Xây dựng phương pháp xác định locus gen phục vụ cho công tác thử nghiệm và giám định gen ở cây lúa theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017

98 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019 - Giá thể trồng thích hợp nhất cho cây hoa lan hạc vỹ là giá thể gỗ nhãn hình trụ kích thước 40 cm ˟ 15 cm, cây làm sinh trưởng phát triển tốt nhất. - Phân bón thích hợp nhất cho giai đoạn sinh trưởng của cây hoa lan hạc vỹ là phân Orchid-1 (30 - 10 - 10) thể hiện qua chiều dài chồi đạt cao nhất 36,4 cm sau 180 ngày trồng, và số lá nhiều nhất 16,6 lá. - Phân bón thích hợp cho giai đoạn phân hóa mầm hoa và chất lượng của hoa lan hạc vỹ là Orchid-2 (6 - 30 - 30) khi dùng phân bón này cho số ngồng hoa nhiều nhất 4,1 ngồng hoa, số hoa nhiều nhất 36 hoa, đường kính hoa to 4,3 cm, độ bền hoa cao 10 ngày. TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Hoàng Hộ, 1974. Cây cỏ Việt Nam. NXB Sài Gòn. Trần Hợp, 1998. Phong lan Việt Nam. NXB Nông nghiệp. Nguyễn Thị Lài, Phạm Hương Sơn, Nguyễn Hữu Cường, 2016. Nghiên cứu đặc điểm cấu tạo của hoàng thảo hạc vỹ và hoàng thảo nghệ tâm. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam. Lưu Chấn Long, 2001. Trồng và thưởng thức lan nghệ thuật. NXB Đà Nẵng. Nguyễn Công Nghiệp, 2015. Trồng hoa lan. NXB Hồ Chí Minh. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH LOCUS GEN PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC THỬ NGHIỆM VÀ GIÁM ĐỊNH GEN Ở CÂY LÚA THEO TIÊU CHUẨN ISO/IEC 17025:2017 Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, Chu Đức Hà1, Nguyễn Thị Nhài1, Nguyễn Bá Ngọc1, Khuất Thị Mai Lương1, Phạm Thị Lý Thu1, Lê Hùng Lĩnh1 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, phương pháp xác định 10 gen (locus gen) kháng bệnh và chống chịu bất lợi phi sinh học ở lúa đã được xây dựng cho Phòng Sinh học phân tử giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017. Kết quả khảo sát 10 chỉ thị phân tử, RM153 (liên kết với xa5), P3 (liên kết với Xa7), pTA248 (liên kết với Xa21), RM224 (liên kết với Pik-h), pB8 [liên kết với Pi9(t)], RM527 (liên kết với Piz-5), RM7102 (liên kết với Pita-2), ART5 (liên kết với Sub1), RM493 (liên kết với Saltol) và BAD2 (liên kết với fgr) phù hợp cho hoạt động thử nghiệm. Phương pháp xác định gen (locus gen) phục vụ thử nghiệm được xây dựng với bốn bước cơ bản, tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa, khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR, kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose và phân tích kết quả. Kết quả của nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng để xây dựng Quy trình thử nghiệm và vận hành phòng Sinh học phân tử giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017. Từ khóa: ISO/IEC 17025:2017, gen, locus, lúa, xác định gen Completion of technical process in planting and nursuring Hac Vi orchid in Ha Giang province Bui Huu Chung, Ngo Van Ky Abstract In order to complete the technical process of planting and tending orchids, the research has conducted 4 experiments, including: The effect of planting season on growth and development; influence of growing media on growth and developmen; effect of fertilizers on growth ability; effect of fertilizer on the time of emergence of flower buds and the quality of flowers. The results showed that the most appropriate planting time was in March 15, 2018; the most suitable growing medium was loganophyllid with cylinder size of 40 cm ˟ 15 cm; the most suitable fertilizer was Orchid-1 (30 - 10 - 10); the fertilizer suitable for the flower sprouting was Orchid-2 (6 - 30 -30). The process of planting and caring for the orchid plants was developed for Quan Ba district, Ha Giang province. Keywords: Lan cranes, experiments, technical processes Ngày nhận bài: 10/2/2019 Ngày phản biện: 16/2/2019 Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Tỉnh Ngày duyệt đăng: 11/3/2019 1 Viện Di truyền Nông nghiệp, VAAS 99 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019 I. ĐẶT VẤN ĐỀ ISO/IEC 17025:2017 (International Organization for Standardization/ International Electrotechnical Commission) là phiên bản mới nhất của Tiêu chuẩn quốc tế về hệ thống quản lý chất lượng áp dụng riêng cho phòng thử nghiệm/hiệu chuẩn (Honsa and McIntyre, 2003). Đây là tiêu chuẩn cứng, điều kiện bắt buộc được đưa ra cho phòng thử nghiệm/hiệu chuẩn nhằm đảm bảo kết quả đo lường/thử nghiệm đạt được kết quả tin cậy nhất và được quốc tế công nhận. Vì thế, ISO/IEC 17025:2017 được xem là mục tiêu cần hướng đến và đạt được của các phòng thí nghiệm trong nước hiện nay. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong tích hợp gen (locus gen) mục tiêu nhằm cải tiến tính trạng mong muốn của các giống lúa đại trà là cách tiếp cận tối ưu, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả chọn tạo giống (Lê Hùng Lĩnh và ctv., 2017). Từ đó, một số giống lúa cải tiến đã được ra đời, với việc tích hợp gen kháng bệnh và chống chịu bất lợi phi sinh học. Do vậy, xác định chính xác sự có mặt của gen (locus gen) mục tiêu trong dòng/giống lúa được xem là yêu cầu cấp bách trong thời gian tới. Trong nghiên cứu này, phương pháp xác định 10 gen (locus gen) mục tiêu, bao gồm ba gen kháng bệnh bạc lá xa5, Xa7 và Xa21; bốn gen kháng bệnh đạo ôn Pik-h, Piz-5, Pita-2 và Pi9(t); locus gen chịu ngập Sub1; locus gen chịu mặn Saltol và gen qui định mùi thơm fgr ở lúa được thiết lập nhằm áp dụng cho Phòng Sinh học phân tử giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu giống lúa cần thử nghiệm được nhân viên phòng giám định thu thập trên đồng ruộng hoặc do khách hàng cung cấp được mô tả như trong nghiên cứu trước đây (Chu Đức Hà và ctv., 2018). Mẫu thử nghiệm phải có lai lịch giống rõ ràng, được lai tạo từ giống chuẩn cho gen ( ) (IRRI cung cấp) và giống gốc ( ). - Nghiên cứu này sử dụng các mẫu giống chuẩn mang gen/ locus gen mục tiêu và các giống chuẩn không mang gen do Viện Lúa Quốc tế cung cấp cùng với các giống tham khảo BT7, BC15 và Khang dân 18... để hoàn thiện phương pháp xác định các locus gen, xây dựng quy trình (Bảng 1). Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen (locus gen) mục tiêu được khai thác trong nghiên cứu trước đây (Bảng 2). Bảng 1. Danh sách các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu STT Tên giống Gen Tính trạng STT Tên giống Gen Tính trạng 1 IRBB5 xa5 Kháng bệnh bạc lá 10 Basmati fgr Mùi thơm 2 IRBB7 Xa7 11 CO39 - Mẫn cảm bệnh đạo ôn 3 IRBB21 Xa21 12 IR24 - Mẫn cảm bệnh bạc lá 4 IRBLkh-K3[LT] Pi-kh Kháng bệnh đạo ôn 13 IR64 - Mẫn cảm ngập 5 IRBL9-W Pi9(t) 14 IR29 - Mẫn cảm mặn 6 IRBLz5-CA Piz-5 15 BT7 - Tham khảo 7 IRBLta2-Re Pita-2 16 BC15 - Tham khảo 8 IR64-Saltol Saltol Chịu mặn 17 KD18 - Tham khảo 9 IR64-Sub1 Sub1 Chịu ngập Bảng 2. Danh sách chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen (locus gen) mục tiêu STT Tên mồi Trình tự mồi Gen/locus gen Khoảng cách đến gen (cM) 1 RM153 F: 3’-GCCTCGAGCATCATCATCAG-5’ xa5 5,0 R: 3’-ATCAACCTGCACTTGCCTGG-5’ 2 P3 F: 3’-CAGGAATTGACTGGAGTAGTGGTT-5’ Xa7 3,4 R: 3’-CATCACGGTCACCGCCATAT-5’ 3 pTA248 F: 3’-AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA-5’ Xa21 0 R: 3’-AGACGCGGTAATCGAAGATGAAA-5’ 4 RM224 F: 3’-ATCGATCGATCTTCACGAGG-5’ Pik-h 0 R: 3’-TGCTATAAAAGGCATTCGGG-5’ 100 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019 5 pB8 F: 3’-CCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA-5’ Pi9(t) 0 R: 3’-CCCAATCTCCAATGACCCATAAC-5’ 6 RM527 F: 3’-GGCTCGATCTAGAAAATCCG-5’ Piz-5 0,3 R: 3’-TTGCACAGGTTGCGATAGAG-5’ 7 RM7102 F: 3’-TTGAGAGCGTTTTTAGGATG-5’ Pita-2 1,3 R: 3’-TCGGTTTACTTGGTTACTCG-5’ 8 RM493 F: 3’-TAGCTCCAACAGGATCGACC-5’ Saltol 0 R: 3’-GTACGTAAACGCGGAAGGTG-5’ 9 ART5 F: 3’-CAGGGAAAGAGATGGTGGA-5’ Sub1 0 R: 3’-TTGGCCCTAGGTTGTTTCAG-5’ 10 BAD2 ESP: TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-5’ fgr Khuếch đại vùng gen thơm IFAP: CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-5’ INSP: CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA-5’ EAP: AGTGCTTTACAAAGTCCCGC-5’ Bảng 2. Danh sách chỉ thị phân tử liên kết chặt với các gen (locus gen) mục tiêu (Tiếp) 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu: Mẫu giống được thu thập và bảo quản dựa trên phương pháp lấy mẫu lúa theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017 của phòng thử nghiệm theo mô tả trong nghiên cứu trước đây (Chu Đức Hà và ctv., 2018). - Phương pháp tách chiết ADN tổng số: Mẫu lá thử nghiệm được tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethylammonium bromide) (Semagn, 2014). Chất lượng của ADN được kiểm tra trên hệ thống máy đọc quang phổ SpectroMAX 190 (Molecular Devices, Hoa Kỳ). - Phương pháp khuếch đại bằng phản ứng PCR: Mẫu ADN pha loãng đến nồng độ 30 ng/µl được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR trên máy C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-rad, Hoa Kỳ) (Rahman et al., 2013). - Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose: Sản phẩm PCR được tiến hành điện di trên gel agarose 2,5% có bổ sung thuốc nhuộm safeview ADN với dung dịch đệm TBE 0,5Χ (Tris base, boric acid, EDTA) (Kumar et al., 2015). 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2018 tại phòng Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát đa hình ADN nguồn vật liệu nghiên cứu Khảo sát đa hình ADN giữa giống lúa gốc và giống chuẩn là bước khởi đầu quan trọng để xác định chỉ thị liên kết gen mục tiêu phù hợp cho phép thử nghiệm. Trong nghiên cứu này, 10 chỉ thị liên kết chặt với 10 gen (locus gen) mục tiêu được sử dụng để phân tích đa hình ADN giữa giống chuẩn mang gen, giống chuẩn không mang gen và các giống tham khảo (Bảng 1, 2). Đối với các thử nghiệm gen kháng bạc lá, với chỉ thị RM153 liên kết chặt với gen kháng bạc lá xa5, IRBB5 (mang gen xa5) cho băng điện di ADN ở vị trí ~185bp, thể hiện đa hình di truyền khá rõ với IR24 (không mang gen) và các giống tham khảo BC15, KD18 và BT7 (Hình 1a). Đối với chỉ thị P3 liên kết Xa7, IRBB7 cho băng điện di có kích thước ~300bp, thể hiện tính đa hình di truyền rất rõ với các giống còn lại (Hình 1b). Tương tự, đối với chỉ thị pTA248, IRBB21 (mang gen Xa21) cho băng ở vị trí ~1000bp, thể hiện đa hình rõ với các giống còn lại (Hình 1c). Đối với các thử nghiệm gen kháng đạo ôn, chỉ thị RM224 liên kết chặt với gen Pik-h cho kết quả đa hình ADN khá rõ giữa giống chuẩn mang gen (băng ADN ở vị trí ~135bp) với giống CO39 (không mang gen) và ba giống tham khảo (Hình 1d). Các phân tích cũng cho kết quả tương tự khi đánh giá mức độ đa hình giữa giống cho gen, giống không có gen và các giống tham khảo đối với chỉ thị RM527 (liên kết với Piz-5) và RM7102 (liên kết Pita-2) (Hình 1e, g). Trong khi đó, chỉ thị pB8, liên kết với Pi9(t), được ghi nhận trong nghiên cứu trước đây là chỉ thị trội (Xiao et al., 2012), do vậy kết quả điện di cho thấy giống chuẩn mang gen Pi9(t) cho băng ADN ở vị trí ~500bp, các giống còn lại đều không cho băng ADN (Hình 1f). 101 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019 Đối với các thử nghiệm gen chống chịu bất lợi phi sinh học, kiểm tra sản phẩm PCR đã xác nhận chỉ thị ART5 (liên kết với gen chịu ngập Sub1) cho đa hình ADN khá rõ ràng giữa giống chuẩn mang gen Sub1 (băng điện di ~200bp) với IR64 và các giống tham khảo (Hình 1h). Tương tự, phân tích với RM493 (liên kết chặt với gen chịu mặn Saltol) cho thấy IR64-Saltol cho băng ADN ở vị trí ~228bp, đa hình khá rõ nét với các giống còn lại (Hình 1i). Cuối cùng, đối với thử nghiệm gen qui định mùi thơm fgr, chỉ thị BAD2 cho kết quả điện di đa hình rõ rệt giữa hai giống lúa thơm Basmati, BT7 với các giống lúa không thơm BC15, KD18 và CO39 (Hình 1k). a) d) b) e) c) f) g) h) i) k) Hình 1. Kết quả phân tích đa hình ADN giữa các giống lúa nghiên cứu với các chỉ thị liên kết các gen mục tiêu: (a) xa5, (b) Xa7, (c) Xa21, (d) Pik-h, (e) Piz-5, (f) Pi9(t), (g) Pita-2, (h) Sub1, (i) Saltol và (k) fgr 3.2. Xây dựng phương pháp xác định locus gen mục tiêu phục vụ thử nghiệm và giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017 Xác định sự có mặt của 10 gen (locus gen) mục tiêu trên các mẫu giống lúa được thực hiện theo quy trình chung gồm bốn bước thử nghiệm, (1) tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa, (2) khuếch đại gen (locus gen) bằng kỹ thuật PCR, (3) kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose và (4) phân tích kết quả. Để thực hiện hoạt động thử nghiệm, các hóa chất sinh học phân tử được chuẩn bị bao gồm dịch đệm chiết (0,1M Tris-HCl, pH 8; 0,05M EDTA; 0,5M NaCl; 0,07% β-mercaptoethanol); dung dịch SDS 10%; đệm CTAB (0,2M Tris-Cl, pH7,5; 0,05M EDTA; 2M NaCl; 2% (w/v) CTAB); hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1); đệm TE (10 mM Tris-HCI pH 8, 1,0 mM EDTA); RNase (10mg/ml); Isopropanol; Ethanol; Mồi PCR (Bảng 2); Thang ADN chuẩn; Enzyme Taq polymerase (5U); PCR buffer (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl và 1,5 mM MgCl2); dNTPs; Agarose; Dung dịch đệm TBE 5X (1,1M Tris; 900mM Borate; 25mM EDTA; pH 8,3) và thuốc nhuộm ADN Safeview. Dụng cụ, vật tư tiêu hao cơ bản gồm kéo cắt mẫu, găng tay; eppendorf 1,5 - 2,0 ml; đầu tip (10, 200, 1000 µl), plate PCR, bút ghi nhãn. Thiết bị cần sử dụng gồm máy nghiền mẫu RETSCH Mixer Mills MM 200; bể ổn nhiệt Memmert WNB14; máy li tâm Eppendorf 5430R; máy làm khô ADN Eppendorf™ Vacufuge™ Concentrator; máy định lượng ADN Molecular Devices SpectraMax 190; máy PCR Bio-Rad C1000 Touch; bộ điện di ngang Owl A2-BP; máy chụp ảnh gel điện di Analytik Jena UVP Geldoc-it2; bộ pippet Research® plus. (1) Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa: Kỹ thuật tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá lúa thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp CTAB có cải tiến (Semagn, 2014). Cụ thể, khoảng 500 mg mẫu lá lúa được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2 ml có sẵn 1 viên bi nghiền. Ống eppendorf và giá 102 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019 đựng xử lý N2 được đưa vào máy nghiền mẫu trong 3 phút để nghiền thành dạng bột mịn. Bổ sung 1 ml đệm chiết và 50µl SDS 10%, trộn đều và ủ 30 phút trong bể ổn nhiệt ở 650C, lắc nhẹ. Ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 15 phút. Thu lấy dịch nổi ở trên vào ống eppendorf mới và thêm một thể tích tương ứng isopropanol, lắc nhẹ và ủ đá trong 10 - 30 phút. Ly tâm với 12.000 rpm trong 10 phút, sau đó loại bỏ pha dịch, làm khô kết tủa tự nhiên. Thêm 400 µl TE để hoà tan. Thêm 1µl RNase (10mg/ml), ủ mẫu ở 370C trong 2h. Bổ sung 1 ml dung dịch đệm CTAB và đảo đều ống trong 15 giây. Hỗn hợp được ủ trong bể ổn nhiệt ở 650C trong 30 phút. Ống được ly tâm ở 12.000 rpm trong 10 phút ở 40C, phần dịch nổi được chuyển sang ống mới. Bổ sung 800 μl hỗn hợp chloroform: isoamylacohol (24:1) và lắc đều, tiếp tục ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 15 phút ở 40C. Phần dịch nổi được chuyển sang ống mới; Isopropanol được bổ sung vào ống theo tỉ lệ 1:1 cùng với 5µl NaCl 1M. Hỗn hợp được đảo đều trong 5-7 phút và ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút. Kết tủa được rửa trong 500 µl Ethanol 70% và ly tâm 12.000 rpm trong 10 phút để thu tủa ADN. ADN tinh sạch được làm khô trong 30 phút và hòa tan với đệm TE. Đánh giá nồng độ và chất lượng ADN bằng máy đọc quang phổ. Mẫu ADN được bảo quản ở –200C hoặc –860C cho các thí nghiệm tiếp theo (Hình 2). Trong nghiên cứu này, mẫu ADN được coi là đạt tiêu chuẩn khi 1,8 ≤ OD260/280 ≤ 2,1 (Storchova et al., 2000). (2) Phương pháp khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR: Mẫu ADN đã pha loãng tới nồng độ 30 ng/µl được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR bằng mồi đặc hiệu cho từng (locus) gen mục tiêu. Mỗi mẫu giống lúa cần thử nghiệm sẽ được phân tích 100 mẫu ADN đại diện cho 100 cá thể của mẫu giống lúa. Mẫu giống chuẩn mang gen/ locus gen mục tiêu, mẫu giống chuẩn không mang gen và giống tham khảo được phân tích 1 mẫu ADN/ mẫu giống. Các thao tác chuẩn bị phản ứng và chu trình nhiệt được thực hiện dựa trên mô tả đã được nghiên cứu trước đây (Rahman et al., 2013). Tổng thể tích cho một phản ứng (1X) là 10 µl, bao gồm 30 ng ADN tổng số, 12 pmol mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X dung dịch đệm PCR, và 1,0 đơn vị Taq Polymerase (Rahman et al., 2013). Chu trình nhiệt được thiết lập một cách tối ưu, 940C - 5 phút; 35 chu kỳ của 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 7 phút và giữ mẫu ở 40C (Rahman et al., 2013). Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR Bio-Rad C1000 Touch (Hình 2). (3) Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose: Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 2,5% (Kumar et al., 2015). Cân 7,5 gam agarose bổ sung vào 300 ml dung dịch TBE 0,5X. Đun và khuấy đều để tạo thành dạng gel trong 2 phút, sau đó bổ sung 10 µl thuốc nhuộm safeview ADN vào gel. Đổ gel nóng vào khay điện di đã cắm lược, để nguội trong 45 phút. Chuẩn bị 3 lít dung dịch đệm TBE 0,5X. Dùng pippete hút 10 µl sản phẩm PCR vào mỗi giếng và sử dụng thang ADN chuẩn 50bp. Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 90V trong 3 giờ cho đến khi băng màu xanh Bromophenol gần ra khỏi bản gel. Bản gel sau khi điện được đưa vào máy chụp ảnh gel điện di Analytik Jena UVP Geldoc-it2 để ghi nhận kết quả (Hình 2). Hình 2. Sơ đồ phương pháp xác định locus mục tiêu theo ISO/IEC 17025:2017 (4) Phân tích kết quả: Kết quả phân tích PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2) được ghi nhận bằng ảnh điện di. Phương pháp phân tích kết quả dựa vào kích thước băng của giống chuẩn mang gen mục tiêu. Mẫu thử nghiệm được coi là dương tính, có phát hiện gen mục tiêu khi giếng chứa mẫu thử nghiệm xuất hiện băng điện di có kích thước giống như của giống chuẩn mang gen tương ứng (Bảng 1, Hình 1). Mẫu được coi là không phát hiện gen mục tiêu khi giếng chứa mẫu thử nghiệm xuất hiện băng điện di có kích thước khác với giống chuẩn mang gen. Với phương pháp thử nghiệm như trên, kết quả phân tích cho phép đưa ra nhận định về sự có mặt/ vắng mặt của gen mục tiêu trong mẫu giống và tỷ lệ cá thể mang gen (%) trong lô mẫu thử nghiệm. 103 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(100)/2019 IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Đã xác định chỉ thị RM153 liên kết xa5, P3 liên kết Xa7, pTA248 liên kết Xa21, RM224 liên kết Pik-h, pB8 liên kết Pi9(t), RM527 liên kết Piz-5, RM7102 liên kết Pita-2, ART5 liên kết locus gen Sub1, RM493 liên kết locus gen Saltol và BAD2 liên kết fgr phù hợp cho thử nghiệm 10 chỉ tiêu gen kháng bệnh và chống chịu bất lợi phi sinh học. Đã thiết lập được phương pháp xác định locus gen mục tiêu phục vụ thử nghiệm và giám định gen thực vật theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017. Quy trình gồn bốn bước chính, tách chiết ADN tổng số, khuếch đại gen (locus gen) bằng PCR, kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose và phân tích kết quả. Kết quả phân tích 100 cá thể ngẫu nhiên cho phép đưa ra nhận định về sự có mặt/ vắng mặt của gen mục tiêu trong mẫu giống thử nghiệm và tỷ lệ cá thể mang gen (%) trong lô mẫu đưa vào thử nghiệm. 4.2. Đề nghị Nghiên cứu sẽ được tiếp tục hoàn thiện và cải tiến nhằm nâng cao hiệu quả thử nghiệm xác định locus gen mục tiêu và áp dụng cho Phòng Sinh học phân tử giám định gen thực vật đạt chuẩn ISO/IEC 17025:2017. LỜI CẢM ƠN Công trình nghiên cứu nằm trong hoạt động xây dựng Phòng Sinh học phân tử giám định gen thực vật đạt chuẩn ISO/IEC 17025:2017, thuộc Tiểu dự án FIRST-AGI “Nâng cao năng lực nghiên cứu, làm chủ công nghệ genom học (Genomics-assisted breeding - GAB) và công nghệ chọn giống ứng dụng chỉ thị phân tử (Marker-assisted backcrossing - MABC) để chọn tạo các giống lúa kháng đa yếu tố ứng phó với biến đổi khí hậu”. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chu Đức Hà, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thị Nhài, Nguyễn Bá Ngọc, Khuất Thị Mai Lương, Phạm Thị Lý Thu, Lê Hùng Lĩnh, 2018. Thiết lập phương pháp lấy mẫu lúa theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025:2017 phục vụ thử nghiệm xác định locus gen. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 11(96): 46-50. Lê Hùng Lĩnh, Chu Đức Hà, Đào Văn Khởi, Phạm Thị Lý Thu, 2017. Tích hợp gen/QTL trong cải tiến giống lúa ứng phó biến đổi khí hậu bằng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại. Tạp chí Khoa học & Công nghệ Việt Nam, 15(4): 60-64. Honsa, J. D., McIntyre, D. A., 2003. ISO 17025: Practical benefits of implementing a quality system. J AOAC Int, 86(5): 1038-1044. Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A., 2015. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genom Data, 5: 218-222. Rahman, M., Iqbal, M. A., Shaheen, N., Zafar, Y., 2013. Microsatellites: Methods & Protocols. In Stress and Plant Biotechnology, 130-152. Semagn, K., 2014. Leaf tissue sampling and DNA extraction protocols. In Molecular Plant Taxonomy: Methods and Protocols, 53-67. Storchova, H., Radmila, H., Chrtek, J., Tetera, M., Fitze, D., Fehrer, J., 2000. An improved method of DNA isolation from plants collected in the field and conserved in saturated NaCl/CTAB solution. Taxon, 49(1): 79-84. Xiao, W., Yang, Q., Wang, H., Duan, J., Guo, T., Liu, Y., Zhu, X., Chen, Z., 2012. Identification and fine mapping of a major R gene to Magnaporthe oryzae in a broad-spectrum resistant germplasm in rice. Mol Breed, 30(4): 1715-1726. Establishment of the protocol for detection of locus genes toward the gene detection in rice with ISO/IEC 17025:2017 standard Nguyen Thi Minh Nguyet, Chu Duc Ha, Nguyen Thi Nhai, Nguyen Ba Ngoc, Khuat Thi Mai Luong, Pham Thi Ly Thu, Le Hung Linh Abstract In this study, the protocol of detection of 10 disease- and abiotic stress (es)- resistance genes (locus) in rice have been successfully constructed. Ten molecular markers, including RM153 (for xa5), P3 (for Xa7), pTA248 (for Xa21), RM224 (for Pik-h), pB8 (for Pi9(t)), RM527 (for Piz-5), RM7102 (for Pita-2), ART5 (for Sub1), RM493 (for Saltol) and BAD2 (for fgr) was suitable for gene detection. The protocol of gene detection was established with four basic steps: (1) total DNA extraction from rice leaves, (2) amplification of target genes by PCR, (3) agarose gel electrophoresis and (4) data analysis. This result contributes significantly to the establishment and operation of the Laboratory of Molecular Biology for Gene Detection in plant with ISO/IEC 17025:2017 standard. Keywords: Detection, ISO/IEC 17025:2017, gene, locus, rice Ngày nhận bài: 19/2/2019 Ngày phản biện: 26/2/2019 Người phản biện: PGS. TS. Lã Tuấn Nghĩa Ngày duyệt đăng: 11/3/2019