Xây dựng qui trình đánh giá hoạt tính enzym 5α-Reductase từ mô tuyến tiền liệt người

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 332 XÂY DỰNG QUI TRÌNH Đ[NH GI[ HOẠT TÍNH ENZYM 5α-REDUCTASE TỪ MÔ TUYẾN TIỀN LIỆT NGƢỜI Trần Thủy Tiên*, Nguyễn Đức Toàn*, Trần Mạnh Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng qui trình đ{nh gi{ hoạt tính 5α-reductase in vitro từ mô tuyến tiền liệt người để sàng lọc các thuốc có t{c động điều trị PĐTTLLT. Đối tượng v| phương pháp nghiên cứu Mẫu thử nghiệm: Mẫu mô tuyến tiền liệt của bệnh nh}n PĐTTLLT được chỉ định phẩu thuật tại bệnh viện Bình Dân, Tp. HCM với đầy đủ hồ sơ bệnh án và sự đồng ý của bệnh nhân. Quy trình tạo dịch đồng thể chứa enzym 5α-reductase: Mô tuyến tiền liệt được đồng nhất hóa, ly tâm thu cắn. Hòa cắn với dịch bảo quản và tiếp tục nghiền đồng thể cho đến khi thu được dịch đồng nhất. Định lượng protein trong dịch đồng thể enzym bằng phương ph{p Bradford Định lượng testosteron bằng phương ph{p ELISA: Thực hiện theo hướng dẫn từ bộ Kit của công ty sản xuất DRG, Đức. Khảo s{t điều kiện thực hiện phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron Các yếu tố như nồng độ testosteron, nồng độ NADPH, lượng protein enzym, pH và thời gian phản ứng được khảo s{t để chọn điều kiện phản ứng xảy ra với hoạt tính enzym cao. Kết quả: Qui trình tạo dịch đồng thể chứa 5α-reductase từ mô tuyến tiền liệt người xúc tác cho phản ứng chuyển testosteron thành dihydrotestosteron diễn tiến tốt ở pH = 5,5, lượng protein enzym tối thiểu 1,4 mg, nồng độ testosteron khoảng 16 ng/ml (55 nM), nồng độ NADPH: 0,15 mM, nhiệt độ ủ: 37 ºC và thời gian ủ: 60 phút. Finasterid ức chế mạnh 5α-reductase chiết từ tuyến tiền liệt người với IC50 là 10,87 nM. Kết luận: Qui trình tạo dịch đồng thể enzym 5α-reductase v| điều kiện phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron có thể ứng dụng để sàng lọc thuốc có t{c động ức chế 5α-reductase. Từ khóa: Dịch đồng thể enzym, 5α-reductase, in vitro, finasterid ABSTRACT DEVELOPING AN IN VITRO PROCEDURE FOR EVALUATION OF 5α-REDUCTASE ACTIVITY FROM HUMAN PROSTATE TISSUE Tran Thuy Tien, Nguyen Duc Toan, Tran Manh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 332 - 339 Aim of study: This study aimed to develop an in vitro procedure for evaluation of 5α-reductase activity from human prostate tissue that was applicable in drug screening. Material and methods BHP tissue: tissue was collected from patients undergoing endoscopic surgery for BHP at Binh Dan hospital with complete medical records and agreement of acceptance. Procedure to prepare homogenate containing 5α-reductase: BHP tissue was sliced and homogenized. Centrifuge the homogenate and remove supernatant. Continue to homogenize to form and a homogenous suspension. * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 Email: manhhung1969@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 333 Protein in the homogenate was assayed by Bradford method Testosterone was assayed by ELISA: using the Kit provided by DRG, Germany. Optimizing reactive conditions to covert testosterone into dihydrotestosterone: factors such as testosterone concentration, NADPH concentration, amount of enzymatic protein, pH and reaction time were investigated to establish high enzyme activity in the reaction. Results: Procedure to prepare homogenate from BHP tissue containing 5α-reductase catalyzed the conversion of testosterone to dihydrotestosterone under following conditions: pH 5.5, amount of enzymatic protein at least 1.4 mg, testosterone concentration approximate 16 ng/ml, NADPH: 0.15 mM, reaction temperature: 37ºC and reaction time: 60 minutes. Finasteride strongly inhibited 5α-reductase in the homogenate with IC50 of 10.87 nM. Conclusion: Procedure for preparation of enzyme homogenate containing 5α-reductase and reaction conditions can be applied as a screening tool for 5α-reductase inhibitors. Key words: enzym homogenate, 5α-reductase, in vitro, finasteride ĐẶT VẤN ĐỀ Phì đại tuyến tiền liệt l|nh tính (PĐTTLLT) là một bệnh lý thƣờng gặp ở nam giới sau tuổi 40 v| thƣờng gây ra các triệu chứng ở đƣờng tiểu dƣới. Với những tiến bộ trong điều trị, đặc biệt là các kỹ thuật điều trị ngoại khoa, bệnh đã đƣợc kiểm soát phần n|o v| thƣờng không dẫn đến tử vong. Tuy nhiên, các triệu chứng của bệnh nhƣ đau buốt, tiểu đêm, khó tiểu gây ra sự phiền toái, khó chịu, làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng cuộc sống của bệnh nh}n, l|m tăng g{nh nặng bệnh tật v| chi phí điều trị ở ngƣời cao tuổi. Hiện nay việc điều trị PĐTTLLT bao gồm điều trị nội khoa v| điều trị ngoại khoa, ngoài ra còn sử dụng các loại thảo dƣợc trong liệu pháp điều trị bổ sung, hỗ trợ. Hai nhóm thuốc đƣợc sử dụng phổ biến trong điều trị PĐTTLLT là thuốc chẹn α-adrenergic receptor (terazosin, alfuzosin) và thuốc ức chế 5α-reductase (finasterid, dutasterid). 5α-reductase, một enzym gắn kết với màng nhân trong tế bào tuyến tiền liệt có hoạt tính xúc tác sự khử testosteron thành dihydrotestosteron l| androgen chính thúc đẩy sự tăng sinh tế bào tuyến tiền liệt phụ thuộc androgen. Do đó, ức chế 5α-reductase là một cơ chế quan trọng trong việc nghiên cứu tìm ra các thuốc mới có tác dụng ngăn sự tiến triển của bệnh cũng nhƣ cải thiện các triệu chứng lâm sàng ở bệnh nhân. Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về enzym 5α-reductase. Hoạt tính in vitro của 5α- reductase trong màng nhân và microsom của tế bào mào tinh hoàn chuột nhắt đƣợc nghiên cứu bởi Monsalve và cộng sự(6). Sau đó Normington và cộng sự đã nghiên cứu sự khác nhau về các chỉ số động học và sự phân bố trên các mô của 2 loại isozym 5α-reductase từ chuột nhắt(7). Pratis và cộng sự nghiên cứu về hoạt tính in vitro của 2 loại isozym chiết từ tinh hoàn chuột(9). Nghiên cứu so sánh hoạt tính của enzyme 5α-reductase từ tuyến tiền liệt và mào tinh hoàn chuột nhắt tại pH trung tính đƣợc thực hiện bởi Span và cộng sự(11). Tại Việt Nam, Trần Thủy Tiên và cộng sự đã sơ bộ tìm đƣợc những điều kiện tối ƣu cho hoạt tính in vitro của 5α-reductase từ mào tinh hoàn chuột(15), nghiên cứu của Tạ Quang Vƣợng và cộng sự sau đó đã x}y dựng đƣợc quy trình định lƣợng và các thông số tối ƣu hóa cho hoạt tính in vitro của enzym chiết từ mào tinh hoàn chuột nhắt(12). Tuy vậy vẫn chƣa có nghiên cứu nào cho thấy hoạt tính in vitro của 5α-reductase có nguồn gốc từ ngƣời, qua đó có đƣợc những thông số v| điều kiện để nghiên cứu về khả năng ức chế enzym này từ các loại thuốc v| dƣợc liệu. Xuất phát từ những đặc điểm trên, nghiên cứu n|y đƣợc tiến hành với những mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể chứa enzym 5α-reductase từ tuyến tiền liệt ngƣời. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 334 - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới hoạt tính in vitro của enzym 5α-reductase. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PH[P NGHIÊN CỨU Mẫu thử nghiệm Mẫu mô tuyến tiền liệt lấy từ các bệnh nhân nam đƣợc chỉ định điều trị phì đại tuyến tiền liệt lành tính bằng phƣơng ph{p cắt đốt nội soi tại bệnh viện Bình Dân, Tp. HCM với đầy đủ hồ sơ bệnh án và sự cho phép của bệnh nhân. Hóa chất và thuốc thử nghiệm D,L-Dithiothreitol, độ tinh khiết ≥ 98% (TLC) của Sigma Aldrich (số lô SLBK4951V), testosteron độ tinh khiết ≥ 99% (HPLC) của Sigma Aldrich (số lô BCBL3419V), β-nicotinamid adenin dinucleotid phosphat tetrasodium dạng khử (NADPH), độ tinh khiết ≥ 95% của Santa Cruz (số lô C0315), finasterid của Santa Cruz (số lô SC-203954). Các hóa chất phụ trợ kh{c đạt tiêu chuẩn thí nghiệm phân tích. Bộ kit định lƣợng testosteron bằng phƣơng ph{p ELISA đƣợc sản xuất bởi DRG, Đức. Trang thiết bị thử nghiệm C}n ph}n tích Satorious, m{y đo pH, máy nghiền đồng thể tế bào kiểu stato/roto ULTRA TURRAXR T25, máy ly tâm lạnh Sigma, Đức, máy quang phổ UV-Vis HITACHI U-1900, máy đo quang microplate reader BIORAD 16591 v| các dụng cụ thí nghiệm khác. Quy trình chiết enzym từ mô tuyến tiền liệt của ngƣời Mô tuyến tiền liệt đƣợc cắt nhỏ, cho vào ống falcon 15 ml có chứa dung dịch bảo quản enzym (sucrose 0,32 M, dithiothreitol (DTT) 1 mM trong đệm phosphat 20 mM, pH 6,5). Đồng nhất hóa mẫu mô với tốc độ 16.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4 ºC (nghiền 20 gi}y, ngƣng 10 gi}y, lặp lại 5 lần). Ly tâm dịch đồng thể ở nhiệt độ -4ºC, lực ly tâm 13.000 g trong 10 phút, bỏ dịch thu cắn. Hòa cắn với lƣợng thể tích dịch bảo quản gấp 3 lần thể tích cắn, sau đó đem hỗn dịch tiếp tục nghiền đồng thể với thời gian, tốc độ và số lần tƣơng tự nhƣ giai đoạn nghiền thứ nhất. Định lƣợng protein trong dịch đồng thể enzym bằng phƣơng ph{p Bradford Dựa vào phản ứng màu của protein với xanh Coomassie, đo độ hấp thu ở 595 nm. Dựa vào đƣờng tuyến tính chuẩn từ albumin bò (BSA), xác định nồng độ protein trong mẫu. Định lƣợng testosteron bằng phƣơng ph{p ELISA Phƣơng ph{p định lƣợng testosteron đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn từ bộ Kit của công ty sản xuất DRG, Đức. Xây dựng đƣờng tuyến tính định lƣợng testosteron ở các nồng độ testosteron chuẩn: 0,25 - 0,5 - 1 - 2 - 6 -16 (ng/ml). Đo độ hấp thu sau phản ứng ở bƣớc sóng 450 nm. Xây dựng đƣờng tuyến tính theo công thức(11,12): Với C: Nồng độ testosteron chuẩn B: Mật độ quang mẫu chuẩn C: Mật độ quang mẫu trắng Chọn lựa điều kiện thực hiện phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron Tiến hành phản ứng khử testosteron thành dihydrotestosteron nhờ vào hoạt tính xúc tác của 5α-reductase. Hoạt tính enzym đƣợc đ{nh giá bằng sự giảm đi của lƣợng cơ chất testosteron sau khi phản ứng xảy ra. Nồng độ testosteron sau phản ứng đƣợc định lƣợng bằng phƣơng ph{p ELISA. Nồng độ cơ chất testosteron trong các mẫu phải nằm trong giới hạn định lƣợng của bộ kit 0-16 ng/ml. Dung dịch bảo quản DTT đóng vai trò l| t{c nh}n chống oxy hóa, đƣợc sử dụng trong phản ứng với nồng độ khoảng 0,9-1 Mm(12). Thực hiện các phản ứng thăm dò hoạt tính enzym phụ thuộc các tác nhân: - pH: thăm dò hoạt tính enzym tại các giá trị pH 2 - 5,5 - 6 - 6,5 - 7 - 8,5 và 12. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 335 - Cofactor NADPH: thăm dò tại các nồng độ 0 mM; 0,15 mM và 0,3 mM. - Dịch đồng thể enzym: tiến hành khảo sát trên lƣợng protein enzym: 0,28 - 0,56 - 0,84 - 1,12 - 1,4 và 1,68 mg/ml - Nhiệt độ phản ứng: thực hiện ủ phản ứng ở nhiệt độ 37ºC. - Thời gian phản ứng: khảo sát phản ứng ở các khoảng thời gian 15 - 30 - 60 - 120 phút. - Các phản ứng đƣợc thực hiện trong eppendolf dung tích 2 ml có nắp đậy. Kết thúc phản ứng bằng cách đƣa pH > 10 bằng NaOH 0,1M nhằm bất hoạt enzym, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút v| sau đó trung hòa bằng HCl 0,1M. Hoạt tính enzym đƣợc tính theo công thức: Khảo sát tác dụng ức chế 5α-reductase in vitro của finasterid Thực hiện quy trình tạo dịch đồng thể enzym nhƣ mô tả ở trên và khảo sát hoạt tính ức chế 5α-reductase trong dịch đồng thể của finasterid với các nồng độ (ng/ml) là: 0; 0,1; 1; 5; 10; 15; 20; 30; 100; 1000. X{c định IC50 của finasterid. KẾT QUẢ Xây dựng đƣờng tuyến tính định lƣợng protein từ albumin huyết thanh bò (BSA) v| đƣờng tuyến tính định lƣợng testosteron Đƣờng tuyến tính của dung dịch BSA chuẩn đƣợc xây dựng ở khoảng nồng độ 1-6 mg/dL và đƣờng tuyến tính testosteron đƣợc xây dựng ở khoảng nồng độ 0,25-16 ng/ml. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo hàm lƣợng protein enzym Thực hiện quy trình tạo dịch đồng thể enzym từ tuyến tiền liệt ngƣời v| định lƣợng h|m lƣợng protein, thu đƣợc dịch đồng thể enzym có nồng độ protein là 2,81 mg/ml. Kết quả khảo sát sự ảnh hƣởng của lƣợng protein enzym lên hoạt tính 5α-reductase ở điều kiện: lƣợng cơ chất testosteron ban đầu: 20,17 ng; pH = 6,5; nồng độ NADPH: 0,3 mM; nồng độ DTT: 1mM; nhiệt độ ủ 37ºC và thời gian phản ứng 60 phút nhƣ trong bảng 1: Kết quả cho thấy lƣợng testosteron giảm khi thực hiện phản ứng, do đó enzym trong dịch đồng thể có hoạt tính xúc tác cho sự chuyển hóa testosteron. Khi tăng lƣợng protein enzym thì hoạt tính enzym cũng tăng theo. Phản ứng với lƣợng protein 1,68 mg cho hoạt tính enzym không tăng hơn so với lƣợng protein 1,4 mg do đó 1,4 mg protein enzym đƣợc chọn cho các phản ứng tiếp theo. Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo nồng độ NADPH NADPH đƣợc khảo sát ở 2 nồng độ 0,15 mM và 0,3 mM với điều kiện phản ứng nhƣ sau: lƣợng testosteron ban đầu: 15,09 ng; pH = 6,5; lƣợng protein enzym: 1,4 mg; nồng độ DTT: 1mM; nhiệt độ ủ 37ºC và thời gian phản ứng 60 phút. Kết quả trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy phản ứng xúc tác của enzym gần nhƣ không xảy ra khi không sử dụng NADPH trong phản ứng. Điều này hoàn toàn phù hợp vì 5α-reductase là một enzym phụ thuộc NADPH. Hoạt tính của enzym giảm không đ{ng kể khi nồng độ NADPH giảm từ 0,3 mM xuống 0,15 mM, do đó NADPH đƣợc sử dụng ở nồng độ 0,15 mM trong các phản ứng tiếp theo. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 336 Biểu đồ 1: Đường tuyến tính của dung dịch BSA (A) và testosteron (B) Bảng 1: Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính 5α-reductase theo lượng protein enzym Mẫu Lượng protein enzym (mg) Lượng testosteron ban đầu (ng) Lượng testosteron sau phản ứng (ng) Hoạt độ enzym (pmol/phút) 1 0,28 20,17 20,04 0,45 2 0,56 19,79 1,32 3 0,84 15,95 14,65 4 1,12 15,47 16,32 5 1,4 9,67 36,46 6 1,68 9,48 37,12 Bảng 2: Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo nồng độ NADPH Mẫu Nồng độ NADPH (mM) Lượng testosteron ban đầu (ng) Lượng testosteron sau phản ứng (ng) Hoạt độ enzym (pmol/phút) 1 0 15,09 15,00 0,31 2 0,15 0,49 50,69 3 0,30 0,38 51,07 Khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo pH Phản ứng đƣợc thực hiện trong khoảng pH = 2-12, với c{c điều kiện: lƣợng testosteron ban đầu: 15,21 ng; lƣợng protein enzym: 1,4 mg; nồng độ NADPH: 0,15 mM, nồng độ DTT: 1mM; nhiệt độ ủ 37 oC và thời gian phản ứng 60 phút, nhằm x{c định pH thể hiện hoạt tính enzym cao. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3. Kết quả cho thấy ở pH = 2 và 12, enzym gần nhƣ không có hoạt tính. Enzym có hoạt tính cao v| thay đổi không nhiều khi pH thay đổi trong khoảng 5,5-8,5. Do vậy có thể dự đo{n đƣợc rằng trong mô tuyến tiền liệt của ngƣời biểu hiện cùng lúc 5α-reductase loại 1 (pH tối ƣu từ 6-8,5) và loại 2 (pH tối ƣu 5,5). Do 5α-reductase loại 2 hiện diện ở c{c cơ quan sinh dục và kết quả từ thí nghiệm này, chọn thông số pH = 5,5 l|m điều kiện cho các phản ứng tiếp theo. Bảng 3: Kết quả khảo sát sự thay đổi hoạt tính enzym theo pH Mẫu pH Lượng testosteron ban đầu (ng) Lượng testosteron sau phản ứng (ng) Hoạt độ enzym (pmol/phút) 1 2 15,71 15,21 1,74 2 5,5 0,3 53,51 3 6 0,59 52,5 4 6,5 0,63 52,36 5 7 0,51 52,78 6 8,5 0,48 52,88 7 12 15,42 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 337 Khảo sát thời gian phản ứng theo lƣợng testosteron bị chuyển hóa Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến lượng testosteron phản ứng Thời gian phản ứng (thời gian ủ) đƣợc khảo sát ở 4 thời điểm: 15 -30 - 60 -120 phút nhằm xác định lƣợng testosteron tham gia phản ứng cao nhất trong c{c điều kiện sau: lƣợng testosteron ban đầu: 16,27 ng; lƣợng protein enzym: 1,4 mg; nồng độ NADPH: 0,15 mM, nồng độ DTT: 1mM; pH = 5,5 và nhiệt độ ủ 37ºC (biểu đồ 2). Kết quả trên cho thấy phản ứng xảy ra với tốc độ nhanh nhất trong 15 phút đầu tiên, tốc độ phản ứng chậm lại từ 15-60 phút. Phản ứng xảy ra với tốc độ rất chậm kể từ 60 phút trở đi v| lƣợng testosteron tham gia phản ứng kể từ 60 phút trở đi hầu nhƣ không thay đổi. Do đó sử dụng thời gian ủ là 60 phút cho các thí nghiệm tiếp theo. Khảo sát tác dụng ức chế 5α-reductase in vitro của finasterid Finasterid đƣợc khảo sát ở 9 nồng độ khác nhau (0,1-1000 ng/ml) trong điều kiện phản ứng: lƣợng testosteron ban đầu: 19,11 ng, pH = 5,5, lƣợng protein enzym: 1,4 mg, nồng độ DTT: 0,9 mM, nồng độ NADPH 0,15 mM, nhiệt độ ủ 37 ºC và thời gian ủ 60 phút. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4 và biểu đồ 3. Bảng 4: Kết quả khảo sát tác dụng ức chế 5α- reductase in vitro của finasterid Mẫu Nồng độ finasterid (ng/ml) Logarit nồng độ finasterid Lượng testosteron ban đầu (ng) Lượng testosteron sau phản ứng (ng) Hoạt độ enzym (pmol/phút) % ức chế enzym 1 1000 3 19,05 18,99 0,21 99,66 2 100 2 17,09 6,81 88,96 3 30 1,477 16,84 7,67 87,57 4 20 1,301 16,7 8,16 86,77 5 15 1,176 16,22 9,83 84,07 6 10 1 14,68 15,17 75,41 7 5 0,699 11,37 26,67 56,77 8 1 0 2,11 58,82 4,67 9 0,1 -1 1,59 60,63 1,73 10 0 -∞ 1,28 61,7 0 Biểu đồ 3: Tương quan hoạt tính-Log nồng độ (A) v| đường tuyến tính (B) của finasterid Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 338 Kết quả cho thấy ở nồng độ 1 ng/ml, finasterid bắt đầu có tác dụng ức chế enzym; ở nồng độ 1000 ng/ml, finasterid ức chế gần nhƣ hoàn toàn hoạt tính enzym, khoảng tuyến tính ƣớc lƣợng đƣợc ở khoảng nồng độ 1-30 ng/ml. Phƣơng trình hồi quy: y = -36,416x + 55,363, với R2 = 0,9587. IC50 ƣớc lƣợng đƣợc của finasterid là 4,05 ng/ml, tƣơng ứng với 10,87 nM. BÀN LUẬN C{c phƣơng ph{p đƣợc sử dụng để định lƣợng protein hiện nay gồm có: Lowry, acid bicinchoninic, biuret, đỏ pyrogallol-molybdat và Bradford. Tuy nhiên c{c phƣơng ph{p Lowry, biuret, acid bicinchoninic bị ảnh hƣởng bởi chất khử và phản ứng màu xảy ra ở môi trƣờng kiềm(4). Trong khi đó, theo quy trình chiết enzym, dung dịch bảo quản có pH acid nhẹ (pH= 6,5) v| phƣơng ph{p Lowry, biuret bị ảnh hƣởng khi có sự hiện diện của chất khử dithiothreitol, vì thế c{c phƣơng ph{p n|y không phù hợp để định lƣợng protein trong điều kiện n|y. Phƣơng ph{p Bradford thực hiện ở môi trƣờng acid, đồng thời làm giảm ảnh hƣởng của muối đệm, chất khử<, có độ nhạy cao 1-2.000 µg/ml(8) nên đƣợc lựa chọn để định lƣợng protein trong điều kiện thí nghiệm. Phƣơng ph{p đồng nhất hóa mô bằng thiết bị nghiền cơ học đƣợc sử dụng trong nghiên cứu là hoàn toàn hợp lý vì mô tuyến tiền liệt là loại mô tuyến, dai và cứng. Theo Bodzon- Kulakowska và cộng sự(2) phƣơng ph{p đồng nhất hoá tế bào sử dụng siêu âm chỉ phù hợp để đồng nhất hoá các mẫu mô mềm nhƣ mô gan, não, m{u< còn đối với các mẫu mô có bản chất dai, cứng thì phƣơng ph{p nghiền đồng thể cơ học là phù hợp hơn cả. Sau khi đồng nhất hóa mẫu mô, dịch đồng thể sẽ đƣợc ly tâm với tốc độ 13.000 x g, bỏ dịch thu cắn. Ở tốc độ này chỉ có ph}n đoạn nhân với tỉ trọng lớn hiện diện ở cắn, ph}n đoạn chứa microsom nằm ở phần dịch. Do đó, hỗn dịch protein thu đƣợc chứa phần lớn 5α- reductase. Theo Liang và cộng sự(5) tốc độ ly tâm thƣờng đƣợc sử dụng để ph}n đoạn enzym 5α- reductase từ tuyến tiền liệt của ngƣời là 600 × g, 10.000 × g và 140.000 × g. Khoảng pH tối ƣu là một trong những đặc điểm để nhận biết loại isoenzym. Isoenzym loại 1 có khoảng pH tối ƣu mở rộng sang vùng trung tính và kiềm trong khi isoenzym loại 2 có khoảng pH tối ƣu hẹp ở vùng acid(1). Theo kết quả của thí nghiệm ở pH 5,5 enzym có hoạt tính cao nhất, do đó ở tuyến tiền liệt của ngƣời, 5α- reductase loại 2 hoạt động chiếm ƣu thế. Kết quả này là phù hợp với các nghiên cứu của Hirosumi và cộng sự khi cho rằng ở khoảng nồng độ testosteron từ 52-108 nM, enzym từ tuyến tiền liệt ngƣời có khoảng pH tối ƣu l| 5-5,5(3). Phản ứng chuyển hóa testosteron xảy ra với tốc độ nhanh nhất trong 15 phút đầu tiên, phản ứng xảy ra với tốc độ rất chậm kể từ sau 60 phút. Khi khảo sát tác dụng ức chế enzym in vitro, khả năng của các chất ức chế đƣợc thể hiện mạnh và rõ ràng nhất trong giai đoạn đầu khi tốc độ phản ứng cao(13). Vì vậy, chúng tôi sử dụng thông số thời gian ủ l| 60 phút, tƣơng tự nhƣ c{c nghiên cứu khác(3,10). Enzym 5α-reductase liên kết với cofactor NADPH tạo thành phức hợp enzym-NADPH, phức hợp này sẽ gắn với cơ chất testosteron chuyển một hydrit (H-) vào vị trí α của C5, dẫn tới sự khử có chọn lọc tại vị trí C5 của testosteron(1). Theo kết quả nghiên cứu, 5α- reductase trong dịch đồng thể chỉ có hoạt tính chuyển hóa testosteron khi có sự tham gia của cofactor NADPH, kết quả này là phù hợp với lý thuyết đƣợc nêu ở trên. Khi tăng nồng độ NADPH, hoạt tính enzym tăng lên nhƣng không nhiều, có nghĩa l| nồng độ NADPH 0,15 mM đủ để tham gia xúc tác phản ứng. Finasterid là chất ức chế chuyên biệt trên isoenzym loại 2(14) và thể hiện t{c động ức chế mạnh 5α-reductase từ dịch đồng thể tuyến tiền liệt ngƣời với IC50 = 10,87 nM. Điều này một lần nữa khẳng định 5α-reductase trong dịch đồng thể thuộc loại 2. Trần Thủy Tiên và Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 339 cộng sự sử dụng finasterid chiết xuất từ viên nén Chibro-Proscar (finasterid) 5mg sản xuất bởi Merck Sharp & Dohme đã x{c định đƣợc khả năng ức chế của finasterid trên enzym chiết từ mào tinh hoàn chuột có IC50 = 34 nM. Tạ Quang Vƣợng và cộng sự x{c định IC50 = 49,2 nM khi nghiên cứu khả năng ức chế của finasterid tinh khiết trên enzym chiết từ mào tinh hoàn chuột nhắt(12,15). So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu đã đƣợc công bố cho thấy rằng, finasterid ức chế 5α-reductase chiết từ tuyến tiền liệt của ngƣời mạnh hơn so với enzym ở mào tinh hoàn chuột nhắt. Điều này có thể do finasterid là một chất ức chế 5α-reductase chọn lọc hơn ở ngƣời bị phì đại tuyến tiền liệt so với chuột. KẾT LUẬN Quy trình tạo dịch đồng thể từ mô tuyến tiền liệt ngƣời là nguồn cung cấp 5α-reductase để có thể ứng dụng trong các thí nghiệm sàng lọc thuốc có t{c động ức chế enzym này. Phản ứng chuyển testosteron thành dihydrotestosteron nhờ xúc tác của 5α-reductase trong dịch đồng thể tuyến tiền liệt ngƣời diễn tiến tốt ở pH = 5,5, lƣợng protein enzym tối thiểu 1,4 mg, nồng độ testosteron khoảng 16 ng/ml (55 nM), nồng độ NADPH: 0,15 mM, nhiệt độ ủ: 37 oC và thời gian ủ: 60 phút. Finasterid ức chế mạnh 5α-reductase chiết từ tuyến tiền liệt ngƣời với IC50 = 10,87 nM, có thể sử dụng nhƣ một thuốc đối chứng dƣơng trong các thí nghiệm sàng lọc thuốc. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andersson S, Russell DW (1990), "Structural and biochemical properties of cloned and expressed human and rat steroid 5 alpha-reductases", Proceedings of the National Academy of Sciences, 87 (10), pp. 3640-3644. 2. Bodzon-Kulakowska A, Bierczynska-Krzysik A, Dylag T, Drabik A, Suder P, Noga M, Jarzebinska J, Silberring J (2007), "Methods for samples preparation in proteomic research", Journal of Chromatography B, 849 (1), pp. 1-31. 3. Hirosumi J, Nakayama O, Fagan T, Sawada K, Chida N, Inami M, Takahashi S, Kojo H, Notsu Y, Okuhara M (1995), "FK143, a novel nonsteroidal inhibitor of steroid 5α- reductase:(1) In vitro effects on human and animal prostatic enzymes", The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 52 (4), pp. 357-363. 4. Krohn Randall I (2011), "The colorimetric detection and quantitation of total protein", Current Protocols in Cell Biology, pp. A. 3H. 1-A. 3H. 28. 5. Liang T, Cascieri MA (1985), "Species differences in prostatic steroid 5 α-reductases of rat, dog, and human", Endocrinology, 117 (2), pp. 571-579. 6. Monsalve A, Blaquier JA (1977), "Partial characterization of epididymal 5α reductase in the rat", Steroids, 30 (1), pp. 41-51. 7. Normington K, Russell David W (1992), "Tissue distribution and kinetic characteristics of rat steroid 5 alpha-reductase isozymes. Evidence for distinct physiological functions", Journal of Biological Chemistry, 267 (27), pp. 19548-19554. 8. Orsonneau JL, Douet P, Massoubre C, Lustenberger P, Bernard S (1989), "An improved pyrogallol red-molybdate method for determining total urinary protein", Clinical chemistry, 35 (11), pp. 2233-2236. 9. Pratis K, O'Donnell L, Ooi GT, McLachlan RI, Robertson DM (2000), "Enzyme assay for 5α-reductase type 2 activity in the presence of 5α-reductase type 1 activity in rat testis", The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 75 (1), pp. 75-82. 10. Rhodes L, Primka RL, Berman C, Vergult G, Gabriel M, Pierre- Malice M, Gibelin B (1993), “Comparison of (Proscar®), a 5α reductase inhibitor, and various commercial plant extracts in in vitro and in vivo 5α reductase inhibition", The Prostate, 22 (1), pp. 43-51. 11. Span PN, Benraad Th J, Sweep CGJ, Smals AGH (1996), "Kinetic analysis of rat steroid 5α-reductase activity in prostate and epididymis homogenates at neutral pH: evidence for type I activity in epididymis", The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 57 (1), pp. 95-101. 12. Tạ Quang Vƣợng, Bùi Hồng Ngọc Vân Anh, Trần Thanh Nhãn, Trần Mạnh Hùng, (2017) Khảo sát quy trình phân lập dịch đồng thể chứa enzyme 5α-reductase từ mào tinh hoàn chuột nhắt. Tạp chí Y Học Tp. HCM, 1(21), pp. 253-259. 13. Thomsen WJ (2001), "Bioassay techniques for drug development". 14. Tian G, Stuart JD, Moss ML, Domanico PL (1994), "17. beta.-(N- tert-Butylcarbamoyl)-4-aza-5. alpha.-androstan-1-en-3-one Is an Active Site-Directed Slow Time-Dependent Inhibitor of Human Steroid 5. alpha.-Reductase 1", Biochemistry, 33 (8), pp. 2291-2296. 15. Trần Thuỷ Tiên, Đỗ Lê Đức Thuận, Trần Mạnh Hùng (2015) Mô phỏng mô hình thử t{c động ức chế 5α-reductase in vitro và ứng dụng thử t{c động của kim tiền thảo Desmodium styracifolium. Y Học Tp HCM, 19 (3), pp. 601-605 Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018