Xây dựng mô hình gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu ba đậu và Pyridin trên thỏ

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 32 XÂY DỰNG MÔ HÌNH GÂY TRĨ THỰC NGHIỆM BẰNG HỖN HỢP DẦU BA ĐẬU VÀ PYRIDIN TRÊN THỎ Trần Mạnh Hùng*, Huỳnh Thị Hồng Phượng* TÓM TẮT Mục tiêu: Bệnh trĩ (hemorrhoid) được tạo thành do sự dãn quá mức các đám rối tĩnh mạch trĩ và là một trong những bệnh đứng đầu trong các bệnh lý về hậu môn-trực tràng. Do tỉ lệ mắc bệnh cao và ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống nên việc xây dựng các mô hình dược lý gây bệnh trĩ phục vụ cho các nghiên cứu trên là cần thiết. Với mục đích trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng mô hình gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu ba đậu và pyridine trên thỏ”. Phương pháp: Phương pháp gây trĩ thực nghiệm được tiến hành bằng cách bôi nhúng hỗn hợp các hóa chất có khả năng gây kích ứng trực tràng. Chỉ tiêu đánh giá gồm: mức độ và thời gian sưng đỏ, tiết dịch, viêm loét ở hậu môn và thời gian tạo thành búi trĩ và kích thước của búi trĩ. Kết quả: Hỗn hợp thích hợp để gây trĩ thực nghiệm là: 5 thể tích pyridin + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 10% trong diethyl ether, bôi nhúng 2 lần mỗi lần 200 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục 10 ngày. Với phương pháp này, sau 1 giờ đã xuất hiện các triệu chứng, sau 24 giờ có biểu hiện trĩ cấp và duy trì được khoảng 12-15 ngày. Kết luận: Như vậy, mô hình này có thể áp dụng để đánh giá hiệu quả điều trị trĩ của các thuốc mới hướng đến mục tiêu này. Từ khóa: Trĩ thực nghiệm, dầu ba đậu, pyridin. ABSTRACT DEVELOPMENT OF AN EXPERIMENTAL MODEL FOR CHEMICAL-INDUCED HEMORRHOID IN RABBIT Tran Manh Hung, Huynh Thi Hong Phuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 32 - 37 Objective: Hemorrhoids are dilated or bulging veins of the rectum and anus, and one of leading disorders of recto-anal diseases. Due to high prevalence and direct influence of hemorrhoids on quality of life, development of animal models for screening therapeutic agents is necessary. In this study, we investigated several hemorrhoid models induced by chemicals. Method: Experimental hemorrhoid model was induced by a mixture of irritating chemicals applied to rabbit rectum. Parameters for hemorrhoid evaluation included rectal swelling, exudates, inflammation and presence of sac-like protrusion. Results: Mixture that could induce experimental hemorrhoid was: 5 volumes of pyridine + 5 volumes of diethyl ether + 5 volumes of croton oil 10% in diethyl ether, 200 μL applied twice a day for 60 seconds. This mixture could evoke hemorrhoid symptoms after 24 hours and remaining for 12-15 days. Conclusion: Our model can be applied for screening anti-hemorrhoid agents. Keywords: Experimental hemorrhoid, croton oil, pyridine *Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 093.7746.596 Email: manhung1969@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh trĩ (hemorrhoid) được tạo thành do sự dãn quá mức các đám rối tĩnh mạch trĩ. Tuy không gây tử vong và ít khi có biến chứng nặng nề nhưng lại trực tiếp ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Trĩ là một trong những bệnh đứng đầu trong các bệnh lý về hậu môn-trực tràng. Bệnh trĩ rất phổ biến ở nước ta và trên thế giới với tỉ lệ người mắc bệnh khá cao(1). Do tỉ lệ mắc bệnh cao và ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng cuộc sống nên nhu cầu chữa bệnh luôn luôn đòi hỏi việc nghiên cứu, phát triển và hoàn thiện các phương pháp chữa bệnh, nghiên cứu tìm ra các thuốc mới. Bên cạnh đó hạn chế được các tổn thương và nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân cũng được quan tâm. Vì vậy, việc xây dựng các mô hình dược lý gây bệnh trĩ phục vụ cho các nghiên cứu trên là cần thiết, đặc biệt trong việc phát triển các thuốc chữa bệnh trĩ bằng dược liệu ở nước ta. Với mục đích trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng mô hình gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu ba đậu và pyridine trên thỏ”. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm Thỏ thí nghiệm là thỏ giống New Zealand, trọng lượng từ 1,5-2 kg, khỏe mạnh, không dị tật, không có biểu hiện bất thường, do viện Pasteur TP.HCM cung cấp. Thỏ được nuôi riêng từng con trong lồng kích thước 50 x 40 x 50 cm (cao x rộng x dài), được cung cấp đủ thức ăn và nước uống hàng ngày. Thỏ thí nghiệm sau khi gây được bệnh được phân ra thành các lô thử nghiệm sau: Lô chứng (6 con) để lành tự nhiên. Lô điều trị bằng thuốc trị trĩ trên thị trường (6 con). Hóa chất thử nghiệm Dầu ba đậu: thu được từ dịch chiết ép hạt ba đậu. Pyridin: hãng Sigma Chloroform: Merck Diethyether: Merck Phương pháp gây trĩ thực nghiệm Phương pháp gây trĩ thực nghiệm được tiến hành bằng cách bôi nhúng hỗn hợp các hóa chất có khả năng gây kích ứng trực tràng. Các hỗn hợp khảo sát được liệt kê dưới đây: 1. Hỗn hợp cồn tuyệt đối + chloroform (tỉ lệ 1:1), bôi nhúng 100 μL vào hậu môn thỏ trong vòng 60 giây kích ứng cách ngày trong 14 ngày 2. Hỗn hợp cồn tuyệt đối + chloroform (tỉ lệ 1:1), bôi nhúng 100 μL vào hậu môn thỏ trong vòng 60 giây kích ứng liên tục trong 14 ngày. 3. Chloroform (99%), bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng cách ngày trong 14 ngày. 4. Chloroform (99%), bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục trong 3 ngày liên tiếp sau đó nghỉ 1 ngày và sau đó tiếp tục kích ứng 3 ngày liên tiếp, tiếp tục như vậy trong vòng 24 ngày. 5. Chloroform (99%), bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục trong 14 ngày. 6. Hỗn hợp: 5 thể tích chloroform + 5 thể tích dầu ba đậu 6% trong diethyl ether, bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục trong ngày. 7. Hỗn hợp 5 thể tích CHCl3 + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 6% trong ether, bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục trong 14 ngày. 8. Hỗn hợp: 5 thể tích pyridin + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 6% trong diethyl ether. Kích ứng liên tục trong 3 ngày liên tiếp sau đó nghỉ 1 ngày và sau đó tiếp tục kích ứng 3 ngày liên tiếp, tiếp tục như vậy trong vòng 14 ngày. 9. Hỗn hợp: 5 thể tích pyridin + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 6% trong diethyl ether, bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng trong 14 ngày. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 34 10. Hỗn hợp: 5 thể tích pyridin + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 10% trong diethyl ether, bôi nhúng 100 μL trong vòng 60 giây, kích ứng trong 14 ngày 11. Hỗn hợp: 5 thể tích pyridin + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 10% trong diethyl ether, bôi nhúng 2 lần mỗi lần 200 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục trong 14 ngày. Chỉ tiêu đánh giá -Thời gian xuất hiện sưng đỏ, mức độ sưng đỏ -Thời gian niêm mạc bị tổn thương, mức độ tổn thương niêm mạc, viêm loét -Xuất huyết, mức độ xuất huyết nặng hay nhẹ -Tiết dịch, hậu môn chảy nước -Thời gian xuất hiện các mạch máu nhỏ xung quanh hậu môn -Thời gian tạo thành búi trĩ, kích thước của búi Phân tích thống kê Các số liệu được thống kê và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (standard error of mean: sai số chuẩn của giá trị trung bình) cũng như biểu diễn bằng các loại biểu đồ. Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,01-0,05 được thực hiện qua phép kiểm t- Student. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả khảo sát 11 hỗn hợp gây kích ứng Trong suốt quá trình thử nghiệm, chúng tôi đã theo dõi kết quả gây trĩ thực nghiệm của 11 hỗn hợp đã mô tả ở trên. Phần lớn các hỗn hợp khảo sát (từ hỗn hợp số 1 đến hỗn hợp số 10) đều có khả năng gây xuất hiện búi trĩ, tuy nhiên thời gian xuất hiện ngắn nên rất khó theo dõi đáp ứng của các thuốc thử nghiệm. Chỉ có duy nhất hỗn hợp số 11 (5 thể tích pyridin + 5 thể tích ether + 5 thể tích dầu ba đậu 10%/ ether) bôi nhúng 2 lần mỗi lần 200 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục 10 ngày sau 1 giờ đã xuất hiện các triệu chứng, sau 24 giờ có biểu hiện trĩ cấp và duy trì được khoảng 13-15 ngày (Hình 1). Hình 1. Quá trình gây trĩ thực nghiệm của hỗn hợp dầu ba đậu, pyridin và ether Các thông số đánh giá mức độ gây trĩ của hỗn hợp dầu ba đậu, pyridin và ether Mức độ gây trĩ được đánh giá bằng độ sưng của hậu môn (Hình 2, trái) và độ giãn tĩnh mạch (Hình 2, phải). So với thỏ bình thường, hậu môn của thỏ gây trĩ sưng to và có tĩnh mạch giãn rộng kèm theo sung huyết tĩnh mạch (Hình 2). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 35 Hình 2. Mức độ gây sưng viêm, giãn tĩnh mạch và sung huyết của hỗn hợp gây trĩ Đáp ứng của mô hình gây trĩ thực nghiệm với thuốc trị trĩ trên thị trường Do tổn thương sau khi gây trĩ có sưng, viêm loét, xuất huyết, tiết dịch, đóng vẩy cứng gây nứt hậu môn, nên chúng tôi tiến hành theo dõi đáp ứng của lô thí nghiệm sử dụng kết hợp 3 thuốc với các cơ chế khác nhau để điều trị triệu chứng của bệnh: Proctolog (Trimebutine: chống co thắt, dãn cơ co thắt hậu môn, Ruscogenins: trợ tĩnh mạch và bảo vệ mạch), Mastu (Bismuth subgallate: bảo vệ niêm mạc), Hydrocotisone (kháng viêm corticoid) để làm giảm nhanh chóng các tổn thương trên. Kết quả thực nghiệm cho thấy mô hình đáp ứng khá tốt với các thuốc điều trị (Hình 3, Bảng 1). Hình 3. Mức độ đáp ứng của một số chế phẩm điều trị trĩ Bảng 1. So sánh thời gian điều trị giữa thỏ chứng và thỏ gây trĩ Thỏ điều trị Thỏ chứng Thời gian hết sưng hoàn toàn (ngày) 8,0 ± 0,365** (n=6) 13,7 ± 0,83 (n=6) Thời gian hết viêm loét (ngày) 5,3 ± 0,333* (n=6) 6,83 ± 0,31 (n=6) Thời gian hết xuất huyết (ngày) 2,7 ± 0,211 (n=6) 3,33 ± 0,33 (n=6) Thời gian hết tiết dịch (ngày) 8,5 ± 0,847** (n=6) 14,3 ± 0,33 (n=6) Bàn luận Cho đến nay đã có một số nghiên cứu về xây dựng mô hình gây trĩ trên đông vật thí nghiệm được tiến hành với các phương pháp khác nhau nhưng chủ yếu gây mô hình bằng cách can thiệp sâu vào cấu trúc giải phẫu và dùng những hóa chất gây kích ứng da và niêm mạc, có khả năng gây tụ máu và gây phồng rộp (nhằm tạo ra các tổn thương như viêm, loét, tụ máu) dẫn đến việc hình thành các búi trĩ. Đa số các mô hình gây trĩ cấp theo dõi trong vòng 30 giờ (đối với việc sử dụng các hóa chất) hay trong vòng 2-3 tuần (khi can thiệp sâu vào cấu trúc giải phẫu). Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn các hóa chất như CHCl3, pyridine, dầu ba đậu dựa trên các tính chất hóa học và vật lý đặc trưng, khả năng gây kích ứng của các chất. Việc sử dụng hỗn hợp pyridine, dầu ba đậu và diethyl ether đã được một số nghiên cứu công bố, tuy nhiên tỉ lệ các chất trong hỗn hợp và phương pháp thực hiện hầu như không được mô tả rõ, đồng thời thời gian gây bệnh quá ngắn (24-30 giờ) nên rất khó đánh giá khi áp dụng mô hình để sàng lọc thuốc. Vì thế trong phương pháp này, chúng tôi đã tiến hành khảo sát để đưa ra những thông số thực nghiệm và chỉ tiêu đánh giá nhằm tạo ra được một mô hình phù hợp với điều kiện phòng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 36 thí nghiệm nước ta. Một số phương pháp gây trĩ thực nghiệm khác cũng được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Các mô hình gây trĩ thực nghiệm trên động vật(2,3,4,5) Tác giả Đối tượng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Kết quả Hélio Plapler (2006) Khỉ (Cebus Apella) Gây mê sau đó tiến hành thắt tĩnh mạch hậu môn Xuất hiện búi trĩ sau 9 ngày và kéo dài sau 2-3 tuần Nishiki K và cộng sự (1998) Chuột cống Bôi nhúng 0,16 ml hỗn hợp gồm nước khử ion, pyridine, diethyl ether, 6% dầu ba đậu trong pyridine ether (1:4:5:10) vào hậu môn chuột trong 12 giây. Xuất hiện phù nề, viêm, giãn mạch, tắc nghẽn mạch máu, xâm nhập fibrin và hoại tử trong biểu mô, sau 6 giờ và kéo dài trong 24 giờ. Okumura Makoto và cộng sự (1998) Chuột cống Bôi nhúng 100 μL hỗn hợp gồm nước (khử ion), pyridine, diethyl ether, 3% dầu ba đậu trong pyridine ether (1:4:5:10) vào hậu môn chuột trong 10 giây Xuất hiện phù nề, viêm, giãn mạch, sau 3 giờ và kéo dài trong 24 giờ. Marrero và các cộng sự (2008) Thỏ (NZ& SGB) Bôi nhúng 800 μL hỗn hợp gồm pyridine, diethyl ether và 6% dầu ba đậu trong diethyl ether trong vòng 60 giây Xuất hiện phù nề, giãn mạch, tắt nghẽn mạch máu, xâm nhập của fibrin, viêm và hoại tử trong biểu mô sau 10 giờ và kéo dài ổn định trong 30 giờ So sánh với thí nghiệm của chúng tôi với các kết quả thí nghiệm nêu trên, chúng tôi có những điểm tương đồng và khác biệt sau: - Tỉ lệ, thành phần các chất, chủng thú vật thí nghiệm: vì tiến hành thí nghiệm trên thỏ nên chúng tôi mô phỏng lại thí nghiệm Marrero Miragaya, Maria Acelia và các cộng sự với 400 μL được chia làm 2 lần mỗi lần duy trì trong 60 giây. Kết quả chúng tôi quan sát thấy có hiện tượng sưng viêm xảy ra sau 1 giờ, phù nề bắt đầu xuất hiện sau 2 giờ và sau 24 giờ hiện tượng phù nề, giãn mạch, có sự xuất hiện của các mạch máu nhỏ quanh hậu môn, xuất huyết, viêm và loét và tăng tiết dịch. Tuy nhiên do mục tiêu thí nghiệm duy trì được các triệu chứng trên sau ít nhất là 1 tuần để thử thuốc nên chúng tôi tiến hành kích ứng nhiều ngày và tăng tỉ lệ dầu ba đậu lên 10% dầu ba đậu trong diethyl ether. So sánh với các thí nghiệm của Nishiki K, Okumura Makoto, Marrero Miragaya, Maria Acelia chúng tôi cho rằng thiết kế về thời gian, liều thử nghiệm và chủng thú vật thí nghiệm có thể cho những kết quả khác nhau, liều thử nghiệm càng cao, tần suất lập lại nhiều lần thì mức độ thương tổn và khả năng duy trì các thương tổn kéo dài hơn. Ngoài ra chúng tôi nhận thấy rằng tác dụng gây nên các búi trĩ chủ yếu do tính chất của dầu ba đậu nên tăng tỉ lệ dầu lên thì khả năng xuất hiện búi trĩ nhiều hơn. - Về phương pháp tiến hành: so sánh với thí nghiệm của Hélio Plapler thì khả năng xuất hiện búi trĩ, tỉ lệ đạt được cao hơn và ổn định hơn so với thí nghiệm của chúng tôi. Ngoài ra thí nghiệm của Hélio Plapler còn có thể duy trì búi trĩ sau 2-3 tuần. Vì vậy phương pháp can thiệp sâu vào cấu trúc giải phẫu của hậu môn có thể cho được kết quả tốt hơn, ổn định hơn so với dùng hóa chất. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu “Xây dựng mô hình gây trĩ thực nghiệm bằng hỗn hợp dầu ba đậu và pyridine trên thỏ”chúng tôi đã thu được một số kết quả với nội dung được tóm tắt như sau: - Tỉ lệ thích hợp để gây trĩ là: 5 thể tích pyridin + 5 thể tích diethyl ether + 5 thể tích dầu ba đậu 10% trong diethyl ether, bôi nhúng 2 lần mỗi lần 200 μL trong vòng 60 giây, kích ứng liên tục 10 ngày. Với phương pháp này, sau 1 giờ đã xuất hiện các triệu chứng, sau 24 giờ có biểu hiện trĩ cấp và duy trì được khoảng 12-15 ngày. Về mặt thực nghiệm, và cả về mặt phương pháp, mô hình này rất thích hợp cho điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 37 - Các thú vật thử nghiệm có đáp ứng khá tốt với các thuốc trị bệnh trĩ trên thị trường như Proctolog, Mastu, Hydrocortison. Như vậy, mô hình này có thể áp dụng để đánh giá hiệu quả điều trị trĩ của các thuốc mới hướng đến mục tiêu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Quang Nghĩa (2001), Bệnh trĩ, NXB. Y học, Hà Nội. 2. Marrero M, et al (2008) “Formulation for the rectal administration of thrombolytically-acitive agents””, European Patent EP1576951. 3. Nishiki K, Nishinaga K (1998) “Croton oil – induced hemorrhoid model in rat: comparison of anti-inflammatory activity of diflucortolone valerate with other glucocorticoid”, Nippon Yakurigaku Zarshi, 92(4), 215-225. 4. Okumura M, Okuda T, Nakamura T, Yajima M (1998) “Preparation for treating wounds or hemorrhoids”, United States Patent 5852050. 5. Plapler H (2006) “Hemorrhoids: an experimental model in monkeys”, Acta Cirúrgica Brasileira, 21(5), 354-356.