giá vi-rút DEN-1, -3 là (5,7-5,8) và DEN-2 là (5,63-5,7), không xảy ra trường hợp shift hay trend(5). Tính ổn ñịnh của hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu (sau 3 tháng bảo quản ở -700C) Các mẫu HT nghiên cứu ñược bảo quản ở -700C trong 3 tháng rồi chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút lặp lại 3 lần cho kết quả ở bảng 2. Bảng 2: Hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu trước (T0) và sau 3 tháng (T3) bảo quản ở -700C theo ñơn vị log10 TCID50/mL. Hiệu giá vi-rút T0 Hiệu giá vi-rút T3 Mẫu HT nhiễm vi-rút Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình hiệu giá T0 Trung bình hiệu giá T3 DEN-1 5,70 5,80 5,80 5,70 5,73 5,73 5,77 5,72 DEN-2 5,70 5,70 5,63 5,70 5,63 5,63 5,68 5,65 DEN-3 5,80 5,70 5,70 5,70 5,73 5,70 5,77 5,71 Mẫu HT nhiễm vi-rút DEN-1 và DEN-3 giảm hiệu giá 0,05 log10 TCID50/mL, còn mẫu HT nhiễm vi-rút DEN-2 giảm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 276 hiệu giá 0,03 log10 TCID50/mL. CV của 3 lần chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút các mẫu HT nghiên cứu ñều nhỏ hơn 30%. Hiệu giá vi- rút giảm không ñáng kể sau 3 tháng bảo quản ở -700C (< 0,2 log10 TCID50 /mL). Phân tích T-test cho thấy mẫu HT DEN-1: T =1,34 < t 0,05 = 2,91, HT DEN-2: T = 0,707 < t 0,05 = 2,13 và HT DEN-3: T = 1,63 < t 0,05 = 2,9 và F-test cho thấy HT DEN- 1,-3: F= 11,11< F 0,05= 19 còn HT DEN-2: F= 1< F 0,05= 19(Error! Reference source not found.). Kết quả phân tích thống kê cho thấy hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu trước và sau khi bảo quản 3 tháng không khác biệt. Như vậy, quy trình bảo quản HT nhiễm vi-rút DEN ở -700C ñảm bảo không làm giảm hiệu giá vi-rút DEN trong mẫu HT nghiên cứu cũng như trong bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn sau này. Biểu ñồ 1: Độ lặp lại hiệu giá vi-rút DEN theo ñơn vị log10 TCID50/mL (Trái: hiệu giá vi-rút DEN-1, -3; Phải: hiệu giá vi-rút DEN- 2) Về quy trình thiết lập bộ mẫu huyết thanh có nồng ñộ vi- rút chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học (phân lập vi-rút trên nuôi tế bào C6/36 và RT-PCR) Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược thiết lập cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD phải riêng biệt cho từng týp vi-rút DEN và chia theo thang nồng ñộ từ 101 ñến 105 TCID50/mL. Từ mẫu HT nghiên cứu nhiễm từng týp vi-rút DEN ñã ñược chuẩn ñộ hiệu giá vi-rút, bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn từ 101 ñến 105 TCID50/mL ñược chuẩn bị cho từng týp vi-rút DEN bằng cách pha loãng HT nghiên cứu trong môi trường DMEM 2% huyết thanh bào thai bê (FCS) (ñối với phân lập vi-rút trên nuôi tế bào C6/36) hoặc nước cất vô trùng (ñối với RT-PCR). Sau ñó, chia nhỏ và bảo quản ở -700C. Về ñánh giá thông số kỹ thuật của bộ HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn Đối với phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và ñịnh danh bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián tiếp (IFA) Bộ HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn của từng týp vi-rút DEN ñược xác ñịnh giới hạn phát hiện dương tính của DFA và IFA theo: 1- mật ñộ tế bào ban ñầu (2.104 tế bào/mL và 2.105 tế bào/mL), 2- kỹ thuật gây nhiễm HT vào tế bào (cấy hấp phụ và cấy bề mặt) và 3- thời gian gặt tế bào gây nhiễm (sau 7 ngày hoặc sau 14 ngày). Kết quả ñược trình bày trong bảng 3. 6.66 6.37 185 +2SD +1SD TB -1SD -2SD -3SD +3SD 6.67 5.17 4.8 185 5.47 5.77 185 Lần 1 Lần 2 Lần 3 (Trái) 5.68 6.29 6.08 185 5.88 5.48 5.07 5.28 -2SD -3SD Lần 1 Lần 2 Lần 3 (Phải) +3SD +2SD +1SD -1SD TB Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 277 Bảng 3: Giới hạn phát hiện dương tính của DFA và IFA theo typ vi-rút, kỹ thuật gây nhiễm tế bào, mật ñộ tế bào ban ñầu và thời gian gặt tế bào nhiễm HT nhiễm vi-rút Kỹ thuật gây nhiễm Mật ñộ tế bào (TB/mL) Thời gian gặt (ngày) DFA (TCID50/mL) IFA (TCID50/mL) Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105 Cấy bề mặt 2.105 7 104 103 2.105 101 101 Cấy hấp phụ 2.104 102 102 DEN-1 Cấy bề mặt 2.105 14 103 103 Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105 Cấy bề mặt 2.105 7 103 103 2.105 101 101 Cấy hấp phụ 2.104 102 102 DEN-2 Cấy bề mặt 2.105 14 102 102 Cấy hấp phụ 2.104 & 2.105 Cấy bề mặt 2.105 7 104 103 2.105 101 101 Cấy hấp phụ 2.104 102 102 DEN-3 Cấy bề mặt 2.105 14 103 103 Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn của cả 3 týp DEN sau 7 ngày gặt cho ngưỡng phát hiện là 104 TCID50/mL (với DFA) và 103 TCID50/mL (với IFA), còn sau 14 ngày gặt thì ngưỡng phát hiện là 101 - 103 TCID50/mL (với DFA và IFA). Như vậy, không có sự khác biệt giữa các thông số kỹ thuật khảo sát sau 7 ngày gặt nhưng sự khác biệt thể hiện rõ khi gặt tế bào gây nhiễm sau 14 ngày. So sánh kết quả phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 ở hai thời ñiểm gặt tế bào gây nhiễm (7 và 14 ngày) cho thấy tỷ lệ dương tính của DFA và IFA cao nhất khi cấy hấp phụ ở mật ñộ 2.105 tế bào/mL và gặt sau 14 ngày, ñồng thời tỷ lệ % tế bào nhiễm quan sát cũng cao hơn các thông số khác. Đối với RT-PCR DEN sử dụng bộ mồi Lanciotti Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược chiết xuất ARN bằng bộ sinh phẩm Qiagen và khuếch ñại ñoạn gen ñặc hiệu cho týp vi-rút DEN bằng RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti. Kết quả trình bày trong hình 1. Hình 1: Kết quả ñịnh týp vi-rút DEN và giới hạn phát hiện của RT-PCR với mồi Lanciotti trên bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn Trong quy trình RT-PCR và PCR bán tổ, yếu tố quyết ñịnh ñộ ñặc hiệu và ñộ nhạy là mồi. Mồi của Lanciotti thiết kế nằm trong vùng gien cấu trúc C và PrM cho thấy ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu cao nhất, vì thế phù hợp cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD từ HT bệnh nhân(4,8). ARN vi-rút DEN ñược chiết xuất bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral RNA mini kit của Qiagen. Đây là bộ sinh phẩm thương mại có quy trình ñơn giản, nhanh, tinh chế ARN triệt ñể giúp tăng ñộ nhạy của RT-PCR(8). Khi xét nghiệm trên bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn, RT-PCR DEN cho kết quả dương tính ở nồng ñộ vi-rút 102 TCID50/mL (ñối với týp vi-rút DEN-2, -3), phù hợp với kết quả của Vũ Thị Quế Hương(8). Riêng bộ HT có nồng ñộ vi-rút DEN- 1 chuẩn thì RT-PCR chỉ dương tính từ nồng ñộ 104 TCID50/mL trở ñi. Độ nhạy của RT-PCR ñối với týp vi- rút DEN-1 bị giảm so với 2 týp vi-rút DEN khác, có thể lý giải là do: 1-sai số khi pha loãng HT, 2- mồi Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 278 giảm ñộ nhạy do ñiều kiện bảo quản, 3- mồi giảm ñộ nhạy do chủng vi-rút DEN-1 ñã bị ñột biến ở vùng thiết kế mồi. Phân tích hồi quy tương quan tuyến tính giữa nồng ñộ vi-rút và hàm lượng ARN cho thấy nồng ñộ vi-rút tương quan tuyến tính với hàm lượng ARN tinh chế, thể hiện qua các phương trình hồi quy là: DEN-1 Y1 = 2,03X + 0,48; DEN-2 Y2 = 2,88X + 0,48; DEN-3 Y3 = 2,03X + 0,48(Error! Reference source not found.). Hơn nữa, giá trị OD A260nm của ARN 3 týp vi-rút DEN ở nồng ñộ 102 TCID50/mL ñều là 0,48-0,49 µg/µL, như vậy không thể do sai số pha loãng HT. Đồng thời, ñiều kiện bảo quản các mồi của Lanciotti là như nhau. Do ñó, kết quả ñộ nhạy RT-PCR giảm ñối với bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút DEN-1 là do chủng vi-rút DEN-1 phân lập trong giai ñoạn này ñã bị ñột biến ở vùng thiết kế mồi, gây cản trở cho sự bắt cặp, phù hợp với kết quả của Jean-Marc Reynes(7). Chúng tôi sẽ tiến hành giải trình tự vùng thiết kế mồi của týp vi-rút DEN-1 trên chủng vi-rút DEN-1 nghiên cứu ñể khẳng ñịnh kết quả này. KẾT LUẬN Nghiên cứu ñã thiết lập thành công quy trình xây dựng bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút DEN chuẩn cho chẩn ñoán vi-rút học bệnh SD/SXHD bằng phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và RT-PCR. Kết quả thu ñược như sau: Xác ñịnh nồng ñộ vi-rút DEN từ mẫu HT nghiên cứu ban ñầu với ñộ tin cậy cao và ổn ñịnh trong ñiều kiện bảo quản -700C. Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñược xây dựng cho từng týp vi-rút DEN riêng rẽ với thang nồng ñộ từ 101 ñến 105 TCID50/mL. Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn ñã xác ñịnh giới hạn phát hiện của kỹ thuật phân lập vi-rút trên nuôi tế bào muỗi C6/36 và ñịnh danh vi-rút bằng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (DFA) và gián tiếp (IFA) cũng như kỹ thuật RT-PCR với bộ mồi của Lanciotti. Bộ mẫu HT có nồng ñộ vi-rút chuẩn góp phần quan trọng trong công tác kiểm tra chất lượng nội bộ và tiến trình chuẩn hoá phòng thí nghiệm ở các viện khu vực, cũng như tăng cường hiệu quả giám sát vi-rút học bệnh SD/SXHD. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đặng Văn Giáp (1997). Phân tích dữ liệu khoa học bằng phần mềm Microsoft Excel. Nhà xuất bản giáo dục. Tr: 41-42. 2. Figueiredo L.T., Batista W.C., Igarashi A. (1997). Detection and identification of dengue virus isolates from Brazil by a simplified reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Revista do Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, 39(2): 79-83. 3. Figueiredo L.T.M., Shope R.E. (1987). An enzyme immunoassay for dengue antibody using infected cultured cells as antigen. J. Virol. Methods, 17: 191-198. 4. Lanciotti R.S, C.H. Calisher, D.J. Gubler, G. Chang, V. Vordam (1992). Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J Clin Microbiol, 30: 545- 551. 5. NSH (2008). Quality assurance in the diagnostic virobiology and serology laboratory. Standard Unit, Evaluations and standards laboratory center for infections. 6. Reed L.J. and H. Muench (1938). A Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints. Am J Epidemiol, 27: 493-497. 7. Reynes Jean-Marc, Sivuth Ong, Channa Mey, Chantha Ngan, Stefan Hoyer, Amadou A. Sall (2003). Improved Molecular Detection of Dengue Virus Serotype 1 Variants. J. Clin. Microbiol., 41(8): 3864-3867. 8. Vũ Thị Quế Hương (2001). Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn ñoán sốt xuất huyết và nghiên cứu dịch tể học phân tử vi-rút dengue. Luận án tiến sĩ y học, chuyên ngành dịch tể học.