Xây dựng qui trình xác định hàm lượng Vitamin B1, B2, B3 và B6 trong sữa bột bổ sung vi chất dinh dưỡng

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 702 XÂY DỰNG QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1, B2, B3  VÀ B6 TRONG SỮA BỘT BỔ SUNG VI CHẤT DINH DƯỠNG  Trần Thị Mỹ Ngọc*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Hiện nay, các phương pháp xác định hàm lượng vitamin B trong sữa được phát triển rất đa  dạng. Tuy nhiên ứng với mỗi loại vitamin B lại có một qui trình phân tích khác nhau nên khá tốn thời gian cũng  như chi phí phân tích. Trong khi đó sữa bột được bổ sung cùng lúc nhiều loại vitamin B. Để hạn chế nhược điểm  trên nghiên cứu này tập trung xây dựng qui trình xác định đồng thời hàm lượng các vitamin B1, B2, B3 và B6  trong sữa bột bổ sung vi chất dinh dưỡng.  Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng qui trình xác định hàm lượng vitamin B1, B2, B3 và B6 trong sữa bột bổ  sung vi chất dinh dưỡng.   Phương pháp nghiên cứu: Triển khai trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần, tối ưu hóa qui trình xử lý  mẫu, xác định giá trị sử dụng của phương pháp.  Kết quả: Hoàn chỉnh qui trình xác định hàm lượng vitamin B1, B2, B3 và B6 trong mẫu sữa bột bổ sung vi  chất dinh dưỡng bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần.  Kết luận: Áp dụng qui trình này để kiểm tra hàm lượng vitamin B1, B2, B3 và B6 trong mẫu sữa bột bổ  sung vi chất dinh dưỡng trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh năm 2013.  Từ khóa: Vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B6, sữa bột, LC‐MS/MS.  ABSTRACT  CONSTRUCTING A METHOD FOR DETERMINATION OF VITAMIN B1, B2, B3 AND B6 IN MILK  POWDER HAVING MICRONUTRIENT SUPPLEMENT   Tran Thi My Ngoc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6 ‐ 2014: 703 ‐ 708  Background: Methods  for determination of vitamins B  in milk have been developed  for a  long  time ago.  However  each  type  of  vitamin  group B  has  a  different  analysis  procedure  that  consumes  time  and  costs  for  analysis. Many types of vitamin B have been added in milk powder as micronutrient supplement. Thus, the study  aims to construct a method that can determine four types of Vitamin group B in milk powder with micronutrient  supplement.  Objectives:  Construct  a  process  to  determine  vitamin  B1,  B2,  B3  and  B6  in  milk  powder  having  micronutrient supplement.   Methods:  Implemented  on  a  liquid  chromatography mass  spectrometry  LC‐MS/MS,  optimized  sample  preparation, validated the method.  Results: The method of determination of the amount of vitamin B1, B2, B3 and B6 in in milk powder having  micronutrient supplement by liquid chromatography mass spectrometry LC‐MS/MS was constructed.  Conclusion: The study suggests that the method of liquid chromatography mass spectrometry LC‐MS/MS  can be applied for determination of vitamin B1, B2, B3 and B6 in milk powder having micronutrient supplement  in Ho Chi Minh City.  * Viện Y tế công cộng thành phố Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: CN. Trần Thị Mỹ Ngọc   ĐT: 0169 689 5534  Email: myphone820668@yahoo.com.vn  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  703 Keywords: Vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B6, milk powder, LC‐MS/MS.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Vitamin nhóm B đóng vai trò quan trọng đối  với  sức  khỏe  con  người. Nhóm  này  bao  gồm  thiamine (B1), riboflavin (B2), nicotinamide (B3),  pyridoxine (B6) và những loại vitamin tan trong  nước khác. Mặc dù những chất này có sẵn trong  thực  phẩm  nhưng  việc  thiếu  vitamin  B  trong  khẩu phần ăn của mỗi người là có thể xảy ra và  ảnh hưởng đến sức khỏe. Tùy theo màu sắc, khả  năng chống oxy hóa và giá trị dinh dưỡng, việc  bổ sung vitamin nhóm B vào  thực phẩm  là cần  thiết. Do đó, đòi hỏi có những phương pháp xác  định những vitamin này trong thực phẩm(3).  Tuy nhiên việc phân  tích vitamin B  trong  thực phẩm khá phức tạp bởi vì: các vitamin có  cấu  trúc hóa học và  tính  chất khác nhau nên  khó  tìm một  phương  pháp  chung  thích  hợp  phân  tích  đồng  thời  tất  cả  các  vitamin  trong  thực  phẩm;  thực  phẩm  bổ  sung  vitamin  thường là những nền mẫu phức tạp; có những  vitamin  được  bổ  sung  với  hàm  lượng  thấp;  một vài vitamin dễ bị phân hủy bởi ánh sáng,  không khí và nhiệt độ. Nhiều phương pháp đã  được  nghiên  cứu  để  có  thể  xác  định  vitamin  nhóm  B  trong  thực  phẩm  và  thực  phẩm  bổ  sung.  Blake  và  Konings  đã  tổng  hợp  nhiều  phương pháp phân  tích vitamin nhóm B bao  gồm kỹ thuật vi sinh, HPLC, biosensor/ ELISA.  Trước đây kỹ thuật vi sinh được sử dụng khá  phổ  biến  có  thể  phân  tích  vitamin  B  ở  hàm  lượng  thấp.  Kỹ  thuật  này  phụ  thuộc  vào  sự  phát  triển  của  những  vi  sinh  vật  đặc  trưng  thực  hiện  phản  ứng  sinh  hóa  cho  từng  loại  vitamin. Chẳng hạn như định  lượng  thiamine  ở  hàm  lượng  vết  với  sự  hiện  diện  của  L.viridescens(6). Quá trình ủ mất 16‐20 giờ ở 30 ±  20C và  có  độ  lặp  lại kém. Do  đó hạn  chế  lớn  nhất  của  kỹ  thuật  vi  sinh  là  tốn  nhiều  thời  gian,  không  thể phân  tích  nhiều  loại  vitamin  cùng lúc, độ lặp lại kém nên không được xem  là  phương  pháp  tối  ưu  cho  việc  phân  tích  vitamin(2).  Kỹ  thuật sắc ký  lỏng với đầu dò UV có  thể  đo được một hoặc một vài vitamin B trong thực  phẩm  như  việc  định  lượng  niacin  trong  sữa  dùng HPLC  là một  phương  pháp  của AOAC.  Một vài loại vitamin với hàm lượng thấp nên độ  nhạy kém không  thể đo  trực  tiếp  được. Chẳng  hạn như để có thể đo được thiamine trong mẫu  thực  phẩm  với  hàm  lượng  thấp  phải  chuyển  thiamine về dạng thiochrome, tiến hành đo trên  máy HPLC  –  RF  (AOAC  986.27)(1). Kết  quả  là  ứng với từng loại vitamin mà ta có phương pháp  xác định khác nhau dẫn đến việc tốn nhiều thời  gian cũng như chi phí. Nhu cầu phân tích ngày  càng  tăng  với mong muốn  có  thể  định  lượng  đồng  thời  nhiều  loại  vitamin  B  trong một  lần  chay là xu hướng phát triển ngày nay.   Kỹ  thuật  LC‐MS/MS  có  thể  đáp  ứng  các  yêu  cầu  trên  như  phân  tích  đồng  thời  nhiều  vitamin B nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác và  độ đúng. Hơn nữa kỹ thuật này có độ nhạy và  độ  đặc  hiệu  cao  thích  hợp  phân  tích  những  mẫu có hàm lượng thấp và nền phức tạp. Qui  trình  xử  lý  mẫu  đơn  giản,  nhanh  giúp  tiết  kiệm đáng kể  thời gian phân  tích. Với những  ưu  điểm  vừa  nêu,  kỹ  thuật  LC‐MS/MS  được  chọn để tiến hành xây dựng qui trình xác định  hàm lượng vitamin B trong sữa.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  31 mẫu sữa bột bổ sung vi chất dinh dưỡng  được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ và siêu thị  trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 7  đến tháng 11 năm 2013.  Hóa chất – Thiết bị – Dụng cụ  Thiết bị – Dụng cụ  Hệ  thống  sắc  ký  lỏng  ghép  khối  phổ  LC‐ MS/MS bao gồm khối phổ ba  tứ  cực AB  Sciex  Qtrap 5500 với nguồn ion hóa Turbo‐V ghép nối  với  sắc  ký  lỏng  Shimadzu  UFLCXR  bao  gồm  bơm  Shimadzu  20ADXR,  bộ  tiêm  mẫu  Shimadzu  SIL‐20ACXR,  bộ  điều  khiển  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 704 Shimadzu CBM‐20A. Toàn bộ hệ thống sắc ký và  khối phổ được kiểm  soát,  điều khiển bởi phần  mềm Analyst 1.5.1 của hang AB Sciex. Cột phân  tích được sử dụng  là cột HiQ sil C18HS‐3 4.6 x  150 mm, kích thước hạt 3 μm và cột bảo vệ được  cung cấp bởi All‐tech.  Các thiết bị, dụng cụ thông thường khác: cân  phân  tích, máy  ly  tâm, máy  lắc, dụng  cụ  thủy  tinh (bình mức, pipet).  Hóa chất – Chất chuẩn  Hóa chất: loại tinh khiết dùng cho HPLC  Các  chất  chuẩn:  vitamin  B1  (thiamine  hydrochloride), vitamin B2  (riboflavin), vitamin  B3  (nicotinamide),  vitamin  B6  (pyridoxine  hydrochloride)  của Sigma – Aldrich  có  độ  tinh  khiết > 98%.  Phương pháp nghiên cứu  Xử lý mẫu  Qui trình xử lý mẫu đóng góp tới 80% sai số  của kết quả phân tích, do đó việc tìm ra qui trình  xử lý mẫu thích hợp là điều quan trọng. Hầu hết  các vitamin B1, B2, B3 và B6 nhạy cảm với nhiệt  độ, ánh sáng nên dễ bị phân hủy trong thời gian  ngắn. Việc chiết các vitamin này từ nền mẫu sữa  bột cần lưu ý đến tính bền vững của chúng như  điều kiện pH, nhiệt độ, ánh sáng,  tác nhân oxy  hóa từ môi trường, lực ion và sự có mặt của các  ion kim loại nặng có trong mẫu.  Phương pháp phân tích  Vitamin  B1,  B2,  B3  và B6  được  phân  tích  định  tính  và  định  lượng  bằng  LC‐MS/MS.  Khảo sát lựa chọn mảnh ion mẹ và ion con, sử  dụng mảnh  ion  con  cho  tín hiệu  lớn nhất  để  định  lượng,  lấy  thêm một mảnh  ion con khác  để định tính.  Xác định giá trị sử dụng của phương pháp  Thực  hiện  đánh  giá  các  thông  số  kỹ  thuật  bao gồm khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện  và giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ chính xác  trung  gian,  độ  đúng  và  hiệu  suất  thu  hồi  của  phương pháp.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Khảo sát điều kiện khối phổ  Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế  độ  bắn  ion dương,  các  ion mẹ  thường  ở dạng  (M+1). Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao  thì cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá  thích hợp. Tiến hành khảo  sát bắn phá  các  ion  mẹ, kết quả được trình bày trong bảng 1.  Bảng 1: Kết quả khảo sát ion mẹ và ion con (cặp ion  được in đậm là cặp ion định lượng, cặp ion còn lại là  cặp ion định tính)  Chất phân tích Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) DP (V) CE (eV) Vitamin B1 265 122 35 21 Vitamin B1 265 144 35 21 Vitamin B2 377 243 70 35 Vitamin B2 377 198 70 35 Vitamin B3 124 80 60 30 Vitamin B3 124 78 60 30 Vitamin B6 170 134 45 31 Vitamin B6 170 152 45 31 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng  Pha động:  +  Pha  động A  (Acetonitrile bổ  sung  0,05%  Acid formic)  +  Pha  động  B  (H2O  bổ  sung  0,05%  Acid  formic)  Bảng 2: Chương trình gradient nồng độ  Thời gian (phút) Pha động Tỷ lệ nồng độ (%) 0,01 B 100 13,00 B 35 13,01 B 100 14,00 Dừng chương trình Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút.  Thể tích bơm mẫu:  5 μL.  Cột phân  tách: Cột HiQ sil C18HS‐3, 4.6 x  150 mm, kích thước hạt 3μm với bộ phận bảo  vệ cột.  Xử lý mẫu  Quá  trình  xử  lý mẫu  được  thực  hiện  như  sau: cân 1g mẫu đã đồng nhất vào tube nhựa 50  ml. Thêm 50 ml dung dịch chiết 5mM HCl chứa  20% MeOH cho mỗi tube. Mẫu được lắc Vortex  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  705 và  siêu  âm  30  phút.  Sau  đó  ly  tâm  4500  vòng  trong 4 phút. Lọc qua màng PTFE 0,45μm vào  vial màu nâu. Đem vial tiến hành phân tích mẫu  trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần. Dung  dịch 5mM HCl chứa 20% MeOH được chọn làm  dung dịch chiết vì những lý do sau đây:  Vitamin B1 có bản chất ion nên có khả năng  hấp phụ lên thành bình, dung dung dịch có tính  acid mạnh chống lại ảnh hưởng này (vitamin B1  ổn  định hơn  10  tiếng  sau khi  chiết bằng  5mM  HCl trong khi trước đó dung dịch pH 7 thì sau 1  tiếng vitamin B1 giảm 30% tín hiệu).  Sử dụng dung dịch 5mM HCl có chứa 20%  MeOH để tủa protein trong mẫu sữa, sau khi ly  tâm  lấy phần dung dịch nổi phía  trên  lọc  qua  màng PTFE dễ dàng hơn.  Qui  trình xử  lý mẫu đơn giản, nhanh, giúp  tiết kiệm đáng kể thời gian phân tích cũng như  hạn  chế  đáng kể  sự phân hủy  của  các vitamin  B1, B2, B3 và B6.  Các thông số của phương pháp phân tích  Khoảng tuyến tính  Khoảng tuyến tính của hỗn hợp các vitamin  với nồng độ  từ 0,05 đến 0,6 mg/kg cho kết quả  như trong bảng 3.  Bảng 3: Các thông số về khoảng tuyến tính của  chuẩn các chất phân tích  Chất phân tích Khoảng nồng độ (mg/kg) Hệ số tương quan R 2 Vitamin B1 0,05 – 0,1 – 0,2 – 0,4 – 0,6 0,9991 Vitamin B2 0,9996 Vitamin B3 0,9993 Vitamin B6 0,9982 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của  phương pháp  Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng  độ thấp và xác định tỷ lệ S/N, LOD và LOQ lần  lượt được xác định tại các giá trị S/N tương ứng  là 3 và 10. Qua thực nghiệm cho giá trị LOD từ  0,010 đến 0,015 mg/kg và LOQ từ 0,030 đến 0,045  mg/kg.  Kết  quả  chi  tiết  được  trình  bày  trong  bảng 4.  Độ chính xác của phương pháp phân tích  Độ lặp lại  Qua quá trình phân tích mẫu xác định độ lặp  lại  của  phương  pháp  trong  cùng một  lần  thí  nghiệm,  chúng  tôi  nhận  thấy  độ  lặp  lại  của  phương pháp có hệ số biến động (% RSD) nằm  trong khoảng từ 5.55 đến 8.82. Chất phân tích có  hệ  số  biến  động  thấp  nhất  trên  cùng một  thí  nghiệm là vitamin B2 và chất có hệ số biến động  cao nhất trên cùng một thí nghiệm là vitamin B1.  Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.  Độ tái lặp nội bộ  Qua quá trình phân tích mẫu xác định độ tái  lặp  nội  bộ  của  phương  pháp  tại  phòng  thí  nghiệm  trong  các  ngày  phân  tích  khác  nhau,  chúng  tôi  nhận  thấy  độ  tái  lặp  nội  bộ  của  phương pháp có hệ số biến động (% RSD) nằm  trong khoảng từ 6,27 đến 9,10. Chất phân tích có  hệ  số biến  động  thấp nhất  trên  các ngày phân  tích  khác nhau  là  vitamin B3  và  chất  có hệ  số  biến động cao nhất trên các ngày phân tích khác  nhau  là vitamin B2. Kết quả chi  tiết được  trình  bày trong bảng 4.  Độ đúng của phương pháp phân tích  Độ đúng của phương pháp phân  tích được  đánh giá dựa trên việc xác định mẫu CRM thong  qua độ chệch (bias). Mẫu CRM có mã số là SRM  1894a  được  cung  cấp  bởi  tổ  chức  National  Institue  of  Standard  &  Technology.  Qua  quá  trình thực nghiệm chúng tôi thu được độ chệch  nằm trong khoảng 2.39% đến 11.66%. Độ chệch  thấp nhất  là vitamin B1 và cao nhất  là vitamin  B6. Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 4.  Hơn nữa khi so với giá  trị nồng độ được cung  cấp trong CA của mẫu CRM chúng tôi thu được  độ  thu hồi của  từng chất phân  tích. Độ  thu hồi  nằm  trong khoảng 88% đến 100%,  trong đó độ  thu hồi của vitamin B1, B2, B3 và B6 lần lượt là  98%, 95%, 100% và 88%.  Hiệu suất thu hồi của phương pháp  Hiệu  suất  thu  hồi  của  phương  pháp  được  khảo sát tại các nồng độ 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg và  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 706 0,4 mg/kg. Qua quá trình thực nghiệm chúng tôi  nhận  thấy hiệu suất  thu hồi  trung bình của các  vitamin  từ  82.25%  đến  101.97%. Hiệu  suất  thu  hồi  thấp  nhất  là  vitamin  B6  và  cao  nhất  là  vitamin B3. Kết quả này phù hợp khi so sánh với  độ thu hồi khi thực hiện trên mẫu CRM. Kết quả  chi tiết được trình bày trong bảng 4.  Bảng 4: Bảng thông số giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ tái lặp nội bộ, độ chệch và hiệu suất  thu hồi của phương pháp phân tích  Chất phân tích Giới hạn phát hiện (mg/kg) Giới hạn định lượng (mg/kg) Độ lặp lại (% RSD) Độ tái lặp nội bộ (% RSD) Độ chệch (%) Hiệu suất thu hồi (%) Vitamin B1 0,014 0,043 8,82 7,35 6,73 93,50 Vitamin B2 0,010 0,030 5,55 9,10 8,27 100,93 Vitamin B3 0,010 0,031 5,16 4,95 5,21 101,97 Vitamin B6 0,015 0,045 7,37 8,58 11,22 85,25 Kết quả phân tích mẫu thực tế  Áp dụng qui trình đã xây dựng để phân tích  các mẫu sữa bột bổ sung vi chất dinh dưỡng trên  địa  bàn  thành  phố Hồ Chí Minh. Các  kết  quả  được tổng hợp trong bảng sau:  Bảng 5: Kết quả hàm lượng vitamin B1, B2, B3 và B6 trong mẫu sữa bột  Mã số Kết quả (mg/kg) Mã số Kết quả (mg/kg) B1 B2 B3 B6 B1 B2 B3 B6 S - 01 3,21 7,96 36,28 4,84 S - 16 18,09 17,96 98,08 10,20 S - 02 6,99 6,70 84,43 8,18 S - 17 15,43 16,77 205,67 21,19 S - 03 10,50 7,89 102,24 6,36 S - 18 4,34 8,65 45,04 3,30 S - 04 6,83 6,58 98,13 8,83 S - 19 10,84 8,74 91,29 11,95 S - 05 25,85 27,41 76,07 29,58 S - 20 18,07 22,63 188,01 18,83 S - 06 8,43 8,74 56,60 5,47 S - 21 4,83 5,69 58,13 4,15 S - 07 8,70 9,36 72,00 11,42 S - 22 6,77 8,81 53,81 8,80 S - 08 8,91 8,43 86,62 10,59 S - 23 6,76 7,07 59,13 5,90 S - 09 7,09 S - 24 4,79 6,97 68,52 6,28 S - 10 11,01 9,36 83,55 10,53 S - 25 3,63 9,01 32,71 3,17 S - 11 14,08 10,79 79,04 13,31 S - 26 3,94 9,65 34,47 3,69 S - 12 9,39 8,53 87,19 12,68 S - 27 6,13 12,39 48,94 6,77 S - 13 9,63 6,81 71,36 9,1 S - 28 3,89 9,65 63,05 3,15 S - 14 2,12 13,62 6,23 1,90 S - 29 6,03 9,40 60,20 2,80 S - 15 9,30 8,48 91,29 11,95 S - 30 7,65 8,03 69,15 3,30 S - 31 14,87 16,50 202,74 20,31 Nhận xét: hàm  lượng vitamin B1, B2, B3 và  B6 thu được khi so sánh với hàm lượng của các  chất được nhà sản xuất ghi trên bao bì, kết quả  sai khác trong khoảng 10%.   KẾT LUẬN   Qua nghiên cứu chúng tôi đã xây dựng được  một phương pháp đơn giản, nhanh, có độ tin cậy  cao  để  xác  định  đồng  thời  hàm  lượng  các  vitamin B1, B2, B3 và B5 trong nền mẫu sữa bột  bổ sung vi chất dinh dưỡng. Phương pháp này  được tiến hành nhanh chóng, độ nhạy và độ đặc  hiệu cao nhờ sử dụng công cụ phân tích hiện đại  là hệ thống sắc ký ghép khối phổ ba tứ cực. Qui  trình  phân  tích  có  độ  đúng  được  kiểm  chứng  thông qua việc xác định trên mẫu CRM. Độ lặp  lại của phương pháp có hệ số biến động (% RSD)  từ 5,16 đến 8,82. Độ  tái  lặp nội bộ của phương  pháp  có hệ  số biến  động  (% RSD)  từ  4,95  đến  9,10. Giới hạn định  lượng của phương pháp  từ  0,010 mg/kg đến 0,015 mg/kg.   KIẾN NGHỊ  Mở  rộng  phương  pháp  để  phân  tích  các  đối tượng thực phẩm khác và các loại vitamin  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  707 tan  trong  nước  khác  như  vitamin  B5,  B12,  choline, biotin.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Dự án xây dựng và kiểm soát chất lượng nông sản thực phẩm  (FAPQDC‐CIDA).  Sổ  tay hướng dẫn xác nhận giá  trị  sử dụng  phương pháp thử tiêu chuẩn Lĩnh vực Hóa. Ban hành lần 1‐ tháng  06/2012. Tr. 12‐43.  2. Gentili A,  et  al  (2008).  Simultaneous  determination  of water  –  soluble  vitamins  in  selection  food  matrices  by  liquid  chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.  Rapid Commun. Mass Spectrum. 22. 2029‐2043  3. Huang  M,  et  al  (2009).  Measurement  of Water  –  Soluble  B  Vitamins  in  Infant  Formula  by  Liquid  Chromatography/Tandem  Mass Spectrometry. Journal of AOAC International.92. 6.24‐34.  Ngày nhận bài báo:       16/5/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   13/6/2014  Ngày bài báo được đăng:     14/11/2014