Xây dựng qui trình Evagreen real‐time PCR phát hiện các gen Blaoxa ở Acinetobacter Baumannii

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 197 XÂY DỰNG QUI TRÌNH EVAGREEN REAL‐TIME PCR   PHÁT HIỆN CÁC GEN blaOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII  Nguyễn Tuấn Anh*, Huỳnh Minh Tuấn**, Nguyễn Văn Vĩnh Châu***, Hồ Huỳnh Thùy Dương*,****  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu vì tính  đa kháng thuốc của chúng. Đặc biệt, A. baumannii sở hữu gene  blaOXA có khả năng tạo carbapenemase, giúp  chúng kháng carbapenem.   Mục đích: Nghiên cứu nhằm xây dựng qui trình real‐time PCR phát hiện các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 ở A.  baumannii.  Phương pháp: Qui trình được xây dựng từ khâu thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu của các mồi, xác định  thành phần và chương trình real‐time PCR tối ưu cho phản ứng nhân bản các gene blaOXA‐23/‐51/‐58.  Kết quả: Kết quả cho thấy qui trình có khả năng phát hiện chính xác các gene blaOXA‐23/‐51/‐58 đặc trưng  của A. baumannii với độ nhạy (1,42x100‐1,42x101 bản sao/μl) và độ đặc hiệu cao.   Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình EvaGreen real‐time PCR phát hiện các nhóm gene  blaOXA‐23/‐51/‐58 ở A. baumannii. Qui trình có thể được sử dụng để phát hiện nhanh các chủng A. baumannii  mang các gene này và tiềm năng trở thành công cụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện các gene  blaOXA ở A. baumannii trong môi trường bệnh viện.  Từ khóa: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen  ABSTRACT  DEVELOPMENT OF AN EVAGREEN REAL‐TIME PCR PROTOCOL   FOR THE DETECTION OF SEVERAL blaOXA GENES IN ACINETOBACTER BAUMANNII  Nguyen Tuan Anh, Huynh Minh Tuan, Nguyen Van Vinh Chau, Ho Huynh Thuy Duong  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 197 ‐ 201  Backgrounds:  Acinetobacter  baumannii  currently  is  the  most  leading  and  dangerous  factor  causing  nosocomial infections for their multidrug resistant traits. Aspecially, A. baumannii harbours blaOXA genes with  ability of producing carbapenemase, helping them resist to carbapenem, the so‐called present strongest antibiotic,  commonly used in multidrug resistant bacterial infections.  Objectives: To set up and optimize an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23, ‐51,  ‐58 genes in A. baumannii   Methods: The process was constructed through basic steps: specific primer design and experimental check,  optimization of real‐time PCR components and temperature program using the intercalating dye, EvaGreen, and  finally evaluating the specificity and sensitivity of the system.  Results: The  results  showed  that  the protocol  could  be used  to detect  correctly  blaOXA‐23/‐51/‐58 genes  specific to A. baumannii with high specificity and sensitivity.  Conclusions: We built up successfully an EvaGreen real‐time PCR protocol for the detection of blaOXA‐23/‐ 51/‐58  genes  in  A.  baumannii.  The  protocol  can  also  be  used  to  identify  rapidly  strains  of  A.  baumannii  possessing  these  genes  and  potentially  becomes  a  tool  to  study  blaOXA‐owning  A.  baumannii  infection  * Công ty TNHH CNSH Khoa Thương       ** Khoa Kiểm soát Nhiễm khuẩn, BV ĐH Y Dược Tp.HCM  *** Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Tp.HCM.  **** Bộ môn Di truyền, Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Tuấn Anh  , ĐT: 091 7 429 336  , Email: ntanhbio@gmail.com  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 198 epidemiology in different hospitals or geographical areas.  Keywords: A. baumannii, β‐lactamase, carbapenemase, OXA, real‐time PCR, EvaGreen  ĐẶT VẤN ĐỀ  Acinetobacter baumannii (A. baumannii), trực  khuẩn Gram  (‐) không  lên men glucose, đang  trở  thành  tác  nhân  nhiễm  trùng  bệnh  viện  nguy hiểm nhất,  đặc biệt  ở những bệnh viện  đông bệnh nhân(2,1). Vì sự xuất hiện và gia tăng  những  chủng  A.  baumannii  đa  kháng  thuốc,  carbapenem  được  lựa  chọn  để  điều  trị  khi  nhiễm  những  chủng  này.  Carbapenem,  điển  hình là imipenem và meropenem, có phổ hoạt  tính rất rộng, kháng lại vi sinh vật Gram (+) và  Gram  (‐), bao gồm  cả vi khuẩn yếm khí. Đặc  biệt, carbapenem là lựa chọn để điều trị những  trường  hợp  nhiễm  khuẩn  nặng,  có  biểu  hiện  kháng β‐lactamase phổ rộng (ESBL) và AmpC  β‐lactamase(4,9).   Carbapenem  thuộc  nhóm  kháng  sinh  β‐ lactam,  bao  gồm  penicillin,  cephalosporin  và  carbapenem,  là  nhóm  kháng  sinh  quan  trọng,  được sử dụng để điều trị nhiễm trùng gây ra bởi  nhiều loại vi khuẩn, trong đó có A. baumannii, vì  tính hiệu quả và an toàn; ngoài ra hoạt tính của  nhóm  kháng  sinh  này  dễ  dàng  được  tăng  lên  nhờ những cải biến  trong  cấu  trúc phân  tử(10,9).  Nhóm kháng sinh này hoạt động kìm hãm sinh  trưởng và phân chia tế bào vi khuẩn bằng cách  bất hoạt peptidoglycan transpeptidase(1), enzyme  có  vai  trò  quan  trọng  trong  hình  thành mạng  lưới peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn. Sự  bất hoạt enzyme này dẫn đến làm chết tế bào vi  khuẩn.  Tuy  nhiên,  enzyme  β‐lactamase  là  enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn, với hoạt tính  phân hủy kháng sinh β‐lactam, có vai trò bảo vệ  vi  khuẩn  khỏi  kháng  sinh  và  cũng  là  nguyên  nhân  chính dẫn  đến  tính  kháng  đối  với nhóm  kháng sinh này.   Enzyme  β‐lactamase  được phân  chia  thành  bốn nhóm phân tử riêng biệt, gồm lớp A, B, C và  D, dựa  trên  tính  tương đồng về  trình  tự amino  acid. Oxacillinase (OXA) là β‐lactamase lớp D, có  đặc  tính  thủy  phân  oxacillin  nhanh  hơn  hơn  penicillin hoặc benzylpenicillin(3). Điều đặc biệt,  một  số  enzyme  trong  nhóm  này  có  hoạt  tính  thủy phân carbapenem(10). Các enzyme OXA có  khả  năng  thủy  phân  carbapenem  được  chia  thành 8 nhóm phụ, trong đó có 4 nhóm đã được  phát  hiện  ở  A.  baumaniii  là  OXA‐23(9),  OXA‐ 24(2), OXA‐51(11), OXA‐58(13).   Dịch  tễ  phân  tử  cho  thấy  các  nhóm  gen  blaOXA hiện diện trên khắp thế giới(7). Chủng A.  baumannii mang nhóm gene blaOXA‐23 phổ biến  ở  United  Kingdom,  Brazil,  Argentina,  China,  Korea,  Singapore,  Vietnam,  USA,  Libya,  Pakistan, Australia và Columbia(7,15). Các  chủng  A.  baumannii  với  nhóm  gene  blaOXA‐58  được  phát hiện đầu  tiên ở Pháp và hiện nay đã xuất  hiện  ở  Argentina,  Colombia,  Bolivia,  Chile,  Venezuela,  Spain,  Turkey,  Romania,  United  Kingdom,  Italy, Poland, Switzerland, Germany,  Ireland,  Portugal,  Hungary,  Bulgaria,  Greece,  USA, Oceania và Asia(7,12). Nhóm gene blaOXA‐24  ban đầu là nhóm ít phổ biến hơn các nhóm còn  lại,  nhưng  hiện  đã  xuất hiện  ở Brazil, Taiwan,  France,  Croatia,  Chile,  Spain,  Belgium,  Czech  Republic,  USA  và  Iran(17).  Một  số  chủng  A.  baumannii kháng với carbepenem với vai trò chủ  yếu  là  của  nhóm  gene  blaOXA‐51. Nhóm  gene  này được cho là tồn tại tự nhiên gần như ở tất cả  các chủng A. baumannii(2,16).   Carbapenemase  phổ  biến  nhất  ở  A.  baumannii  là  β‐lactamase mã  hóa  bởi  blaOXA(17).  Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình phát  hiện  các  gene  blaOXA‐23,  ‐51,  ‐58  phục  vụ  cho  mục đích nghiên cứu dịch tễ học phân tử và cơ  chế biểu hiện của những gene này. Từ đó, có cơ  sở để xác định những chủng nguy hiểm, nguy cơ  cao gây nhiễm trùng bệnh viện.  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Vật liệu  Vi khuẩn A. baumannii chuẩn (ATCC 19606)  mang  gene  OXA‐51  và  các  mẫu  vi  khuẩn  A.  baumannii  được  phân  lập  từ  bệnh  phẩm  của  bệnh nhân điều trị ở bệnh viện Đại học Y Dược  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 199 TP.  Hồ  Chí  Minh  trong  thời  gian  từ  tháng  01/2012 đến tháng 12/2013.  Thiết kế mồi  Các cặp mồi  đặc hiệu cho  từng nhóm gene  blaOXA‐23, ‐51, ‐58 và một cặp mồi đặc hiệu cho  gene  16S  rRNA  của A. baumannii  (Bảng  1)  làm  đối chứng nội phản ứng được  thiết kế và đánh  giá  bằng một  số  phần mềm  sinh  học  phân  tử  chuyên dụng như PrimerQuest, Oligo Analyzer,  Annhyb,  và  Blast  (NCBI). Mồi  được  đặt  tổng  hợp  tại  công  ty  IDT  (Integrated  DNA  Technologies, USA).  Bảng 1. Trình tự các mồi được thiết kế  Mồi Trình tự mồi (5’ 3’) Kích thước (bp) Tmmồi (oC) Sản phẩm (bp) Tmsản phẩm (oC) OXA23-F CACTAGGAGAAGCCATGAAGC 21 54.9 114 72.7 OXA23-R CAGCATTACCGAAACCAATACG 22 54.8 OXA51-F GAAGTGAAGCGTGTTGGTTATG 22 54.4 148 71.7 OXA51-R GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT 20 54.3 OXA58-F ATATTTAAGTGGGATGGAAAGCC 23 53.4 110 70.5 OXA58-R CGTGCCAATTCTTGATATACAGG 23 54.6 IC-F CCAGTGACAAACTGGAGGAAG 21 55.5 199 70.0 IC-R GCTGTGTAGCAACCCTTTGTA 21 55.2 Phương  pháp  tách  chiết  DNA  của  A.  baumannii  Khuẩn lạc đặc trưng của A. baumannii được  thu nhận và  tăng sinh  trong môi  trường LB ở  điều  kiện  370C  trong  24  giờ.  Sau  khi  kết  thúc  tăng sinh, DNA bộ gene của A. baumannii được  tách  chiết  theo nguyên  tắc hấp phụ  đặc hiệu  lên pha rắn (màng silica) bằng bộ kit tách chiết  “DNA  column‐based  extraction  kit”  (Khoa  Thương). Tất  cả mọi  thao  tác  đều  được  thực  hiện  theo  đúng  hướng  dẫn  trong  bộ  kit  của  nhà sản xuất.  Thành phần phản ứng EvaGreen real‐time  PCR  Hỗn hợp phản ứng EvaGreen real‐time PCR  có  thành  phần  gồm  1X  AptaTaq  Fast  DNA  polymerase  (Roche), 200 nM  cho  từng  cặp mồi  xuôi  và  ngược  (IDT)  OXA23‐F/R,  OXA51‐F/R,  OXA58‐F/R hoặc IC‐F/R, 1X EvaGreen (Biotium),  5μl DNA  trong  tổng  thể  tích  là 25μl. Chu  trình  nhiệt cho phản ứng EvaGreen real‐time PCR: 40  chu  kỳ  gồm  15  giây  ‐  95oC  và  15  giây  ‐  60oC.  Chương trình phân tích nhiệt độ nóng chảy của  sản phẩm tương ứng với quá trình tăng nhiệt độ  từ  65oC  lên  95oC, mỗi  bước  tăng  0,5oC  và  lưu  trong 20 giây.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Hiệu quả nhân bản của mồi  Chúng  tôi kiểm  tra hiệu quả nhân bản  của  từng cặp mồi thiết kế bằng phản ứng EvaGreen  real‐time  PCR  trên mẫu DNA  tách  chiết  từ  vi  khuẩn A. baumannii sau  tăng  sinh. Các mẫu  vi  khuẩn này  đã  được  xác  định  sở hữu  các  gene  blaOXA tương ứng bằng phương pháp giải trình  tự gene.  OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R  Hình 1. Hiệu quả nhân bản của mồi  Kết quả (Hình 1) cho thấy chỉ một đỉnh chảy  đặc  trưng  tương  ứng  với mỗi  cặp mồi,  không  hiện diện các đỉnh chảy (sản phẩm) ký sinh. Như  vậy, bộ mồi  thiết kế hoạt  động nhân bản hiệu  quả  trong phản  ứng PCR. Nhiệt  độ nóng  chảy  (Tm)  của  các  sản phẩm nhân bản  trình  tự gen  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 200 OXA23  (114 bp), OXA51  (148 bp), OXA58  (110  bp) và IC  (199 bp)  tương ứng được xác định  là  80,0oC; 78,5oC; 78,5oC và 84,0oC. Như vậy, căn cứ  vào nhiệt  độ nóng  chảy  đặc  trưng  có  thể nhận  diện  được các  sản phẩm nhân bản của các cặp  mồi tương ứng.   Tính đặc hiệu của mồi  Tính đặc hiệu của các cặp mồi được kiểm  tra với DNA đặc trưng của A. baumannii và của  các  vi  khuẩn  khác  như  E.  coli  (ATCC  25922,  35218,  35401),  Pseudomonas  aeruginosa  (ATCC  27853),  Klebsiella  pneumoniae  (ATCC  700603),  Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella  typhimurium  (ATCC  29946),  Staphylococcus  aureus  (ATCC  12600),  Vibrio  parahaemolyticus  (ATCC  17802),  Shigella  sonnei  (ATCC  29030),  Shigella  flexneri  (ATCC  15391),  Shigella  boydii  (ATCC 8700).  OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R Hình 2. Tính đặc hiệu của mồi  Kết  quả  cho  thấy  các  cặp mồi OXA23‐F/R,  OXA51‐F/R và OXA58‐F/R  đặc hiệu với những  đỉnh chảy đặc trưng, không nhân bản DNA của  các vi khuẩn không phải  là A. baumanniii (Hình  2). Riêng với  cặp mồi OXA58‐F/R,  đỉnh  chảy  ở  nhiệt độ 71oC được xác định là của nhị phân mồi  (primer‐dimer).  Cặp mồi  IC‐F/R  được  thiết  kế  đặc hiệu với 16S rRNA của A. baumannii, không  đặc hiệu với 16S rRNA của các vi khuẩn khác. Vì  thế, phản ứng kém với DNA của vi khuẩn khác,  thể hiện qua tín hiệu định lượng thấp (không thể  hiện  ở  đây)  và  những  đỉnh  chảy  với  nhiệt  độ  không đặc trưng.  Tối ưu hóa nhiệt độ lai (Ta)  Chúng  tôi  khảo  sát  các  nhiệt  độ  lai  từ  50,0oC  đến 65,0oC, bao gồm  các nhiệt  độ  sau:  50,0oC;  51,0oC;  53,0oC;  55,9  oC;  59,5oC;  62,5oC;  64,1oC;  65,0oC.  Mẫu  DNA  A.  baumannii  sử  dụng có nồng độ 1,42x101 bản sao/μl. Tiêu chí  tối ưu là giá trị Ct của phản ứng real‐time PCR  càng nhỏ càng tốt.  Bảng 2. Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi  Ta (oC) 50,0 51,0 53,0 55,9 59,5 62,5 64,1 65,0 OXA23-F/R 28,8 28,7 28,2 27,4 26,6 26,9 26,8 27,1 OXA51-F/R 30,3 29,7 29,6 29,3 28,5 28,1 27,3 28,5 OXA58-F/R 33,8 33,4 32,1 31,9 30,4 30,1 30,2 30,3 IC-F/R 31,8 31,6 31,1 29,2 28,8 28,6 28,5 28,1 Kết  quả  cho  thấy  khoảng  nhiệt  độ  lai  phù  hợp cho cả bốn cặp mồi là từ 59,5oC đến 65,0oC.  Với  khoảng nhiệt  độ này, phản  ứng nhân  bản  trên cả bốn cặp mồi cho hiệu quả ổn định, giá trị  Ct  thấp  và  các  đỉnh  chảy  phân  tách  rõ  ràng.  Nhiệt độ lai tối ưu được chọn là 62,5oC.  Tối ưu hóa nồng độ mồi   Thí  nghiệm  được  tiến  hành  với  3  nghiệm  thức 1, 2 và 3 với nồng độ mồi  lần  lượt  là 100,  200 và 300 nM. Bốn  loại mồi được  tối ưu riêng  rẽ. Nhiệt  độ  lai  sử dụng như đã  tối  ưu  ở  trên.  Mẫu DNA A. baumannii sử dụng có nồng độ như  trên. Mỗi mẫu được lập lại 3 lần chạy.  Bảng 3: Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi  Nghiệm thứcOXA23-F/ROXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R 1 31,4±0,7 34,7±0,2 36,6±0,6 32,6±0,4 2 29,2±0,1 30,3±0,1 33,2±0,5 29,6±0,3 3 28,9±0,1 30,1±0,1 32,2±0,6 28,8±0,1 Kết quả (Bảng 3) cho thấy với mỗi mẫu thử,  giá  trị Ct  ở nồng độ mồi 200 và 300 nM  tương  đương nhau và luôn tốt hơn giá trị Ct của nồng  độ mồi  100nM.  Vì  vậy,  nồng  độ mồi  200  nM  được chọn tối ưu cho mỗi loại mồi khảo sát, do  lượng cần dùng trong phản ứng ít hơn.  Độ nhạy của phản ứng  Để  kiểm  tra  độ  nhạy  của  phản  ứng  EvaGreen  real‐time PCR,  thí nghiệm  được  tiến  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 201 hành với DNA tách chiết từ mẫu tế bào vi khuẩn  A. baumannii sau tăng sinh (1.42x106 bản sao/μl),  được pha loãng theo bậc 10. Điều kiện phản ứng  sử dụng như đã tối ưu ở trên. Mỗi mẫu được lập  lại 3 lần chạy.  Bảng 4: Giá trị Ct khảo sát độ nhạy của phản ứng  EvaGreen real‐time PCR  Mẫu Nồng độ* OXA23-F/R OXA51-F/R OXA58-F/R IC-F/R 1 1.42x105 15,2±0,4 16,2±0,5 19,2±0,4 16,0±0,5 2 1.42x104 18,2±0,1 19,5±0,3 22,4±0,2 19,2±1,0 3 1.42x103 21,7±0,1 23,2±0,1 26,7±0,8 23,6±0,6 4 1.42x102 24,7±0,3 26,5±0,0 29,5±0,5 26,8±0,9 5 1.42x101 28,9±0,2 31,0±0,1 33,8±0,8 31,5±0,3 6 1.42x100 33,4±0,7 35,2±0,3 N/A 36,0±0,6 (*) đơn vị nồng độ: bản sao/μl  Kết  quả  (Bảng  4)  cho  thấy  phản  ứng  EvaGreen  real‐time  PCR  đối  với mồi  OXA23‐ F/R, OXA51‐F/R  và  IC‐F/R  cho  tín hiệu dương  tính ổn định với mẫu DNA có nồng độ 1.42x100  bản  sao/μl;  Trong  khi  đó,  tín  hiệu  dương  tính  của mồi OXA58‐F/R ổn định ở mẫu DNA nồng  độ 1.42x101 bản sao/μl.  KẾT LUẬN  Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình  EvaGreen real‐time PCR để phát hiện các nhóm  gene  blaOXA‐23,  blaOXA‐51  và  blaOXA‐58  của  vi  khuẩn A. baumannii. Quy trình có thể được ứng  dụng để khảo sát dịch  tễ học phân  tử các gene  này  ở  các  chủng A. baumannii khác nhau  trong  lâm  sàng và hỗ  trợ  trong  chẩn  đoán nhiễm A.  baumannii ở người bệnh như là một chọn lựa bổ  sung bên cạnh quy trình nuôi cấy truyền thống.   TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bonfiglio  G,  Russo  G,  and  Nicoletti  G  (2002).  Recent  developments  in  carbapenems. Expert Opin  Investig Drugs  11(4), p. 529‐44.  2. Bou G, Oliver A,  and Martinez‐Beltran  J  (2000). OXA‐24,  a  novel class D beta‐lactamase with carbapenemase activity  in  an  Acinetobacter  baumannii  clinical  strain.  Antimicrob  Agents Chemother 44(6), p. 1556‐61.  3. Bush K,  Jacoby GA,  and Medeiros AA  (1995). A  functional  classification  scheme  for  beta‐lactamases  and  its  correlation  with  molecular  structure.  Antimicrob  Agents  Chemother  39(6), p. 1211‐33.  4. Donald HM, et al. (2000). Sequence analysis of ARI‐1, a novel  OXA beta‐lactamase,  responsible  for  imipenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii  6B92.  Antimicrob  Agents  Chemother 44(1), p. 196‐9.  5. Green  DW  (2002).  The  bacterial  cell  wall  as  a  source  of  antibacterial targets. Expert Opin Ther Targets 6(1), p. 1‐19.  6. Heritier  C,  et  al.  (2005).  Characterization  of  the  naturally  occurring  oxacillinase  of  Acinetobacter  baumannii.  Antimicrob Agents Chemother 49(10), p. 4174‐9.  7. Higgins  PG,  et  al.  (2010).  Global  spread  of  carbapenem‐ resistant Acinetobacter baumannii.  J Antimicrob Chemother  65(2), p. 233‐8.  8. Livermore DM and Woodford N  (2006). The beta‐lactamase  threat  in  Enterobacteriaceae,  Pseudomonas  and  Acinetobacter. Trends Microbiol 14(9), p. 413‐20.  9. Nicolau DP (2008). Carbapenems: a potent class of antibiotics.  Expert Opin Pharmacother 9(1), p. 23‐37.  10. Nordmann P and Poirel L (2002). Emerging carbapenemases  in Gram‐negative aerobes. Clin Microbiol  Infect 8(6), p. 321‐ 31.  11. Peleg AY, Seifert H,  and Paterson DL  (2008). Acinetobacter  baumannii:  emergence  of  a  successful  pathogen.  Clin  Microbiol Rev 21(3), p. 538‐82.  12. Poirel L and Nordmann P  (2006). Carbapenem resistance  in  Acinetobacter  baumannii:  mechanisms  and  epidemiology.  Clin Microbiol Infect 12(9), p. 826‐36.  13. Poirel L, et al. (2005). OXA‐58, a novel class D {beta}‐lactamase  involved  in  resistance  to  carbapenems  in  Acinetobacter  baumannii. Antimicrob Agents Chemother 49(1), p. 202‐8.  14. Theaker  C,  Azadian  B,  and  Soni N  (2003).  The  impact  of  Acinetobacter  baumannii  in  the  intensive  care  unit.  Anaesthesia 58 (3), p. 271‐4.  15. Turton  JF, et al.  (2005). Detection and  typing of  integrons  in  epidemic  strains  of  Acinetobacter  baumannii  found  in  the  United Kingdom. J Clin Microbiol 43(7), p. 3074‐82.  16. Turton  JF,  et  al.  (2006).  Identification  of  Acinetobacter  baumannii by detection of the blaOXA‐51‐like carbapenemase  gene intrinsic to this species. J Clin Microbiol 44(8), p. 2974‐6.  17. Zarrilli  R,  et  al.  (2009).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter baumannii: the molecular epidemic features of  an  emerging  problem  in  health  care  facilities.  J  Infect Dev  Ctries 3(5), p. 335‐41.  Ngày nhận bài báo:        05/9/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:    29/9/2014  Ngày bài báo được đăng:  20/10/2014