Xây dựng qui trình định lượng Carotenoid trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 182 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAROTENOID TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG Võ Xuân Hoài*, Phan Thanh Dũng*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm giàu carotenoid đang lưu hành như: carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), tảo và gần đây là từ vi khuẩn, tuy nhiên trong nước chưa có quy trình định lượng cụ thể cho các chế phẩm này. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu quy trình chiết tách carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng phương pháp HPLC với hệ thống Knauer Smarline 2500 system. Kết quả và bàn luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy, phá vỡ tế bào bằng tán trong bể siêu âm và chiết carotenoid với chloroform - methanol (2:1) cho hiệu quả chiết tách carotenoid từ vi khuẩn cao nhất (94,82%). Hàm lượng carotenoid từ vi khuẩn và các chế phẩm được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ nhạy cao, trên cột RP C18 ở nhiệt độ phòng, hệ dung môi pha động là acetonitril- methanol - dichloromethal (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với tốc độ dòng 1ml /phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát hiện tại 450 nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2%. Phương pháp được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của carotenoid từ chế phẩm đạt 99,83%. Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công trình định lượng bằng kỹ thuật HPLC để kiểm tra hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường. Qui trình được thẩm định và áp dụng thành công trên một số sinh khối vi khuẩn giàu carotenoid và chế phẩm chứa carotenoid trong nước và ngoại nhập. Từ khóa: HPLC, carotenoid, betacaroten, thực phẩm chức năng, ABSTRACT ESTABLISHMENT OF A METHOD FOR CAROTENOIDS QUANTIFICATION IN SOME COMMERCIAL PRODUCTS USING HPLC METHOD Vo Xuan Hoai, Phan Thanh Dung, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 182 - 187 Introduction: Nowadays, there are many rich carotenoid products on the market. Carotenoids in these products come from plants: carrot, gac fruit (Momordica cochinchinensis), tomato, seaweed and recently from bacteria. Although they are popularly used but the suitable quantity method is not yet available for these products in Vietnam. Materials and methods: In this work, we studied methods for extraction of carotenoid from bacteria and developed the carotenoid quantitative method for products containing carotenoid based on HPLC with Knauer Smarline 2500 system. Results and disscussions: The result show that, cells breaking process by using ultrasonic bath and extract carotenoid with chloroform/methanol (2:1) are the most effective with performance about 94,82%. The content of carotenoids from bacteria and other products were determined by HPLC method, that is rapid and high sensitivity with RP C18, at room temperature. The mobile phase is acetonitrile – methanol - dichloromethal (70:20:10, v/v/v) * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS. Phan Thanh Dũng ĐT: 0983957158 Email: dungpharm@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 183 supplemented with ammonium acetate 10 mM, with flow 1ml/minute, inject volume 20 μl, UV detector at 450 nm. The HPLC method is highly suitable with RSD of chromatography parameters were less than 2%. The method was validated for the acceptable accuracy and precision with the recovery rate is 99.83%. Conclusion: We have succesfully established an HPLC protocol for qualification of carotenoid in commercial products. The protocol has been validated and applied to determining the carotenoid contents of several different bacterial biomasses and some domestic and imported products. Keywords: HPLC, carotenoid. Betacarotene, functional food ĐẶT VẤN ĐỀ Carotenoid là nhóm sắc tố terpenoid phổ biến trong tự nhiên, nhất là trong các sinh vật sống được dưới ánh nắng mặt trời bao gồm thực vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm(3). Kể từ khi được phát hiện cho đến nay, carotenoid được ứng dụng rộng rãi để làm phụ gia tạo màu cho thực phẩm, bổ sung những chất dinh dưỡng, giúp gia tăng giá trị thẩm mỹ cho cho ngành thủy sản (7). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dịch tễ học và kết quả thực nghiệm đã chứng minh các carotenoid với vai trò là chất chống oxi hóa đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người bằng cách ngăn ngừa hay trì hoãn các bệnh mạn tính như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể và một số bệnh khác. Do đó, carotenoid cũng đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm(1). Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm giàu carotenoid được lưu hành như: carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), carotenoid từ tảo, carotenoid từ vi khuẩn (3)tuy nhiên hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm này thường chỉ ghi chung chung, không được xác định chính xác và không thể xác định hoạt tính của các chế phẩm này. Do đó vấn đề đặt ra là phải xây dựng một quy trình chiết tách và xác định hàm lượng carotenoid trong chế phẩm cũng như xác định các loại carotenoid có trong chế phẩm để xác định hoạt tính của chế phẩm. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng qui trình định lượng carotenoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Bột sinh khối vi khuẩn Bacillus marisflavi DD1.1, Bacillus indicus HU36, Bacillus infantis AT14, độ ẩm 5%, mật độ tế bào 1010 CFU/g sinh khối, được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y Dược TP HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng Q1. Các chế phẩm chứa carotenoid trên thị trường: Dầu gấc Vinaga (Số lô 4306, hạn sử dụng 6/2013), dầu gấc Gấc Việt Nam (Số lô 4609, hạn sử dụng 6/2013), Super Antioxidant của Holland & Barrett (Số lô 375324, hạn sử dụng 1/2015), Mỹ, Beta-Carotene của Holland & Barrett (Số lô 375221, hạn sử dụng 1/2015), Mỹ, Tảo Spiruline của Teva S. Switzerland (Số lô 4609, hạn sử dụng 9/2013). Khảo sát phương pháp phá vỡ màng tế bào vi khuẩn Chúng tôi tiến hành khảo sát các phương pháp phá vỡ màng tế báo vi khuẩn như nghiền trong nitơ lỏng, tán siêu âm đầu dò, dùng bể siêu âm và sử dụng lysozym với lượng sinh khối khảo sát là 200 mg. dung môi chiết là cloroform và methanol với tỷ lệ 1:2 (3,4,5). Khảo sát dung môi chiết carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn Bảng 1: Tỉ lệ các dung môi chiết Dung môi Cloroform Methanol Tỉ lệ Thể tích (ml) 2,5 2,5 1:1 1,67 3,33 1:2 3,33 1,67 2:1 1,25 3,75 1:3 3,75 1,25 3:1 Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ dung môi chiết carotenoid với nhiều tỉ lệ khác nhau, dựa trên hai dung môi chính là methanol và cloroform, nhằm tìm ra tỉ lệ dung môi chiết tối ưu nhất. Chiết tách carotenoid theo quy trình đã Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 184 khảo sát ở trên với tỉ lệ hệ dung môi bổ sung được thay đổi như Bảng 1. Phương pháp chiết carotenoid từ chế phẩm Đối với các chế phẩm có chứa carotenoid (carotenoid được chiết ở dạng bột hoặc dầu) chiết theo quy trình sau: cân 1/3 lượng dầu (bột) trong 1 viên chế phẩm vào ống Falcon 50 ml. Thêm vào 10 ml NaOH 1 N pha trong methanol, lắc rung mạnh trong 1 phút. Thêm 10 ml aceton, lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Thêm 10 ml n-hexan, lắc rung cho đều. Thêm 10 ml nước khử khoáng, lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 9600 vòng /10 phút ở 4oC. Thu lớp n-hexan. Lớp n-hexan sau đó loại nước bằng Na2SO4. Dịch chiết với n-hexan được bay hơi đến cắn. Hòa lại cắn vào 1 ml cloroform và 4 ml dung môi pha động(2,1). Xây dựng quy trình định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC và thẩm định quy trình định lượng Chúng tôi tiến hành thăm dò hệ dung môi pha động để tách tốt nhất các loại carotenoid có trong dịch chiết. Dựa vào tính chất carotenoid là chất kém phân cực nên chọn hệ dung môi pha động kém phân cực. Các hệ dung môi pha động khảo sát gồm có: acetonitril-methanol, acetonitril-methanol-dicloromethan là các hệ dung môi thường sử dụng để phân tích carotenoid với đầu dò UV, bước sóng phát hiện 450 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút trên hệ thống Knauer Smarline 2500 system. Các mẫu chuẩn được chọn gồm các loại carotenoid thông dụng thuộc 2 nhóm xanthophyl và carotenoid: astaxanthin, canthaxanthin, lutein, lycopen và β- caroten để tiến hành quá trình thăm dò hệ dung môi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5). Sau khi xây dựng quy trình định lượng chúng tôi tiến hành hẩm định quy trình định lượng và ứng dụng qui trình đã thẩm định để định lượng trên một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường(1-Error! Reference source not found.). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát các phương pháp chiết, tách carotenoid Qua kết quả thực nghiệm nhận thấy, phương pháp phá vỡ màng tế bào trong bể siêu âm và chiết bằng hỗn hợp cloroform - methanol tỉ lệ 2:1 cho hiệu quả cao nhất với tỷ lệ hồi phục 94,82%. Xây dựng quy trình định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC Dựa vào tính chất phân cực của carotenoid (nhóm caroten không phân cực và nhóm xanthophyl phân cực) để thăm dò hệ dung môi phân tích bằng phương pháp HPLC. Tiến hành thăm dò hệ dung môi pha động gồm acetonitril - methanol, acetonitril – methanol - dicloromethan với các tỉ lệ khác nhau để tách tốt nhất hỗn hợp 5 chất chuẩn gồm: astaxanthin, canthaxanthin, zeaxanthin, lycopen và β- caroten. Kết quả khảo sát cho thấy hệ dung môi phân tích carotenoid tốt nhất là acetonitril – methanol - dicloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích là 12 phút (Hình 1-G). Dung môi pha động isocratic bổ sung amonium acetat 10 mM với A. ACN -MeOH (50:50,tt/tt), B. ACN -MeOH (60:40,tt.tt), C. ACN -MeOH (70:30,tt/tt), D. ACN - MeOH (80:20,tt/tt), E. ACN - MeOH (90:10,tt/tt), F. ACN –MeOH - DCM (70:25:5, tt/tt/tt), G. ACN –MeOH -DCM (70:20:10, tt/tt/tt), H. ACN –MeOH -DCM (70:15:15, tt/tt/tt). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 185 L y co p en β -c ar o te n L y co p en β -c ar o te n A st ax an th in C an th ax an th in Z ea x an th in L y co p en β -c ar o te n A st ax an th in C an th ax an th in Z ea x an th in L y co p en β -c ar o te n A st ax an th in C an th ax an th in Z ea x an th in L y co p en β -c ar o te n A st ax an th in C an th a x an th in Z ea x an th in L y co p en Β -c ar o te n A st a x an th in C an th ax an th in Z ea x an th in L y co p en Β -c ar o te n A st a x an th in C an th ax an th in Z ea x an th in L y co p en Β -c a ro te n A B D F H G E C Hình 1: Thăm dò hệ dung môi Thẩm định quy trình phân tích Tính phù hợp hệ thống Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6) Loại carotenoid n=6 Rt S (N) As Rs Astaxanthin RSD % 0,193 1,973 0,355 1,808 1,726 Canthaxanthin 0,196 1,273 0,852 1,908 1,913 Zeaxanthin 0,318 1,996 1,188 1,989 1,163 Lycopen 0,230 1,786 1,881 1,954 1,779 β-caroten 0,193 1,839 4,276 1,914 1,910 Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc ký chọn lựa là phù hợp cho việc phân tích định lượng carotenoid với RSD của thời gian lưu, diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết của cột sắc ký đều nằm trong giới hạn RSD ≤ 2%. Các thông số như hệ số đối xứng nằm trong giới hạn từ 0,8≤ As ≤1,5 và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5. Như vậy phương pháp phân tích carotenoid đạt được tính phù hợp hệ thống. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 186 A b so rb an ce ( m A U ) Time (min) A st ax an th in C an th ax an th in Z ea x an th in L y co p en Β -c ar o te n Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống Điều kiện HPLC: Pha động acetonitril:Methanol:dicloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM, cột RP- C18 (250 mm, 5 µm), phát hiện UV 450 nm, ở nhiệt độ phòng. Bảng 3: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng Carotenoid Canthaxanthin β-caroten Độ chính xác (n=6) RSD% = 4,26 RSD% = 1,93 Độ đúng (Tỉ lệ hồi phục, n=9) 98,53% 99,83% Khoảng tuyến tính Ŷ = 363,86 x – 55,953 R2 = 0,9953 Ŷ = 240,5 x + 37,616 R2 = 0,9981 Giới hạn định lượng 0,026 µg/ml 0,049 µg/ml Qui trình định lượng carotenoid đã thẩm định Phá vỡ màng tế bào bằng tán trong bể siêu âm. Chiết carotenoid với hệ dung môi chloroform - methanol với tỉ lệ 2:1. Tiến hành phân tích HPLC với hệ thống Knauer theo các điều kiện: Dung môi pha động: acetonitril – methanol - dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM. Cột sắc ký: Europher RP C18 (250 mm, 4,6 mm, 5 µm). phát hiện UV 450 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. nhiệt độ phòng, Thể tích bơm mẫu: 20 µl. Ứng dụng quy trình định lượng trên chế phẩm Bảng 4: Kiểm tra hàm lượng carotenoid của sinh khối vi khuẩn Chủng vi khuẩn RT (phút) Nhóm carotenoid Hàm lượng carotenoid trung bình (µg/g) RSD Bacillus indicus 4,133 Chưa xác định 48,32 ± 0,14 2,92 4,833 Chưa xác định Bacillus infantis 3,833 Astaxanthin 78,23 ± 0,18 1,34 Bacillus marisflavi 2,631 Chưa xác định 40,36 ± 0,21 4,14 4,582 Canthaxanthin Bảng 5: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong dầu gấc Sản phẩm Hàm lượng β- caroten Trên nhãn (mg %) Hàm lượng β- caroten định lượng (mg%) RSD Gac Việt Nam 100 42,08 ± 0,52 1,24 Dầu gấc PV Không ghi trên nhãn 10,16 ± 0,13 1,30 Vinaga 150 126,34 ± 2,46 1,94 Bảng 6: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm ngoại nhập Sản phẩm Nhóm carotenoid Hàm lượng trên nhãn (mg/viên) Hàm lượng định lượng (mg/viên) RSD % hàm lượng Betacarotene β-caroten 15 14,58 ± 0,22 1,48 97,23 Super Antioxidant β-caroten 15 14,70 ± 0,31 2,13 98,01 Beta- carotene β-caroten 15 14,52 ± 0,25 1,89 95,30 Lycopene Lycopen 10 9,53 ± 0,18 1,75 96,79 Tảo Spiruline Zeaxanthin 2 1,89 ± 0,04 1,98 94,63 β-caroten 2,4 2,29 ± 0,4 1,44 95,42 Tổng carotenoid 8 7,63 ± 0,09 1,12 95,33 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 187 KẾT LUẬN Carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn được chiết tách bằng phương pháp tán siêu âm đầu dò có hiệu quả tốt nhất trong việc phá vỡ màng tế bào với hệ dung môi thích hợp là chloroform-methanol (2:1, tt/tt), hiệu suất chiết đạt khoảng 95%. Carotenoid được định lượng bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với hệ dung môi phân tích là acetonitril- methanol- dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích là 12 phút. Qui trình đã được thẩm định đáp ứng các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ lập lại của một phương pháp phân tích dựa trên HPLC. Áp dụng qui trình đã thẩm định xác định hàm lượng carotenoid của một số nguyên liệu vi khuẩn của phòng thí nghiệm và chế phẩm chứa carotenoid đang lưu hành: trong đó các sản phẩm carotenoid trong nước chưa đạt hàm lượng carotenoid ghi trên nhãn, các chế phẩm ngoại nhập có hàm lượng carotenoid đạt thông số ghi trên nhãn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Asean guideline for for validation of analytical procedures. 2008. p. 1-17. 2. Barua AB. (2001) Improved normal-phase and reversed-phase gradient high-performance liquid chromatography procedures for the analysis of retinoids and carotenoids in human serum, plant and animal tissues. J Chromatogr A,. 936(1-2):71-82. 3. Bùi Minh Giao Long, Vũ Thanh Thảo and Trần Cát Đông. (2010) Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh carotenoid từ biển và các hô tôm ở Việt Nam. Y học TP. Hồ Chí Minh, 2010,14 (1):1-5. Duc Le H, Fraser PD, Tam NK, et al. (2006) Carotenoids present in halotolerant Bacillus spore formers. FEMS Microbiol Lett, 255(2):215-24. 4. Johnson EA and Schroeder WA. (1996) Microbial carotenoids. Adv Biochem Eng Biotechnol, 1996. 53:119-78. 5. Khaneja R., Perez-Fons L, Fakhry S, et al. (2010) Carotenoids found in Bacillus. Journal of Applied Microbiology, 2010. 108(6):1889-1902.(9) 6. Lowe, G. M., R. F. Bilton, I. G. Davies, et al. (1999) Carotenoid composition and antioxidant potential in subfractions of human low-density lipoprotein. Ann Clin Biochem, 1999. 36:323-32. 7. Trần Hùng. (2006) Chuyên đề: Các chất chống oxi hóa trong tự nhiên. Nxb Đại học Y Dược Tp. HCM. 8. Võ Thị Ngọc Mỹ. (2010) Nghiên cứu quy trình thu nhận và định lượng carotenoid từ một số chủng Bacillus sp. 2010, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.03.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014