Xây dựng quy trình giải trình tự xác định đột biến điểm của gen Dystrophin ở bệnh nhân mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 508 XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ XÁC ĐỊNH   ĐỘT BIẾN ĐIỂM CỦA GEN DYSTROPHIN   Ở BỆNH NHÂN MẮC BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE  Nguyễn Thị Băng Sương*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD: Duchenne muscular dystrophy) là bệnh di truyền lặn liên  kết giới tính X, gây nên bởi đột biến gen dystrophin. Dạng đột biến phổ biến nhất là đột biến xóa đoạn gen, chiếm  tỷ lệ 60‐65%. Đột biến điểm đứng thứ hai về mức độ thường gặp, chiếm 20‐30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng 10‐ 15%. Việc phát hiện đột biến điểm chưa được thực hiện rộng rãi tại Việt Nam do khó khăn trong việc xây dựng  quy trình chẩn đoán.  Mục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự phát hiện đột biến điểm của gen dystrophin  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai gia đình bệnh nhân mắc bệnh DMD, hai bệnh nhân này  được  phân  tích  gen  dystrophin  bằng  kỹ  thuật MLPA nhưng  không  có  đột  biến mất  đoạn  và  lặp  đoạn  gen  dystrophin.  Ly  trích DNA  của  hai  bệnh  nhân  cùng  hai  người mẹ,  tiến  hành  giải  trình  tự  trực  tiếp  gen  dystrophin để phát hiện đột biến điểm.  Kết quả: Một bệnh nhân bị đột biến tại vị trí p.E2468X, một bệnh nhân đột biến dạng p.N2414fr*X2425.  Kết luận: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự để xác định đột biến điểm của gen dystrophin, đây  là tiền đề giúp ứng dụng xác định bản đồ đột biến gen dystrophin trên các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne  tại Việt Nam.  Từ khóa: DMD, loạn dưỡng cơ Duchenne, dystrophin, đột biến điểm  ABSTRACT  ESTABLISH SEQUENCING PROCEDURE TO IDENTIFY DYSTROPHIN GENE POINT MUTATION   CAUSING DUCHENE MUSCULAR DYSTROPHY  Nguyen Thi Bang Suong* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 508 ‐ 513  Introduction: Duchenne muscular dystrophy (DMD)  is a recessive X‐linked form of muscular dystrophy  caused by mutations on dystrophin gene. DMD disease results in muscle degeneration and eventual death. The  most common dyptrosin gene mutation is deletion, accounting for 60‐65%. Point mutation is the second common  mutation which accounting for 20‐30%. Duplication attributes about 10‐15% mutations. The detection of point  mutations has not been widely applied in Vietnam because of difficulties in establishing diagnostic procedures.  Objective: Establish diagnosis procedure to identify point mutations on dystrophin gene.   Patients and Methods: Two DMD patients whosedystrophin genes were analyzed by MLPA method but  no  deletion  or  duplication mutants were  identified. The DNA  of  these  two  patients  and  their mothers were  sequenced to found point mutants.   Results: One patient carries p.E2468X mutant, the other patient have p.N2414fr*X2425 mutant.  Conclusion: Successfully establishing sequencing procedure to diagnose point mutations of the dystrophin  gene, which is the premise for mapping mutations in dystrophin gene of Duchenne Vietnam patients.   Keywords: DMD, Duchenne muscular dystrophy, dystrophin gene, point mutation.   * Bộ môn Hóa sinh, Trung Tâm Y Sinh Học Phân Tử, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: TS. BS. Nguyễn thị Băng Sương, ĐT: 0914007038 Email: suongnguyenmd@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhi Khoa 509 ĐẶT VẤN ĐỀ  Loạn  dưỡng  cơ  Duchenne  (DMD:  Duchenne muscular dystrophy)  là bệnh  lý  cơ  do  di  truyền  với  tần  suất  bệnh  vào  khoảng  1/3500  trẻ  trai. Đây  là bệnh di  truyền  lặn  liên  kết  giới  tính,  gây  nên  bởi  đột  biến  gen  dystrophin. Gen này nằm trên nhiễm sắc thể X  ở  locus  Xp21,  gồm  79  exon  với  7  promoter  khác nhau. Gen dystrophin sao mã  ra mRNA  14kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng  là  dystrophin.  Đột  biến  gen  làm  ảnh  hưởng  đến  quá  trình  tổng  hợp  protein  dystrophin,  cấu  trúc  protein  thay  đổi  và mất  chức  năng  bảo  vệ  tế  bào  cơ, do  vậy  tế  bào  cơ  của  bệnh  nhân  bị  tổn  thương(9). Triệu  chứng  điển  hình  của bệnh DMD là yếu cơ đối xứng gốc chi, teo  cơ tiến triển và bệnh nhân thường tử vong do  suy  hô  hấp.  Bên  cạnh  đó  nồng  độ  enzyme  creatine kinase  tăng cao do  tế bào cơ bị  thoái  hóa. Theo các nhà nghiên  cứu, dạng  đột biến  phổ  biến  nhất  xảy  ra  trên  gen  dystrophin  là  đột biến xóa đoạn gen, chiếm tỷ lệ 60‐65%. Đột  biến  điểm  đứng  thứ  hai  về mức  độ  thường  gặp, chiếm 20‐30%. Đột biến lặp đoạn, khoảng  10‐15%(9,11). Hiện  nay  có  nhiều  phương  pháp  giúp  chẩn  đoán  đột  biến  mất  đoạn  gen  dystrophin  như  kỹ  thuật  multiplex  PCR  (polymerase  chain  reaction), RT‐PCR  (reverse  transcriptase PCR), MLPA  (multiplex  ligation  probe  amplification),...Trong  đó,  kỹ  thuật  MLPA  được  đánh  giá  cao  khi  ứng  dụng  để  chẩn đoán đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen  dystrophin. Ở Việt Nam, đã có nhiều tác giả sử  dụng kỹ thuật multiplex PCR và MLPA để xác  định  đột  biến  mất  đoạn  gen  gây  bệnh  loạn  dưỡng cơ Duchenne(4, 5).   Để  phát  hiện  đột  biến  điểm  của  gen  dystrophin,  kỹ  thuật  giải  trình  tự  thường  được sử dụng và có hiệu quả cao(3). Tại Việt  Nam, việc chẩn đoán đột biến điểm của gen  dystrophin  gặp  nhiều  khó  khăn  do  kích  thước gen khá lớn (gồm 79 exon), vì vậy đa  số  phòng  xét  nghiệm  Sinh  học  phân  tử  không xây dựng quy  trình  chẩn  đoán này.  Tuy nhiên, dạng đột biến điểm chiếm  tỷ  lệ  20‐30%  ở  bệnh  nhân  Duchenne  nên  việc  chẩn đoán chính xác dạng và vị trí đột biến  của  gen  dystrophin  ở  bệnh  nhân DMD  là  điều  rất  cần  thiết,  từ  đó  có  thể  giúp  chẩn  đoán  người  lành mang  gen  và  chẩn  đoán  trước  sinh  cho  thai  nhi.  Bên  cạnh  đó  nếu  không xây dựng quy trình xác định đột biến  điểm chúng ta sẽ không xác định được bản  đồ  đột  biến  gen  dystrophin  trên  các  bệnh  nhân DMD Việt Nam. Xuất phát từ thực tiễn  đó chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục  tiêu: “Xây dựng kỹ thuật giải trình tự xác định  đột biến điểm của gen dystrophin”.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Gồm 2 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh  loạn dưỡng cơ Duchenne trên  lâm sàng với các  triệu chứng sau: Yếu cơ tiến triển nặng dần, dấu  hiệu giả phì  đại  cẳng  chân, khó  leo  cầu  thang,  dấu  hiệu  Gower  dương  tính.  Định  lượng  CK  huyết thanh tăng cao (tăng ít nhất 40 lần so bình  thường), xét nghiệm đo điện cơ đồ có biểu hiện  bệnh lý Duchenne.  Hai bệnh nhân này  đã  được phân  tích gen  dystrophin bằng kỹ  thuật MLPA nhưng không  phát hiện được đột biến mất đoạn và  lặp đoạn  gen dystrophin.  Phương pháp nghiên cứu  ‐ Thiết kế nghiên cứu: mô tả loạt ca  ‐ Các kỹ thuật thực hiện:  Ly trích DNA từ máu ngoại vi  Lấy 2 ml máu tĩnh mạch của các bệnh nhân  và mẹ bệnh nhân cho vào ống nghiệm có chứa  chất  chống  đông  EDTA.  Sau  đó  tiến  hành  ly  trích DNA từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi theo  quy trình của kit QiAgen.  Tiến hành phản ứng PCR  Tiến  hành  khuếch  đại  toàn  bộ  gen  dystrophin bằng các cặp mồi  đặc hiệu, các cặp  mồi  được  chúng  tôi  thiết  kế  bằng  phần mềm  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 510 LightScanner  Primer  Design.  Các  mồi  được  kiểm  tra  nhiệt  độ  bắt  cặp,  không  có  các  SNP  (single  nucleotide  polymorphism),  không  tạo  cấu trúc hairpin và dimer.  Điện di sản phẩm PCR trên agarose 1,5% để  kiểm tra kết quả của phản ứng khuếch đại: Phản  ứng PCR được  tối ưu hóa về  thành phần phản  ứng, chu kỳ luân nhiệt sao cho sản phẩm điện di  chỉ xuất hiện 1 băng ứng với kích thước của sản  phẩm khuếch  đại. Băng  điện di  rõ,  có bờ  đều,  sắc gọn, không có băng phụ.  Giải trình tự gen dystrophin  ‐ Tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng kit của  hãng QiAgen   ‐ Thực hiện phản ứng cycle sequencing với  BigDye  version  3.1  của  công  ty  Applied  Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược:  ‐ Đọc trình tự DNA bằng máy sequencer ABI  PRISMR 3500.  ‐ Phân tích kết quả, so sánh trình tự chuẩn từ  NCBI Blast server để chẩn  đoán  tình  trạng  đột  biến  của  các  exon,  trình  tự  chuẩn  của  gen  dystrophin mang accession number NG_012232.  KẾT QUẢ  Kết quả của gia đình bệnh nhân DMD 28  Kết quả giải trình tự của bệnh nhân DMD 28  Hình 1: Kết quả giải trình tự exon 51 của bệnh nhân DMD_28  Nhận  xét:  Tại  vị  trí  c.7402,  nucleotid  của  genbank  là G,  trong  khi  đó  của  bệnh  nhân  là  nucleotid T. Đột biến  làm  thay  đổi  codon 2468  bình  thường  là  GAG  (mã  hóa  cho  acid  amin  glutamin) thành TAG là codon kết thúc, làm quá  trình  tổng  hợp  protein  dystrophin  bị  kết  thúc  sớm. Đột biến được ký hiệu  là p.E2468X và đã  được Hwa công bố vào năm 2008(6).  Kết quả giải trình tự của mẹ bệnh nhân DMD 28  Hình 2: Kết quả phân tích exon 51 của mẹ bệnh nhân  GenBank Mẹ BN DMD 28 GenBank BN MD 28 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhi Khoa 511 Nhận xét: Kết quả của mẹ bệnh nhân DMD  28 cho thấy, tại vị trí c.7402 mà bệnh nhân bị đột  biến, chúng ta thấy xuất hiện sóng đôi, trong đó  1  đỉnh  tương  ứng  với  nucleotid  G  (giống  genbank) và 1 đỉnh nucleotid T (giống kết quả bị  đột biến ở bệnh nhân). Điều này chứng tỏ người  mẹ bị đột biến dị hợp tử tại c.7402G>T, và người  mẹ đã truyền allele bị bệnh cho con trai là bệnh  nhân DMD 28.  Kết quả của gia đình bệnh nhân DMD 45  Hình 3: Kết quả phân tích exon 50 của bệnh nhân DMD 45 và người mẹ  Nhận xét:  ‐  Đối  với mẫu  bệnh  nhân: Vị  trí  c.7241  và  c.7242 của genbank lần lượt là 2 nucleotid A và  C,  tuy  nhiên  ở  bệnh  nhân  không  xuất  hiện  2  nucleotid này. Ngoài  ra, nucleotid vị  trí  c.7243  bình thường  là C bị thay đổi thành T. Đột biến  này làm xuất hiện codon kết thúc tại codon 2425.  Đột biến có ký hiệu là p.N2414fr*X2425.  ‐ Đối với mẹ bệnh nhân: tại vị trí c.7243 bắt  đầu xuất hiện  sóng  đôi, phân  tích  trình  tự  các  đỉnh  chúng  ta  nhận  thấy mẹ  bệnh  nhân  có  1  allele bình thường (trình tự giống genbank) và 1  allele bị đột biến (có trình tự giống bệnh nhân).  BÀN LUẬN  Loạn dưỡng cơ Duchenne là bệnh di truyền  liên  kết  với  nhiễm  sắc  thể  giới  tính X,  do  đột  biến gen Dystrophin nằm trên nhiễm sắc thể giới  tính X, do vậy bệnh  thường biểu hiện ở  trẻ em  và hiếm khi gặp ở  trẻ nữ. Các nhà nghiên cứu  khẳng định, đột biến chủ yếu của gen là đột biến  xóa đoạn gen, chiếm  tỷ  lệ 60‐65%, đột biến  lặp  đoạn chiếm khoảng 10‐15%, phần còn lại là đột  biến điểm, đột biến nhỏ hoặc đột biến  tại vị  trí  cắt nối  intron‐exon(9). Do  tần suất phân bố kiểu  đột biến như vậy nên quy  trình chẩn đoán đột  biến  gen  dystrophin  được  bắt  đầu  bằng  việc  chẩn đoán đột biến mất đoạn, có nhiều phương  pháp để phát hiện kiểu đột biến này, năm 2010  Madania đã phối hợp 2 phương pháp multiplex  PCR  và  real  time  PCR  để  chẩn  đoán  đột  biến  mất  đoạn  gen  dystrophin(8).  Bên  cạnh  đó  các  nghiên  cứu  cho  thấy  kỹ  thuật  MLPA  có  rất  nhiều ưu điểm trong nghiên cứu bệnh DMD, vì  ngoài việc phát hiện đột biến mất đoạn, nó còn  giúp phát hiện các đột biến lặp đoạn gen(5,2). Một  trong những trở ngại lớn của việc chẩn đoán di  truyền  bệnh DMD  là  việc phân  tích phát  hiện  đột biến điểm, đây là nguyên nhân thường gặp  thứ  hai  sau  đột  biến  mất  đoạn.  Do  gen  GenBank BN DMD_45 Mẹ DMD_45 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em 512 dystrophin  là  một  gen  lớn,  cấu  trúc  gồm  79  exon, trong khi đó đột biến điểm lại rải rác khắp  chiều dài gen chứ không tập trung tại các vùng  trọng  điểm  như  đột  biến  mất  đoạn  nên  việc  phân  tích rất  tốn kém về công sức và  thời gian  cũng  như  kinh  phí.  Năm  2006,  Hamed  cùng  cộng sự đã xây dựng quy trình RT‐PCR để giải  trình  tự  cDNA  của gen dystrophin. Hamed  đã  thiết kế 76 đoạn mồi gắn đặc hiệu với phân  tử  cDNA, sau đó tác giả khuếch đại cDNA và giải  trình  tự  toàn  bộ  vùng  gen  mã  hóa  của  dystrophin. Nghiên cứu này đã phát hiện được  10 bệnh nhân bị đột biến điểm và đột biến nhỏ(3).  Ở Việt Nam, vào năm 2009, nhóm nghiên  cứu  chúng  tôi đã ứng dụng kỹ  thuật RT‐PCR  trong  chẩn  đoán  đột  biến  mất  đoạn  của  gen  dystrophin(10).  Tuy  nhiên  kỹ  thuật RT‐PCR  đòi  hỏi nhiều công đoạn, kinh nghiệm cũng như kỹ  năng cao của người phân tích, do vậy tỷ lệ thành  công của kỹ thuật không cao. Trong nghiên cứu  của  Hamed,  tác  giả  phân  tích  15  bệnh  nhân  DMD không có đột biến mất đoạn và  lặp đoạn  gen  dystrophin,  nhưng  chỉ  phát  hiện  10  bệnh  nhân  bị  đột  biến  điểm,  trong  khi  đó  theo  lý  thuyết thì hầu hết các bệnh nhân này phải có đột  biến  điểm. Trong nghiên  cứu  trước  của  chúng  tôi,  kỹ  thuật  RT‐PCR  chỉ  phát  hiện  được  50%  bệnh nhân DMD bị đột biến mất đoạn(10), trong  khi đó nếu ứng dụng kỹ  thuật MLPA  thì  tỷ  lệ  này là 63,6%(2). Do các hạn chế đó nên một số tác  giả vẫn sử dụng kỹ thuật giải trình tự trên DNA  của  vùng  gen  dystrophin(12),  trong  nghiên  cứu  này chúng tôi cũng ứng dụng giải trình tự trực  tiếp trên phân tử DNA.   Đối  với  gia  đình  bệnh  nhân  thứ  nhất,  khi  phân tích kết quả giải trình tự exon 51 của bệnh  nhân  DMD  28  chúng  ta  nhận  thấy  tại  vị  trí  c.7402, nucleotid của genbank là G, trong khi đó  của bệnh nhân là nucleotid T. Đột biến làm thay  đổi  codon  2468  bình  thường  là GAG  (mã  hóa  cho  acid  amin  glutamin)  thành  TAG  là  codon  kết  thúc,  làm  quá  trình  tổng  hợp  protein  dystrophin  bị  kết  thúc  sớm.  Việc  tổng  hợp  protein  dystrophin  bị  cắt  cụt  sẽ  làm mất  chức  năng  của  protein,  làm  protein  không  bảo  vệ  được tế bào cơ, do vậy tế bào cơ bị thoái hóa dần  và gây nên bệnh lý DMD. Kiểm tra kết quả trên  NCBI chúng tôi xác định đột biến này đã được  Hwa  công  bố  vào  năm  2008  trên  tạp  chí  J  Formos Med Assoc(6). Đột biến được ký hiệu  là  p.E2468X. Một đặc điểm của bệnh nhân DMD là  2/3 bệnh nhân nhận gen bệnh từ người mẹ mang  kiểu gen dị hợp tử, 1/3 bệnh nhân là do đột biến  mới phát sinh. Do vậy khi phát hiện đột biến ở  bệnh nhân chúng ta phải kiểm tra kiểu gen của  người mẹ  xem  có mang  gen  bệnh  hay  không,  điều này rất quan  trọng  trong  tư vấn di  truyền  cũng như giúp chẩn đoán trước sinh bệnh DMD.  Kết quả của mẹ bệnh nhân DMD 28 cho thấy, tại  vị trí c.7402 mà bệnh nhân bị đột biến xuất hiện  sóng  đôi,  trong  đó  1  đỉnh  tương  ứng  với  nucleotid G (giống genbank) và 1 đỉnh nucleotid  T (giống kết quả bị đột biến ở bệnh nhân).Điều  này chứng tỏ người mẹ bị đột biến dị hợp tử tại  c.7402G>T, và người mẹ đã truyền allele bị bệnh  cho con trai là bệnh nhân DMD 28.  Đối với gia đình thứ hai, kết quả giải trình tự  của bệnh nhân DMD 45 cho thấy ở vị trí c.7241  và c.7242 của genbank lần lượt là 2 nucleotid A  và C, tuy nhiên ở bệnh nhân không xuất hiện 2  nucleotid này. Ngoài  ra, nucleotid vị  trí  c.7243  bình thường là C bị thay đổi thành T. Đột biến ở  bệnh nhân  làm  thay  đổi  codon 2414 AAC  (mã  hóa cho acid amin asparagine)  thành ATG  (mã  hóa  cho  acid  amin methionine),  đồng  thời gây  lệch  toàn bộ khung  đọc kể  từ  codon  2414  đến  codon 2425, và codon 2425 là TAG, đây là codon  kết  thúc.  Như  vậy  sự  tổng  hợp  protein  dystrophin bị cắt cụt,  làm  thay đổi cấu  trúc và  chức năng của protein dystrophin và gây bệnh  DMD.  Dạng  đột  biến  này  được  ký  hiệu  là  p.N2414fr*X2425. Đối với mẹ bệnh nhân:  tại vị  trí c.7243 bắt đầu xuất hiện sóng đôi, phân  tích  trình  tự  các  đỉnh  chúng  ta nhận  thấy mẹ bệnh  nhân  có  1  allele  bình  thường  (trình  tự  giống  genbank)  và  1  allele  bị  đột  biến  (có  trình  tự  giống bệnh nhân). Như vậy  chúng  ta kết  luận  người mẹ mang kiểu gen dị hợp  tử và  truyền  gen bệnh cho con trai.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  Nghiên cứu Y học Nhi Khoa 513 KẾT LUẬN  Cùng  với  việc  ứng  dụng  thành  công  quy  trình MLPA trong chẩn đoán đột biến mất đoạn  và  lặp đoạn gen dystrophin đã được chúng  tôi  công bố trong nghiên cứu trước(2), việc xây dựng  thành công quy trình giải trình tự để phát hiện  đột  biến  điểm  và  đột  biến  nhỏ  của  gen  dystrophin đã giúp cho việc chẩn đoán di truyền  bệnh DMD ngày  càng hoàn  thiện hơn.  Đây  là  tiền  đề  cho việc  thiết  lập bản  đồ  đột  biến  gen  dystrophin tại Việt Nam.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bennett  RR, Schneider  HE, Estrella  E, Burgess  S, Cheng  AS, Barrett C, Lip V, Lai PS, Shen Y, Wu BL, Darras BT,Beggs  AH, Kunkel  LM  (2009).Automated DNA mutation detection  using  universal  conditions  direct sequencing:  application  to  ten muscular dystrophy genes.BMC Genet. 10:66.  2. Đỗ  Thị Thanh Thủy, Nguyễn Thị Băng  Sương, Trần Thụy  Vân Ngọc  (2013).Nghiên cứu ứng dụng kỹ  thuật MLPA để  xác  định  đột biến mất  đoạn gen Dystrophin gây bệnh  loạn  dưỡng cơ Duchenne, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 17(1),  trang 83‐91.  3. Hamed  SA, Hoffman  EP  (2006).  Automated  sequence  screening  of  the  entire  dystrophin  cDNA  in  Duchenne  dystrophy: point  mutation detection.Am  J  Med  Genet  B  Neuropsychiatr Genet. 5;141B(1):44‐50.  4. Hung  CC,  Chen  CP,  Lin  CP,  Chen  SC,  et  al  (2006).  Quantitative  assay  of  deletion  or  duplication  genotype  by  capillary  electrophoresis  system:  application  in Prader‐Willi  syndrome and Duchenne muscular dystrophy, Clin Chem, 52,  pp. 2203‐10.  5. Hwa  HL,  Chang  YY,  Chen  CH,  et  al  (2007).  Multiplex  Ligation‐dependent  Probe  Amplification  identification  of  deletions  and  duplications  of  the  Duchenne  muscular  dystrophy  gene  in  Taiwanese  subjects,  J Formos Med Assoc,  106, pp. 339‐46.  6. Hwa HL, Chang  YY, Huang  CH, Chen  CH, Kao  YS, Jong  YJ, Chao MC, Ko  TM  (2008).  Small mutations  of  the DMD  gene in Taiwanese families.J Formos Med Assoc. 107(6):463‐9.  7. Laing  NG, Davis  MR, Bayley  K, Fletcher  S, Wilton  SD  (2011).Molecular diagnosis of duchenne muscular dystrophy:  past,  present  and  future  in  relation  to  implementing  therapies.Clin Biochem Rev. 32(3):129‐34.  8. Madania  A, Zarzour  H, Jarjour  RA, Ghoury  I  (2010).  Combination  of  conventional  multiplex PCR and  quantitative real‐time  PCR detects  large  rearrangements  in  the  dystrophin  gene  in  59%  of  Syrian DMD/BMD  patients.Clin Biochem. 2010 Jul;43(10‐11):836‐42.   9. Matsuo M. (2002). Duchenne and Becker muscular dystrophy:  from molecular  diagnosis  to  gene  therapy,  IUBMB Life,  53,  pp.147‐52.  10. Nguyễn Thị Băng Sương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà,  Tạ  Thành  Văn  (2009).  Xác  định  đột  biến  mất  đoạn  gen  dystrophin ở mức độ mRNA, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh,  13(2): 66‐72.  11. Prior TW, Bridgeman SJ  (2005). Experience and  strategy  for  the  molecular  testing  of  Duchenne  muscular  dystrophin,  JMD, 7, pp.317‐25.  12. Stockley TL, Akber S, Bulgin N, Ray PN  (2006). Strategy  for  comprehensive molecular  testing  for Duchenne  and Becker  muscular dystrophies.Genet Test;10(4):229‐43.  Ngày nhận bài báo: 01/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo: 25/11/2013  Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014