Xây dựng quy trình định lượng đồng thời Fexofenadin và tạp A bằng phương pháp HPLC

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 416 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI FEXOFENADIN VÀ TẠP A BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Trần Thị Cẩm Vân* Trần Quốc Lộc*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: 4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethylbenzeneacetic acid (tạp A) là tạp chất liên quan của fexofenadin, có nguồn gốc từ quá trình tổng hợp và bảo quản fexofenadin. Do đó, trong chuyên luận fexofenadin của dược điển một số nước như BP 2016 và USP 40 đều quy định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp A cả trong nguyên liệu và thành phẩm chứa fexofenadin. Cho đến nay, trên thế giới chỉ có một vài công trình công bố định lượng fexofenadin và tạp A bằng phương pháp HPLC. Trong nước chưa có tác giả nào công bố qui trình sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A trong nguyên liệu, chế phẩm chứa fexofenadin và trong quá trình theo dõi độ ổn định của thuốc. Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng phương pháp phân tích đồng thời fexofenadin và tạp A trong nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin, góp phần giảm chi phí và thời gian phân tích. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Fexofenadin hydroclorid và tạp A của fexofenadin hydroclorid (4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethylbenzeneacetic acid). Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến hiệu lực tách fexofenadin và tạp A như tỷ lệ và thành phần pha động. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện tạp A, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác, độ đúng và độ thô. Quy trình sau khi được thẩm định sẽ được ứng dụng để định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin trên thị trường. Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A như sau: cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5 µm), bước sóng phát hiện 220 nm, pha động acetonitril – nước – acid phosphoric – amoni hydroxyd (42:58:0,1:0,2), thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, đạt yêu cầu về độ đúng, độ chính xác và độ thô, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng tạp A thấp. Kết quả định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin đang lưu hành tại Việt Nam cho thấy hàm lượng fexofenadin và tạp A nằm trong giới hạn cho phép. Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A bằng phương pháp HPLC đã được xây dựng và thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng và pha động không có dung dịch đệm. Quy trình đã được ứng dụng để định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin đang có trên thị trường. Từ khóa: Fexofenadin, tạp A của fexofenadin. *Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm, Mỹ phẩm tỉnh Đắklắk **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913 799 068 Email: ductuan@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 417 ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF FEXOFENADINE AND IMPURITY A BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY Tran Thi Cam Van, Tran Quoc Loc, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 416 -425 Background – Objectives: 4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethyl benzeneacetic acid is fexofenadine impurity A which arises from synthesis and during storage of fexofenadine. The presence of this impurity may influence treatment efficacy and safety of fexofenadine. The BP 2016 and USP 40 require conducting the impurity test in fexofenadine pharmaceutical substance as well as corresponding finished products. There have been several published studies on assay of fexofenadine and impurity A so far. Therefore, this study was carried out with the aim of development of a fast, simple and less-costly HPLC method for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A. Method: The subject of this study was fexofenadine hydrochloride and fexofenadine impurity A (4-[1-oxy-4- [4-(hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]-,-dimethyl benzeneacetic acid). Method: Several chromatographic conditions such as components of mobile phase in different ratio that affects selectivity and separation efficiency, were investigated. Once the appropriate chromatographic conditions were obtained, the analytical procedure was validated basing on ICH guidelines, including system suitability, selectivity, quantitation and detection limit of impurity A, linearity and range, precision, accuracy, and robustness. Then the validated procedure was applied for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A in fexofenadine raw materials and corresponding pharmaceuticals. Results: The appropriate chromatographic conditions for complete separation of fexofenadine and impurity A were obtained on HIQ sil C18HSA column (250 x 4.6 mm; 5 µm), detection wavelength at 220 nm, mixture of acetonitrile, water, phosphoric acid, and ammonium hydroxide (42:58:0.1:0.2) as mobile phase, injection volume of 20 µL, flow rate of 0.8 ml/min. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, linear, precise, accurate, high sensitivity, and robust. All the calculations concerning the quantitative analysis showed that several fexofenadine raw materials and corresponding pharmaceuticals in Vietnam market contained an amount of fexofenadine and impurity A that was within accepted limits. Conclusion: The RP-HPLC method for simultaneous determination of fexofenadine and impurity A was successfully developed and validated, using isocratic mode and mobile phase without buffer. The proposed method was applied for quantitation of fexofenadine and impurity A in some fexofenadine raw materials and corresponding finished products in the market. Keyword: fexofenadine, fexofenadine impurity A. ĐẶT VẤN ĐỀ 4-[1-oxy-4-[4-(hydroxydiphenylmethyl)-1- piperidinyl]butyl]-,-dimethyl benzeneacetic acid (tạp A) là tạp chất liên quan của fexofenadin, có nguồn gốc từ quá trình tổng hợp và bảo quản fexofenadin(3,6). Do đó, trong chuyên luận fexofenadin của dược điển một số nước như BP 2016 và USP 40 đều quy định phải kiểm tra giới hạn h|m lượng tạp A cả trong nguyên liệu và thành phẩm chứa fexofenadin. Cho đến nay, trên thế giới chỉ có một vài công trình công bố định lượng fexofenadin và tạp A bằng phương ph{p HPLC(2,4). Trong nước chưa có t{c giả nào công bố qui trình sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A trong nguyên liệu, chế phẩm chứa fexofenadin và trong quá trình theo dõi độ ổn định của thuốc. Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu n|y được thực hiện với mục tiêu xây dựng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 418 phương ph{p ph}n tích đồng thời fexofenadin và tạp A trong nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin, góp phần giảm chi phí và thời gian phân tích. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Fexofenadin hydroclorid và tạp A của fexofenadin hydroclorid (4-[1-oxy-4-[4- (hydroxydiphenylmethyl)-1-piperidinyl]butyl]- ,-dimethyl benzeneacetic acid). Nguyên vật liệu Chất chuẩn Chuẩn đối chiếu fexofenadin hydroclorid: độ tinh khiết 99,7% tính trên nguyên trạng, số kiểm soát 160236, điều kiện bảo quản 2-8oC do công ty SAVI cung cấp. Tạp chuẩn A của fexofenadin hydroclorid: độ tinh khiết 100% tính trên nguyên trạng, số kiểm so{t 02032, điều kiện bảo quản 2-8oC do tổ chức dược điển Châu Âu cung cấp (European Pharmacopoeia). Trang thiết bị: Hệ thống HPLC 1260 Agilent, cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5 µm), cân phân tích ABT 220 – 5DM Kern với độ chính xác 0,01 mg, bể siêu âm S100H Elmasonic, máy đo pH S220 Metler Toledo. Hóa chất và dung môi: Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Merck). Triethylamin (TEA), acid phosphoric đậm đặc và amoni hydroxyd đậm đặc đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn gốc tạp A (50 ppm): cân chính xác khoảng 1 mg tạp chuẩn A, cho vào bình định mức 20 ml, thêm 10 ml acetonitril, siêu âm 5 phút, bổ sung acetonitril vừa đủ đến vạch, lắc đều. Mẫu chuẩn fexofenadin 60 ppm và tạp ppm: cân chính xác khoảng 6 mg fexofenadin chuẩn, cho v|o bình định mức 10 ml, thêm 5 ml pha động, siêu }m 5 ph t, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được dung dịch A. H t chính x{c 1 ml dung dịch A, cho v|o bình định mức 10 ml. Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc tạp A, cho v|o bình định mức, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử: cân một lượng bột thuốc tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội và thêm pha động đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch cho v|o bình định mức 50 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu thử giả lập: cân một lượng bột thuốc tương đương 60 mg fexofenadin, cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội và thêm pha động đến vạch, lắc đều. H t chính x{c 5 ml dung dịch, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc tạp A, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu giả dược: cân một lượng giả dược tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội và thêm pha động đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch cho v|o bình định mức 50 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu giả dược thêm chuẩn fexofenadin: cân chính xác khoảng 60 mg fexofenadin chuẩn và một lượng giả dược tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch, cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn và tạp chuẩn A: cân chính xác khoảng 60 mg fexofenadin chuẩn và một lượng giả dược tương đương 60 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội và thêm pha động đến vạch, lắc đều. H t chính Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 419 x{c 5 ml dung dịch, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm chính xác 5 ml dung dịch chuẩn gốc tạp A, bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Để chứng minh qui trình định lượng đồng thời tạp A trong nguyên liệu fexofenadin có tính chọn lọc trong trường hợp fexofenadin bị phân hủy để tạo thành tạp A và các tạp khác (nếu có), các mẫu khảo sát sau đ}y đã được chuẩn bị như sau: Mẫu được oxy hóa bởi H2O2 3%/ 48 giờ: cân một lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml dung dịch H2O2 3%, siêu âm 10 ph t, để nguội và thêm H2O2 3%, lắc đều. Dung dịch thu được được đặt trong tủ sấy nhiệt độ 30oC trong 48 giờ. Mẫu đặt ở nhiệt độ 60oC/ 48 giờ: cân một lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, trải thành một lớp mỏng trong hộp petri và cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60oC  2oC trong 48 giờ. Sau đó cho bột thuốc v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu chiếu ánh sáng trực tiếp trong 48 giờ: cân một lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, trải thành một lớp mỏng trong hộp petri v| để dưới ánh sáng mặt trời trong 48 giờ. Sau đó cho bột thuốc v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu chiếu tia UV trong 24 giờ: cân một lượng bột thuốc tương đương 50 mg fexofenadin, trải thành một lớp mỏng trong hộp petri v| để dưới đèn UV 254 nm trong 24 giờ. Sau đó cho bột thuốc v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml pha động, siêu âm khoảng 10 ph t, để nguội v| thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu được làm ẩm trong 24 giờ: cân 50 mg nguyên liệu fexofenadin, cho v|o bình định mức 50 ml, thêm khoảng 5 ml nước cất, siêu }m 10 ph t, để nguội, thêm nước cất đến vạch, lắc đều, để yên 24 giờ, lọc qua m|ng lọc 0,45 m. Các dung dịch sau khi pha được bọc kín miệng bằng giấy parafin và bảo quản trong tủ lạnh, nhiệt độ 5oC ± 2oC. Trước khi sử dụng, để dung dịch ở nhiệt độ 20oC – 25oC trong 1 - 2 giờ. Phƣơng pháp nghiên cứu Dựa vào cấu trúc hóa học fexofenadin và tạp A, đồng thời tham khảo chuyên luận của fexofenadin trong c{c dược điển USP 40(7) và BP 2016(1), phương ph{p sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò DAD sẽ được áp dụng với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5 m), tốc độ dòng 0,8 ml/ph t, bước sóng phát hiện 220 nm, thể tích tiêm 20 l, pha động acetonitril và nước có thêm acid phosphoric và triethylamin hoặc amoni hydroxyd với chương trình rửa giải đẳng dòng. Trong quá trình thực nghiệm, một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu lực tách sẽ được khảo sát như tỷ lệ và thành phần pha động. Qua các khảo sát thực nghiệm, chọn được điều kiện sắc ký thích hợp sao cho pic tạp A v| pic fexofenadin đạt độ tinh khiết (theo phổ UV-Vis), tách hoàn toàn và có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình ph}n tích theo hướng dẫn của ICH, bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện tạp A, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính x{c, độ đ ng v| độ thô. Quy trình sau khi được thẩm định sẽ được ứng dụng để định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin trên thị trường. KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký Tiến hành sắc ký hỗn hợp chuẩn fexofenadin 60 ppm và tạp A 5 ppm theo điều kiện sắc ký ban đầu v| thay đổi thành phần pha động theo các tỷ lệ khác nhau. Bảng 1 trình bày một số tỷ lệ thành phần pha động được khảo s{t. Hình 1 đến hình 4 minh họa sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn. Bảng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 420 2 trình bày các thông số sắc ký của fexofenadin và tạp A. Bảng 1: Thành phần pha động khảo sát Hệ pha động Tỷ lệ khảo sát (ACN – H2O – H3PO4 - TEA) 1 50 : 50 : 0,1 : 0,30 2 45 : 55 : 0,1 : 0,30 3 42 : 58 : 0,1 : 0,30 4 40 : 60 : 0,1 : 0,30 Bảng 2: Kết quả khảo sát thành phần pha động Hệ pha động Hoạt chất tR (phút) S (mAU x giây) RS AS Độ tinh khiết pic 1 Fexofenadin 4,953 3035 1,5 Đạt Tạp A 6,347 189 4,2 1,1 Đạt 2 Fexofenadin 6,551 3026 1,5 Đạt Tạp A 9,205 187 5,2 1,1 Đạt 3 Fexofenadin 8,386 3022 1,4 Đạt Tạp A 12,610 190 5,7 1,1 Đạt 4 Fexofenadin 10,096 3028 1,5 Đạt Tạp A 15,425 188 5,6 1,2 Đạt Kết quả khảo sát cho thấy: Với hệ pha động 1: Tạp A và fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Tuy nhiên, hệ số phân giải thấp nhất so với hệ 2, 3 và 4. Với hệ pha động 2: Tạp A và fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Khoảng cách thời gian lưu giữa pic fexofanadin và tạp A ngắn hơn so với hệ 3 và 4. Hệ số phân giải cao và thời gian phân tích không quá 15 phút. Với hệ pha động 3: Tạp A và fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và hệ số phân giải cao nhất so với hệ 1, 2 và 4. Với hệ pha động 4: Tạp A và fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Thời gian phân tích d|i hơn so với hệ pha động 1, 2 và 3. Với cả 4 hệ pha động, áp suất hệ thống cao (trung bình khoảng 200 bar) và không ổn định (180 - 220 bar). Nguyên nhân có thể do độ nhớt TEA cao. Như vậy, hệ pha động 3 được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo. Tiến h|nh thay đổi tỷ lệ TEA trong pha động từ 0,15% - 0,25%. Tuy nhiên, áp suất hệ thống vẫn cao (trung bình khoảng 200 bar) và không ổn định (180 - 220 bar). Các thí nghiệm tiếp theo bao gồm thay TEA bằng amoni hydroxyd với nồng độ từ 0,1% - 0,3%. Kết quả khảo sát cho thấy khi nồng độ amoni hydroxyd từ 0,2% - 0,3%, tạp A và fexofenadin tách hoàn toàn, hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, áp suất hệ thống giảm (trung bình khoảng 90 bar) và ổn định (89 - 91 bar). Hình 1: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động 1 Fexofenadin Tạp A Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 421 Hình 2: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động 2 Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động 3 Hình 4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động 4 Như vậy điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A bằng phương ph{p HPLC với đầu dò DAD là: cột sắc ký HIQ sil C18HS (250 x 4,6 mm; 5 m), bước sóng phát hiện 220 nm, pha động acetonitril - nước - acid phosphoric - amonihydroxyd (42:58:0,1:0,2), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl. Fexofenadin Tạp A Fexofenadin Tạp A Fexofenadin Tạp A Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 422 Thẩm định quy trình Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 3: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống (n=6) Mẫu Giá trị thống kê Fexofenadin Tạp A tR (phút) S (mV x giây) AS Nbk tR (phút) S (mV x giây) RS AS Nbk Chuẩn TB 8,341 3063,813 1,4 2833 12,294 240,204 5,4 1,0 3396 RSD% 0,03 1,48 0,00 0,64 0,15 0,42 0,00 1,18 0,94 Thử giả lập TB 8,277 3070,391 1,4 2739 12,211 236,521 5,4 1,1 3671 RSD% 0,08 0,18 0,00 0,51 0,17 0,52 0,95 1,04 0,99 Giả dƣợc thêm chuẩn TB 8,258 3019,065 1,4 3060 12,267 195,785 5,5 1,1 3586 RSD% 0,07 0,09 0,00 0,44 0,25 0,73 0,74 1,27 1,48 tR: thời gian lưu; S: diện tích pic; As: hệ số bất đối; Nbk: số đĩa lý thuyết biểu kiến; Rs: độ phân giải. Kết quả khảo sát cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của các thông số sắc ký của tạp A v| fexofenadin đều không quá 2%, hệ số bất đối của pic tạp A và fexofenadin nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải của pic tạp A và fexofenadin lớn hơn 1,5. Như vậy qui trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Kết quả khảo s{t tính đặc hiệu cho thấy: sắc ký đồ mẫu trắng (pha động và dung môi pha mẫu) và mẫu giả dược không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của tạp A v| fexofenadin trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn và mẫu thử xuất hiện pic fexofenadin có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ mẫu chuẩn. Pic fexofenadin có thời gian lưu kh{c ho|n to|n với thời gian lưu của tạp A trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Sắc ký đồ mẫu thử giả lập và mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn và tạp chuẩn A xuất hiện 2 pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của fexofenadin và tạp A trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Pic tạp A tách hoàn toàn với pic fexofenadin và các pic tạp khác. Sắc ký đồ mẫu khảo sát có xuất hiện pic tạp A, không xuất hiện những tạp khác và hàm lượng fexofenadin giảm khi mẫu thử bị oxy hóa bởi H2O2 3% v| được đặt trong tủ sấy 60oC trong 48 giờ. Trong các mẫu này, pic tạp A và fexofenadin vẫn tách hoàn toàn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic tạp A và fexofenadin trong sắc ký đồ mẫu thử, mẫu thử giả lập, mẫu giả dược thêm chuẩn và mẫu khảo sát giống với phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. Các pic tạp A và fexofenadin trong sắc ký đồ các mẫu đều tinh khiết (theo phổ UV-Vis). Như vậy qui trình phân tích có tính đặc hiệu. Hình 5 đến hình 16 minh họa kết quả khảo s{t tính đặc hiệu. Hình 5: Sắc ký đồ pha động Hình 6: Sắc ký đồ mẫu thử Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 423 Hình 7: Sắc ký đồ mẫu thử giả lập Hình 8: Sắc ký đồ mẫu giả dược Hình 9: Sắc ký đồ mẫu giả dược thêm chuẩn fexofenadin Hình 10: Sắc ký đồ mẫu giả dược thêm chuẩn fexofenadin và tạp A Hình 11: Sắc ký đồ mẫu thử chiếu sáng 48 giờ Hình 12: Sắc ký đồ mẫu thử chiếu UV 24 giờ Hình 13: Sắc ký đồ mẫu thử được làm ẩm 24 giờ Hình 14: Sắc ký đồ mẫu thử bị oxy hóa bởi H2O2 3% Hình 15: Sắc ký đồ mẫu thử được để ở 60oC trong 48 giờ Hình 16: Sắc ký đồ mẫu chuẩn tạp A 50 ppm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 424 Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) tạp , độ chính xác và độ đúng Bảng 4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, LOD và LOQ tạp A, độ chính xác và độ đúng Tạp A Fexofenadin Phƣơng trình hồi qui ŷ = 36,80x ŷ = 51,13x Khoảng tuyến tính (ppm) 0,5 - 10; R = 0,9990 60 - 140; R = 0,9998 LOD (ppm) 0,15 LOQ (ppm) 0,50 Độ chính xác (n=12) Nguyên liệu giả lập RSD = 1,11% RSD = 0,09% Thành phẩm giả lập RSD = 0,62% RSD = 0,04% Độ đúng * (n=9) 99,12% - 103,30%; RSD = 1,69% 97,66% - 100,53%; RSD = 0,93% * Độ đúng được thẩm định trên mẫu giả dược thêm chuẩn tại 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% của nồng độ định lượng fexofenadin và của mức giới hạn cho phép tạp A. Kết quả xử lý thống kê cho thấy giá trị F của tạp A v| fexofenadin đều lớn hơn F0,05 nên phương trình hồi quy tương thích. Gi{ trị t của hệ số B đều lớn hơn t0,05 nên giá trị B có ý nghĩa. Giá trị t của hệ số Bo nhỏ hơn t0,05 nên hệ số Bo không có ý nghĩa. Hệ số tương quan r có gi{ trị lớn hơn 0,999. Phương ph{p ph}n tích đạt yêu cầu về độ đ ng v| độ chính xác(5). Độ thô: Tiến hành sắc ký mẫu giả dược thêm fexofenadin chuẩn và tạp chuẩn A ở c{c điều kiện thay đổi như tốc độ dòng ± 0,2 ml/phút và thành phần pha động với tỷ lệ 5% so với điều kiện sắc ký thích hợp đã được lựa chọn. Kết quả khảo sát cho thấy độ phân giải giữa fexofenadin và tạp A vẫn lớn hơn 1,5; Gi{ trị RSD của thời gian lưu v| diện tích pic của fexofenadin và tạp A không quá 2%; Hệ số bất đối của pic fexofenadin và tạp A trong khoảng 0,8 – 1,5. Các kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A bằng phương ph{p HPLC đạt yêu cầu về tính phù hợp của hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của tạp A nằm dưới mức cho phép của tạp A trong chế phẩm, đạt độ chính x{c, độ đ ng v| độ thô. Như vậy quy trình này có thể được ứng dụng để định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm chứa fexofenadin. Ứng dụng quy trình định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm fexofenadin có trên thị trường Bảng 5: Kết quả định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin trên thị trường (n=4) Sản phẩm Mã hóa Hạn dùng Hàm lượng fexofenadin Hàm lượng tạp A Nguyên liệu fexofenadin NLFE 9/2019 98,40% < LOD Viên nén fexofenadin 60 mg (công ty A) CPFE 1 0/2020 96,17% 0,02% Viên nén fexofenadin 60 mg (công ty B) CPFE 1 10/2019 95,18% < LOD Viên nén fexofenadin 60 mg (công ty C) CPFE 1 3/2020 95,89% 0,01% Kết quả định lượng cho thấy h|m lượng fexofenadin trong nguyên liệu và các chế phẩm lần lượt đều nằm trong giới hạn cho phép từ 98% - 102% và nằm trong khoảng 90% - 110% so với h|m lượng nhãn; Không phát hiện pic tạp A trên sắc ký đồ mẫu nguyên liệu và một mẫu chế phẩm; Trong hai chế phẩm còn lại, h|m lượng tạp A đều dưới mức giới hạn cho phép (0,4%). BÀN LUẬN Một khó khăn trong định lượng tạp A là mức giới hạn cho phép của tạp A rất nhỏ so với dược chất. Điều n|y đòi hỏi điều kiện sắc ký phải được lựa chọn sao cho độ phân Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 425 giải giữa pic dược chất và pic tạp chất phải lớn hơn rất nhiều so với giá trị quy định là 1,5. Điều kiện sắc ký để tách hoàn toàn fexofenadin và tạp A trong nghiên cứu này là acetonitril - nước - acid phosphoric - amoni hydroxyd (42:58:0,1:0,2), so với dung môi pha động sử dụng trong dược điển Anh v| dược điển Mỹ với hỗn hợp acetonitril và dung dịch đệm thì điều kiện n|y kh{ đơn giản, không mất nhiều thời gian phải rửa hệ thống sắc ký so với pha động có dung dịch đệm v| tr{nh g}y ăn mòn hệ thống. Cột sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là cột C18, so với cột phenyl trong USP và BP thì cột C18 thông dụng hơn, có ở hầu hết tất cả các phòng thí nghiệm tuyến tỉnh và tuyến trung ương. Thứ tự rửa giải của fexofenadin và tạp A trong nghiên cứu này lần lượt là fexofenadin khoảng 8 phút và tạp A khoảng 12 phút. So với điều kiện sắc ký trong USP và BP thì thời gian lưu của fexofenadin khoảng 9 phút và thời gian lưu tương đối của pic tạp A so với pic fexofenadin là 1,7. Như vậy, thời gian sắc ký trong nghiên cứu này ngắn hơn (trước 15 phút) so với trong dược điển (hơn 15 ph t). Tốc độ dòng trong nghiên cứu này là 0,8 ml/phút nhỏ hơn trong dược điển (1,2 -1,5 ml/ph t). Điều này giúp tiết kiệm thời gian và dung môi trong quá trình phân tích mẫu. Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định lượng fexofenadin và tạp A đ{p ứng đầy đủ yêu cầu của một quy trình kiểm nghiệm tạp chất liên quan trong nguyên liệu và thành phẩm nên có thể được ứng dụng để kiểm tra fexofenadin và tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm trên thị trường. Ở một số điều kiền khắc nghiệt (H2O2 3%/48 giờ và 60 oC/48 giờ), fexofenadin bị phân phân hủy tạo thành tạp A và một số tạp khác. Trong trường hợp n|y, quy trình định lượng được xây dựng trong nghiên cứu vẫn thể hiện tính đặc hiệu. KẾT LUẬN Quy trình định lượng đồng thời fexofenadin và tạp A bằng phương ph{p HPLC đã được xây dựng và thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng v| pha động không có dung dịch đệm. Quy trình đã được ứng dụng để định lượng fexofenadin và kiểm tra tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa fexofenadin đang có trên thị trường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. British Pharmacopoeia (2016), CD-ROMs, monograph 2280. 2. Hadir MM, Maha AS, Ileana VO (2011), “Development of validated stability-indicating chromatographic method for the determination of fexofenadine hydrochloride and its related impurities in pharmaceutical tablets”, Chemistry Central Journal, 5(1):76, 1-10. 3. Jiangang M, Haining G, Pengfei Z (2008), “A Novel and Efficient Synthesis of Intermediates for the Preparation of Fexofenadine”, Scholar Research Exchange, Article ID 137091. 4. LGC Limited (2015). Đường link https://hybris-static-assets- production.s3-eu-west-1.amazonaws.com/sys-master/pdfs/h1b/ ha4/9439042535454/en_ST-WB-CERT-2235280-1-1-1.PDF. Ngày truy cập: 26/08/2017. 5. Ludwig Huber (2007), “Validation and qualification in analytical laboratories, second edition”, pp. 144, 146. 6. Siva RPV, Dnyandev RR, Narendra DM, Venkateswar K, Ramesh KS, Debashish D (2009), “Process for the preparation of 4-[4-(4-(hydroxydiphenylmethyl)- 1-piperidinyl]-1-oxobutyl]- α,α-dimethylbenzen acetic acid methyl ester and use there of”, Patent No. WO 2009136412 A2. 7. USP 40 – NF 35 (2017), monographs fexofenadine, fexofenadine tablets, fexofenadine capsules, pp. 4183, 4188. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018