Xây dựng hệ thống định lượng Alpha-Fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng Alpha-Fetoprotein được sản xuất từ tế bào Lymphô B của chuột Lou

209 XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHÔ B CỦA CHUỘT LOU Phan Ngọc Tiến* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein trong huyết thanh từ kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP). Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm. Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983F, có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng/ml. Nghiên cứu định lượng AFP trong 90 mẫu huyết thanh, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg (+), 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân u gan. Giá trị AFP tương ứng là 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP trong huyết thanh ở bệnh nhân u gan là > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%). Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP được sản xuất từ chuột LOU có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml. ABSTRACT THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTI- ALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 208 - 212 Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal antibodies. Method: Experimental research. Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml. In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%), respectively. Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml. ĐẶT VẤN ĐỀ Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng được Georges Kohler và César Milstein trình bày năm 1975(1), và từ đó cho đến nay kháng thể đơn dòng đã được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhất là trong kỹ thuật nhận diện và định lượng kháng nguyên. Alpha-fetoprotein (AFP), một glycoprotein, có trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, được tổng hợp ở gan phôi thai và túi ối, vì vậy nồng độ AFP bình thường trong dịch ối và huyết thanh * Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP. Hồ Chí Minh 210 bào thai người rất cao. Tuy nhiên AFP có trong huyết thanh người sau sinh và người trưởng thành rất thấp, chỉ khoảng 3ng/ml(7,9,11). Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát AFP tăng rất cao, và việc định lượng AFP trong huyết thanh gốp phần chẩn đoán bệnh ung thư gan nguyên phát. Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983(3), chúng tôi xây dựng hệ thống định lượng AFP trong huyết thanh người bằng kỹ thuật ELISA(5,10). Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng hệ thống định lượng alpha- fetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm. Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu - Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase. - Và 90 mẫu huyết thanh, được thu thập tại Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế và Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh. Trong đó 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có siêu âm hoặc CT scan phát hiện u gan, trong đó 20 nam và 5 nữ, 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân được chẩn đoán viêm gan siêu vi B cấp HBsAg (+), trong đó 9 nam và 7 nữ, 14 mẫu huyết thanh có HBsAg (+) nhưng không có biểu hiện lâm sàng, trong đó 10 nam – 4 nữ, 35 mẫu huyết thanh của người bình thường khỏe mạnh, HBsAg (-). Phương pháp thu thập số liệu - Xác định mối quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA. - Xác định mật độ quang tương ứng của các nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 350, 400, 500 ng/ml. Chúng tôi sử dụng AFP tinh chế và chuẩn độ của Viện Pasteur Tp. HCM. - Xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU: dùng phương pháp ELISA - Xác định mật độ quang tương ứng của các nồng độ thấp của AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; 5 ng/ml. Từ đó xác định nồng độ AFP thấp nhất có thể định lượng được bằng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU với phương pháp ELISA. - Định lượng AFP trong các mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng sử dụng kháng thể đơn dòng của chuột LOU: dùng phương pháp ELISA. Chuẩn bị 90 mẫu huyết thanh được đánh số thứ tự từ 1 đến 90, trong đó 35 mẫu huyết thanh của người bình thường được đánh số từ 1 đến 35, 14 mẫu huyết thanh của bệnh nhân có HBsAg (+) được đánh số từ số 36 đến 49, 16 mẫu huyết thanh của bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp được đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu huyết thanh của bệnh nhân u gan được đánh số từ 66 đến 90. Lần 1 mẫu huyết thanh định lượng không pha loãng, lần 2 những mẫu huyết thanh có nồng độ trên 350 ng/ml ở lần 1 sẽ được pha loãng với tỉ lệ 1:2. Những mẫu huyết thanh nào tiếp tục có nồng độ trên 350ng/ml thì chúng tôi quyết định lấy kết quả cuối cùng là trên 500 ng/ml. Xử lý số liệu Chương trình Point To Point, chương trình dùng cho xử lý số liệu trong kỹ thuật Elisa để tính kết quả định lượng nồng độ AFP. Chương trình SPSS 11.5 KẾT QUẢ Quan hệ tuyến tính giữa hai đại lượng nồng độ AFP và giá trị mật độ quang tương ứng Với kết quả thu được chúng tôi nhận thấy khi nồng độ AFP tăng thì DO cũng tăng theo. Nhưng đến nồng độ AFP bằng 350, 400, 500 ng/ml thì DO tăng không đáng kể. 211 Do vậy chúng tôi chỉ ứng dụng định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh đến mức cao nhất là 350ng/ml. Qua đường cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU (đồ thị 1), chúng tôi nhận thấy hai đại lượng DO và nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận. + r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO và nồng độ AFP có mối liên hệ thuận rất chặt chẽ. + Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng: y = a + bx, trong đó: Như vậy phương trình hồi qui tuyến tính là: y = 0,599 + 0,0055x + P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan tuyến tính theo chiều thuận giữa hai đại lượng DO và nồng độ AFP là rất rõ rệt, sự tương quan có ý nghĩa thống kê. AFP (ng/ml) 500450400350300250200150100500 D O 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 ,5 0,0 98 7 6 5 4 3 2 1 Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn của hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou AFP (ng/ml) 6543210 D O ,30 ,25 ,20 ,15 ,10 ,05 0,00 8 7 6 5 4321 Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn những giá trị thấp của nồng độ AFP Kết quả nồng độ AFP chuẩn thấp nhất mà hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng được (đồ thị 2) Qua đường biểu diễn trên ta thấy khi nồng độ AFP giảm thì giá trị DO giảm theo, nhưng khi đến nồng độ 0,5 ng/ml thì đường biểu diễn đi ngang. Do vậy giá trị thấp nhất mà hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU có thể định lượng 212 được là 0,5 ng/ml. Kết quả định lượng nồng độ AFP trong các mẫu huyết thanh bằng hệ thống định lượng AFP dựa trên kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU Số thứ tự mẫu huyết thanh Số mẫu huyết thanh Giá trị nhỏ nhất Giá trị lớn nhất Giá trị trung bình 1-35 35 1,08 7,26 2,7780 36-49 14 0,91 6,08 3,7993 50-65 16 6,2 113,53 32,1806 Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan (những mẫu huyết thanh từ số 66 đến 90) đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%). BÀN LUẬN Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein trong huyết thanh người bằng phương pháp Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột Lou và dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao vì có khả năng định lượng AFP ở nồng độ rất thấp là 0,5ng/ml so với hệ thống định lượng của các hãng khác là Abbott 0,4ng/ml(2) và Maxim Biotech 2ng/ml(6), và AFP-L có thể định lượng nồng độ AFP cao nhất là 350ng/ml so với của hãng Abbott là 350ng/ml(2) và Maxim Biotech là 300mg/ml(6). Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao vì qua các thử nghiệm đặc tính và định lượng không có phản ứng chéo với các protein của huyết thanh nhất là với albumin, protein có trọng lượng phân tử và cấu trúc gần giống với AFP. Kết quả định lượng nồng độ AFP trong 90 mẫu huyết thanh có kết quả tương đồng với các nghiên cứu trong và ngoài nước(2,6,8). Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng được sản xuất từ chuột Lou có khả năng định lượng AFP trong huyết thanh từ 0,5-350ng/ml, và chúng tôi hy vọng góp phần nhỏ trong việc sử dụng những hệ thống định lượng AFP. KẾT LUẬN Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột LOU đã mẫn cảm với AFP và dòng tế bào IR983, có thể định lượng nồng độ AFP trong huyết thanh từ 0,5ng đến 350ng/ml. Mật độ quang và nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p = 0,002 (< 0,01), và y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x: nồng độ AFP chuẩn). Kết quả nồng độ AFP định lượng bằng hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP của chuột LOU Giá trị trung bình nồng độ AFP của những người bình thường là 2,8 ng/ml. Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân có HBsAg(+) là 3,8 ng/ml. Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp là 32,1 ng/ml. Giá trị trung bình nồng độ AFP của những bệnh nhân u gan đa số là > 500 ng/ml (76%), chỉ 6 mẫu là có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%). Cám ơn: GS.TS. Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp. HCM, BS. Cao Đức Trùng Dương và BS. Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ Dũ Tp. HCM đã giúp thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abbas AK., Lichtman AH., Jordan S.poder (1994), Cellular snd Molecular Immunology, W.B. Sauders Company, A division of Harcourt Brace Company, USA. 2. Abbott laborarories Dignostics division (1992), In tumor marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8. 3. Bazin H (1990), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antobody, CRC Press, USA. 4. Harrison’s (1993), Principles of internal medicine, 12th Edition, Vol 2, pp.1381-1383. 5. Kemeny D.M. (1991), A practiceal guide to Elisa, Department of Allergy Guy’s Hospital, London. 6. Maxim Biotech (2006), “Alpha-fetoprotein Enzyme Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA, USA. 7. Nguyễn Cao Cương (2000), “Tầm sóat ung thư gan nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4), tr.24-28. 8. Nguyễn Kim Lữ Hiếu, Lê Văn Đôn (1996), “Nồng độ Alpha-fetoprotein ở 37 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr. 1-3. 213 9. Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học tập 1, nhà xuất bản tự điển bách khoa, Hà Nội, tr. 303-306. 10. Tijssen P. (1985), Practice and Theory of enzyme immunoassays, Elsevier, The Netherlands. 11. Trần Thị Chính, Phan Thị Phi Phi, Trương Mộng Trang (1993), “Đánh giá khả năng chẩn đoán ung thư gan của Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35. 214