Xây dựng quy trình khuếch đại và giải trình tự gen APC

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 100 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN APC  Đoàn Nam Khánh*, Nguyễn Ngọc Minh**, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Trung Tín**, Đỗ Thị Thanh Thủy**,  Lê Thị Hương Lan***, Nguyễn Thị Băng Sương**  TÓM TẮT  Giới thiệu: Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u gồm 15 exon nằm tại vị  trí 5q21‐q22, sản phẩm dịch mã của gen là protein APC dài 2843 acid amin. Protein APC với vai trò chính là cô  lập các hiệu ứng kích thích tăng trưởng của Beta‐catenin nhằm thúc đẩy sự chết theo chương trình của tế bào.  Người mang gen APC bị đột biến sẽ dẫn đến một số bệnh liên quan như bệnh đa polyp đại trực tràng, bệnh ung  thư hệ tiêu hóa, các tuyến, các cơ quan (não, gan, tuyến thượng thận, tuyến tụy, tuyến giáp,) và một số bệnh  bẩm sinh khác.  Mục tiêu: Xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ 15 exon của gen APC bằng phản ứng PCR và giải trình  tự gen APC.   Đối tượng và phương pháp: DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của 15 người khỏe mạnh. Các exon của  gen được khuếch đại bằng 29 cặp mồi, sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả  được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.   Kết quả: Xây dựng thành công quy trình PCR khuếch đại 15 exon của gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu  là 59oC, độ nhạy của quy trình là 1 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự cho kết quả tương đồng với trình tự gen APC  chuẩn trên NCBI.  Kết luận: Xây dựng thành công quy trình khuếch đại và giải trình tự toàn bộ gen APC.   Từ khóa: gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự.  ABSTRACT  ESTABLISH PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING APC GENE  Doan Nam Khanh, Nguyen Ngoc Minh, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Do Thi Thanh Thuy,   Le Thi Huong Lan, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ No 4 ‐ 2014: 100 ‐ 106  Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons locating  at 5q21‐q22. The 2843 amino‐acid APC protein plays an  important role  in regulating  the Beta‐catein growth  signal  factor and  leads  cells  to normal  apoptosis. Mutations  in APC gene  cause  colorectal polyposis diseases,  cancer diseases in digestive system, in Endocrine System (pancreas, thyroid, adrenal gland) and cancer in other  organs (brain, liver,).  Aim: Establish protocol to amplify all 15 exons of APC gene by PCR method, then identify all sequences of  APC gene.  Objects and Methods: DNA was extracted from peripheral blood of 15 healthy people. 15 exons of APC  gene were ampliflied by 29 pairs of primer, then sequenced by ABI system. Results were analysed by specialist  software.   Results: PCR method for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at  59oC and protocol has sensitivity of 1 ng /μL. Sequencing products are identical to standard sequence database of  APC gene from NCBI genbank.   * Khoa Sinh học, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh,   ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh,  *** Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên  Tác giả liên lạc: TS. BS. Nguyễn Thị Băng Sương,   ĐT: 0913281386, Email: suongnguyenmd@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học 101 Conclusion: We have successfully established the protocol  for amplifying and identifying all sequences of  APC gene.   Key words: APC gene, amplify gene, sequencing protocol.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Gen APC (adenomatous polyposis coli gene)  là một gen ức chế khối u có  tổng cộng 15 exon  nằm trên cánh dài của NST số 5. Trong đó exon  15 có kích thước lớn nhất, bao gồm 6574 bp (base  pair),  chiếm  75%  trình  tự mã  hóa  protein  của  gen. Gen APC  tổng hợp protein APC dài  2843  acid  amin(2,3).  Protein  APC  tham  gia  vào  con  đường  truyền  tín hiệu Wnt  điều hòa quá  trình  phân chia tế bào và đổi mới tổ chức mô. Sự kết  hợp giữa protein APC và beta‐catenin trong con  đường tín hiệu này sẽ phân hủy, ức chế vai trò  của beta‐catenin,  điều hòa quá  trình phân  chia  và hướng tế bào đến sự chết theo chương trình(1).  Việc mất chức năng của protein APC do đột biến  dòng mầm trong gen làm tích tụ quá mức Beta‐ catenin  trong  tế  bào,  kích  thích  sự  phát  triển,  phân  chia  không  kiểm  soát  của  tế  bào  và dẫn  đến  sự hình  thành  của  các khối u(2). Đa  số đột  biến gen APC là đột biến vô nghĩa hoặc gây lệch  khung dịch mã, điều này dẫn đến protein APC  bị cắt ngắn, mất chức năng ức chế khối u(6). Do  đó, người mang gen APC bị đột biến sẽ có nguy  cơ cao mắc một số bệnh liên quan như bệnh đa  polyp tuyến gia đình (FAP) với hàng trăm polyp  trong  đại  trực  tràng  và  95‐100%  nguy  cơ  tiến  triển  thành  ung  thư  đại  trực  tràng  dưới  40  tuổi(2,5). Ngoài ra, đột biến gen APC còn gây các  bệnh như bệnh đa polyp tuyến thể nhẹ (AFAP)  có số lượng polyp ít hơn trong khoảng 10 – 100  polyp(2); u xương lành tính; thêm, mất răng hoặc  răng mọc ngầm dưới hàm; phì đại biểu mô sắc  tố võng mạc bẩm sinh  (CHRPE) và nhiều bệnh  ung thư khác; cá biệt như ung thư gan ở trẻ em  dưới 5 tuổi(2,5).  Đột  biến dòng mầm  trong  gen APC  là  đột  biến trội nên chỉ cần có đột biến ở một trong hai  allen  cũng  có  khả  năng  gây  bệnh,  nếu  không  được phát hiện kịp thời thì bệnh sẽ chuyển sang  các giai đoạn muộn, gây khó khăn cho quá trình  điều trị, cũng như tỷ lệ sống sót thấp(1,3). Do đó,  việc chẩn đoán sớm đột biến gene APC sẽ giúp  người  bệnh,  đặc  biệt  là  người  thân  của  bệnh  nhân  có  thể  chủ  động  trong  việc  thăm  khám  định kỳ các bệnh ung thư  liên quan(2,5). Theo cơ  sở dữ liệu về các đột biến gen APC được công bố  hiện nay, có khoảng 96% các đột biến là đột biến  nhỏ nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen, trong  đó có 38% là đột biến điểm. Với các đột biến nhỏ,  xảy  ra  trên  1  exon,  phương  pháp  hiệu  quả  và  chính  xác  nhật  để  xác  định  đột  biến  gen  là  phương pháp giải  trình  tự. Bằng cách sử dụng  phản ứng PCR khuếch đại 15 exon của gen APC  và kỹ  thuật giải  trình  tự  toàn bộ các exon này,  chúng tôi tiến hành chuẩn hóa các điều kiện cần  thiết  để  thực hiện  đề  tài:  “Xây dựng quy  trình  khuếch đại và giải trình tự gen APC ”.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu   Mẫu máu  của 15 người khỏe mạnh không  có họ hàng, không bị bệnh đường tiêu hóa. Gia  đình không có tiền sử ung thư đại trực tràng.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế và kiểm tra mồi  Dùng  phần  mềm  LightScanner  Primer  Design thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại  15 exon của gene APC và quanh vị  trí splicing.  Mồi sau khi thiết kế sẽ được kiểm tra bằng phần  mềm  SNPCheck3  (kiểm  tra  sự  hiện  diện  của  SNP trên mồi), dùng công cụ OligoAnalyzer 3.1  của IDT® để kiểm tra các giá trị ΔG của cấu trúc  thứ  cấp.  Các  giá  trị  về  chiều  dài, % GC,  Tm,  chiều dài của mồi đều được kiểm tra khi thiết kế  mồi  trên  phần  mềm  LightScanner  Primer  Design.  Tính  đặc  hiệu  của mồi  được  kiểm  tra  bằng công cụ Primer‐BLAST trên NCBI.  Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi   Máu ngoại vi khi  thu nhận được giữ  trong  ống chống đông bằng EDTA nắp xanh dương và  được ly trích trong vòng 24 giờ. Sử dụng bộ kit  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 102 QiAamp DNA blood mini kit của hãng Qiagen –  Đức  để  ly  trích DNA.  Sản phẩm  ly  trích  được  tiến  hành  kiểm  tra  độ  nguyên  vẹn  của mạch  bằng phương pháp điện di trên gel agarose 3%,  đo  nồng  độ  và  độ  tinh  sạch  bằng  máy  NanoDrop 2000.   Kỹ thuật khuếch đại các exon của gen APC  Dùng  phương  pháp  PCR  khuếch  đại  gen  APC (máy Gene Amp PCR System 9700‐USA).   Thành phần  của phản  ứng PCR gồm 20  μl  chứa các  thành phần: DNA khuôn; 0,2 mmol/L  dNTP; 1,5 mmol/L Mg++; 0,1‐0,2 μmol/L primer  và 1‐1,5 đơn vị Taq polymerase.  Chu  trình nhiệt  của phản  ứng: Biến  tính  ở  94°C trong 5 phút, tiếp theo là 35‐40 chu kỳ gồm  biến  tính ở 94°C  trong 30 giây; gắn mồi ở 60°C  trong 30 giây và bước kéo dài 72°C trong 30 giây,  cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5  phút và bảo quản tạm thời ở 4°C.  Kết quả PCR sau đó được kiểm chứng bằng  phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.  Kỹ thuật giải trình tự gen  Thực  hiện  phản  ứng  cycle  sequencing  với  BigDye  version  3.1  của  công  ty  Applied  Biosystems,  theo  2  chiều  xuôi  và  ngược,  giải  trình tự DNA (máy sequencer ABI 3500).  Phân tích kết quả giải trình tự  Kết  quả  giải  trình  tự  được  phân  tích  bằng  phần mềm CLC Main Workbench 5 và so sánh  với trình tự gen APC chuẩn có mã trình tự tham  chiếu trên NCBI là NG_008481.4.  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU  Kết quả thiết kế mồi và kiểm tra mồi  Bảng 1: Các cặp mồi thiết kế để khuếch đại 15 exon của gen APC và các thông số của mồi  Exon Mồi Trình tự mồi Kích thước mồi Tm % gc Chiều dài sản phẩm 1 Xuôi GAGTTTTGTTTCCTTTACCCCT 22 60,1 40,9 320 bp Ngược GTGTCTTACCTCAAGTTTACAAGAG 25 59,9 40,0 2 Xuôi CGTGCTTTGAGAGTGATCTGA 21 60,7 47,6 272 bp Ngược TGGATCTACACACCTAAAGATGAC 24 60,4 41,7 3 Xuôi TGTTTTCAGTCATGTATATTTGTGGT 26 60,4 30,8 444 bp Ngược GCTCTAAGTGTAAGCTATCACCT 23 60,6 43,5 4 Xuôi CTGATGTAAGTATTGCTCTTCTGC 24 60,1 41,7 329 bp Ngược ATTCACGCCTAAAGTTGGGTA 21 60,4 42,9 5 Xuôi TCCAGATTGAGTCTGACACCTA 22 60,0 45,5 503 bp Ngược GGGGAAATGAATATGGTAAAGACAC 25 60,5 40,0 6 Xuôi GCTTTTAAGTGGTAGCCATAGTATG 25 60,4 40,0 274 bp Ngược GAACATCTATATTTCAATGGTGTCACA 27 60,5 33,3 7 Xuôi GCCTTGGGCTAAGAAAGC 18 59,9 55,6 307 bp Ngược TGGTTCTGAATGCTTCTGGAAA 22 61,2 40,9 8 Xuôi CAGACACTTCATTTGGAGTACCTTA 25 60,4 40,0 283 bp Ngược CTGGGATTACAGGTGTGAGC 20 61,3 55,0 9 Xuôi CATCACTTAATTGGTTTTTGGCT 23 60,8 34,8 557 bp Ngược CTCCTCTTAGTCATAAAGACAGC 23 60,2 43,5 10 Xuôi CTTAGTCAAGGGCAGATGAGT 21 60,5 47,6 467 bp Ngược GCTGATAACAGAAGTTGGTGG 21 60,4 47,6 11 Xuôi GGGTGGAGAAACTGGCATAAA 21 60,9 47,6 507 bp Ngược CGAATGTGAAGCACAGGTTT 20 60,9 45,0 12 Xuôi CCTGTTGCTTATCATTTCTCACC 23 60,3 43,5 422 bp Ngược GCACAACTGCCCTCTAAG 18 60,1 55,6 13 Xuôi GATAGGATTACAGGCGTGAGTCA 23 60,8 47,8 335 bp Ngược TCATGGCTAAAAGAAGGCAGC 21 61,2 47,6 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học 103 Exon Mồi Trình tự mồi Kích thước mồi Tm % gc Chiều dài sản phẩm 14 Xuôi ATTTACCAGTGAGGGACGG 19 60,9 52,6 577 bp Ngược GGGCTACACCTCTCAACTATAA 22 60,1 45,5 15 – A Xuôi ATGCCTTTTGTCTTCTATCCTTT 23 60,1 34,8 578 bp Ngược GCCAGTATTAAAATTGTCTGACCTAT 26 60,8 34,6 15 – B Xuôi AAGCCCTAGAAGCAGAATTAGA 22 60,7 40,9 588 bp Ngược ATTTGGCATAAGGCATAGAACA 22 60,2 36,4 15 – C Xuôi TGGGTCTACCACTGAATTACATTG 24 60,9 41,7 598 bp Ngược CCGTGACCTGTATGGAGAAACA 22 60,8 50,0 15 – D Xuôi AATGAAAGATGGGCAAGACC 20 60,3 45,0 594 bp Ngược AGGCTGACCACTTCTACT 18 60,0 50,0 15 – E Xuôi ATCTGGACAAAGCAGTAAAACC 22 59,9 40,9 597 bp Ngược GAACGACTCTCAAAACTATCAAGTG 25 60,0 40,0 15 – F Xuôi CAAAGCTGTTGAATTTTCTTCAGG 24 60,0 37,5 586 bp Ngược TTCTTTAGGCTGCTCTGATTCTG 23 60,7 43,5 15 – G Xuôi GAGCCATTTATACAGAAAGATGTGG 25 61,0 40,0 519 bp Ngược TTCAAATTCACCTGACTGTGC 21 60,1 42,9 15 – H Xuôi GGGACACCTATAAACTTTTCCACA 24 60,4 41,7 582 bp Ngược AGCAAAACTTCCTCTGACTCTA 22 60,8 40,9 15 – I Xuôi CTTCACCAGTAAAACCTATACCACA 25 60,4 40,0 598 bp Ngược AGAGAACTCAGAGAGGAATTATGAG 25 60,8 40,0 15 – J Xuôi AAGACATACCAGACAGAGGG 20 60,2 50,0 600 bp Ngược GGGAAAGGATGGAATCTGAATCA 23 60,1 43,5 15 – K Xuôi GAACATGGTCTATCCCCTGATTC 23 61,2 47,8 586 bp Ngược GGCTTAATTCTGATTTCACAGATGG 25 61,1 40,0 15 – L Xuôi CCTCAAGTACAAGTCCTGTTTC 22 61,0 45,5 579 bp Ngược CTGATCTATCAGATTCACTTCCAC 24 60,6 41,7 15 – M Xuôi GGTTTATCCAAGAATGCCAGTAG 23 60,6 43,5 551 bp Ngược CTTCTCCAAGTGCTTACTCG 20 60,7 50,0 15 – N Xuôi CGGTCTCATTCTGAAAGTCCT 21 60,9 47,6 585 bp Ngược GGAGATCAGGCGATTTTCC 19 59,9 52,6 15 – O Xuôi CAGAAAAGGCAAATCCAAACAT 22 60,9 36,4 598 bp Ngược CCCTCTAACAAGAATCAAACCTATTTAC 28 60,3 35,7 Nhận xét: Các mồi có chiều dài 20  ‐ 30 bp.  Nhiệt độ biến tính (Tm) không chênh lệch nhiều  (59.9 oC ‐ 61.2 oC), thuận lợi cho việc chọn nhiệt  độ bắt cặp chung cho cả 29 cặp mồi. Kích thước  đoạn khuếch đại từ 272 – 600 bp. Đa số các mồi  có tỷ lệ GC cao trên 40%, một số ít trên 30%. Các  giá trị ΔG đều đạt yêu cầu. Kết quả kiểm tra SNP  trên mồi cho thấy tất cả các mồi đều không chứa  SNP  ở  đầu  3’ do  đó  sẽ không  làm  ảnh hưởng  đến hoạt động của enzyme polymerase. Kết quả  primerBlast trên NCBI ở các mồi đều có độ đặc  hiệu cao.   Kết quả chuẩn hóa phản ứng PCR  Nhiệt độ bắt cặp mồi  Nhiệt  độ  bắt  cặp mồi  được  khảo  sát  nằm  trong  khoảng  55oC  ‐  61oC. Khảo  sát  nhằm  xác  định nhiệt độ tối ưu cho mồi bắt cặp đặc hiệu lên  DNA mạch khuôn. Các mức nhiệt độ cách nhau  2oC  để  đảm  bảo  ý  nghĩa  của  các  nghiệm  thức  khảo sát. Khảo sát được tiến hành lặp lại 3 lần ở  tất cả các cặp mồi. Do kết quả khảo sát ở tất cả  các cặp mồi đều khá tương đồng nên chúng tôi  chỉ đưa ra kết quả của cặp mồi khuếch đại exon  15‐A trong khảo sát.   Cả  4 mức nhiệt  độ gắn mồi khảo  sát  đều  cho vạch điện di có kích  thước đúng với kích  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 104 thước được khuếch đại của cặp mồi exon 15‐A  và phản ứng PCR không có sản phẩm phụ cho  thấy các mồi đạt độ đặc hiệu cao ở cả bốn nhiệt  độ (Hình 1).   Hình 1: Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi  exon 15‐A ở các mức nhiệt độ khác nhau. (T) Thang  chuẩn 1kb plus;(1) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp  55oC;(2) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 57oC;(3)  Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 59 oC;(4) Sản phẩm  PCR ở nhiệt độ bắt cặp 61 oC;(‐) Chứng âm.  Độ nhạy của quy trình  Độ  nhạy  của  quy  trình  được  xác  định  với  nồng  độ  DNA  giảm  dần  từ  50ng/μl  đến  0,1  ng/μl. Phản ứng PCR thực hiện ở nhiệt độ 59oC.  Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần.  Theo  kết  quả  điện  di,  bắt  đầu  từ  nồng  độ  DNA khuôn 5 ng/μL trở xuống, sản phẩm PCR  cho vạch điện di mờ dần. Ở nồng độ DNA 0,5  ng/μL và 0,1 ng/μL không thấy vạch điện di của  sản phẩm PCR. Kết quả cho thấy quy trình có độ  nhạy đạt 1 ng/μl.  Hình 2: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình PCR khuếch đại gen exon 15‐A ở các nồng độ DNA khác nhau.  Hình A: (1) 0,1 ng/μL; (2) 0,5 ng/μL; (3) 1 ng/μL; (4) 2 ng/μL; (5) 3 ng/μL. Hình B: (1) 1 ng/μL; (2) 2 ng/μL;  (3) 3 ng/μL; (4) 4 ng/μL; (5) 5 ng/μL; (6) 10 ng/μL; (7) 15 ng/μL; (8) 20 ng/μL; (9) 30 ng/μL; (10) 40 ng/μL;  (11) 50 ng/μL. (T) Thang chuẩn; (‐) Chứng âm.  Kết quả chạy điện di sản phẩm bằng phản ứng  PCR đã chuẩn hóa.  Tiến hành khuếch đại toàn bộ các exon bằng  phản ứng PCR với nồng độ DNA sử dụng là 50  ng/  μL. Nhiệt  độ  bắt  cặp  dùng  cho  phản  ứng  PCR là 59oC.   Phương  pháp  PCR  đã  được  chuẩn  hóa  và  cho kết quả khuếch đại  tốt, sản phẩm PCR khi  điện di đậm, sáng rõ, đúng kích thước và không  có sản phẩm phụ.  A B A Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học 105 Hình 3: Sản phẩm khuếch đại của exon 1 đến 9 với quy trình PCR đã chuẩn hóa. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.  (T) Thang; (‐) Chứng âm; (1)‐(9) Sản phẩm khuếch đại exon 1 đến 9.  Kết  quả  giải  trình  tự  gen APC  ở  người  bình  thường khỏe mạnh.  Hình 4: Kết quả giải trình tự exon 15‐F gen APC của  mẫu 01 bằng cả hai mồi xuôi (F) và mồi ngược (R),  tìm thấy SNP (rs42427) tại c.5034.  Các exon được giải trình tự bằng cả mồi xuôi  và mồi ngược. Kết quả giải  trình  tự được phân  tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5.  Nhận xét: Tất cả 15 người bình thường tham  gia nghiên  cứu  đều  tìm  thấy  các SNP  đã  được  công bố và không làm thay đổi acid amin.  BÀN LUẬN  Protein APC điều hòa quá  trình phosphoryl  hóa và ubiquitin hóa beta‐catenin(7), qua đó điều  hòa quá trình phân chia, biệt hóa và sự chết theo  chương  trình  của  tế  bào.  Đột  biến  dòng mầm  trong gene sẽ  làm mất chức năng protein APC,  dẫn đến sự phân chia không kiểm soát của các tế  bào, tình trạng dễ tiến triển thành các dạng ung  thư đường tiêu hóa(2). Đặc biệt, ung thư gan ở trẻ  em dưới 5 tuổi cũng là một hệ quả nguy hiểm ở  các bệnh nhân có đột biến gen APC với tỷ lệ mắc  bệnh khoảng 1,5 %(2). Hầu hết các đột biến là đột  biến nhỏ xảy ra trên 1 exon, nằm rải rác ở tất cả  15 exon của gen. Các đột biến này thường tạo bộ  ba kết thúc (stop codon), làm quá trình dịch mã  kết thúc sớm và tổng hợp nên protein bị cắt cụt,  làm mất  chức năng  ức chế  sự  tăng  sinh  tế bào  của  protein  APC.  Nghiên  cứu  của  Powell  và  cộng  sự năm  1992  cho  thấy  đột  biến  gen APC  gây ra 63% các ca ung thư tuyến(6). Vì vậy, đề tài  thật sự có ý nghĩa trong việc chẩn đoán sớm các  đột biến dòng mầm ở gen, giúp người mang đột  biến có thể chủ động thăm khám định kì và điều  trị tích cực các bệnh liên quan ở giai đoạn đầu.  Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế  29 cặp mồi đặc hiệu, do exon 15 có kích  thước  6574 bp lớn hơn rất nhiều so với các exon còn lại  (có chiều dài 78‐379 bp), chúng tôi đã quyết định  dùng 15  cặp mồi khuếch  đại exon 15  thành 15  amplicon có kích thước từ 500 đến 600 bp nhằm  đồng  bộ  hóa  quá  trình  giải  trình  tự.  Các mồi  được  thiết  kế  bằng  phần  mềm  LightScanner  Primer  Design,  kiểm  tra  bằng  phần  mềm  SNPCheck3,  OligoAnalyzer  3.1  và  công  cụ  Primer‐BLAST  của NCBI. Kết quả kiểm  tra  các  thông số: tỷ lệ GC (% GC), các số liệu về nhiệt độ  biến tính mồi (Tm), chiều dài mồi, các giá trị ΔG  của các cấu trúc thứ đều đạt yêu cầu(4). Đa số các  mồi không có SNP hoặc có SNP ở vị  trí không  ảnh hưởng  đến  khả năng  bắt  cặp  của mồi  lên  (T) (-) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 106 mạch khuôn. Kết quả Primer‐BLAST trên NCBI  cho thấy các mồi có tính đặc hiệu cao.   Kết  quả  khảo sát nhiệt độ bắt cặp đều cho vạch điện di  đặc  hiệu,  có  kích  thước  khuếch  đại  đúng  và  không có sản phẩm phụ. Nhiệt độ càng cao, tính  đặc hiệu của phản ứng PCR càng cao. Tuy nhiên,  do các mồi được thiết kế có nhiệt độ nóng chảy  trung  bình  khoảng  60‐61oC,  vì  vậy  chúng  tôi  không  lựa chọn nhiệt độ gắn mồi ở 61oC nhằm  hạn chế khả năng mồi bị nóng chảy và làm giảm  hiệu suất phản ứng PCR. Do đó, chúng  tôi  lựa  chọn nhiệt độ gắn mồi 59 oC cho quy trình chuẩn  nhằm đạt hiệu suất PCR cao nhất và hạn chế các  sản phẩm phụ. Quy trình sau khi chuẩn hóa cho  sản phẩm PCR  có  độ  đặc hiệu  cao,  đúng  kích  thước và không có sản phẩm phụ. Độ nhạy quy  trình cao (nồng độ DNA  thấp nhất  là 1 ng/μL),  cũng  như  với  nồng  độ  DNA  khuôn  trên  10  ng/μL sẽ cho kết quả khuếch đại ổn định, vạch  điện di đậm màu và dễ kết luận.  Kết quả giải trình tự được so sánh với trình  tự gen APC chuẩn trên NCBI bằng phần mềm  CLC Main Workbench 5 để kiểm tra sự tương  đồng, qua  đó phản  ánh  độ  đặc hiệu  của mồi  thiết kế và  điều kiện phản  ứng PCR  đã  được  tối ưu hóa. Kết quả giải trình tự 15 mẫu DNA  đều  xuất  hiện  các  SNP  đã  được  xác  định  và  công bố  trên  thế giới. Các SNP phần  lớn nằm  trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin  trong chuỗi protein.   Sau  khi  xây  dựng  thành  công  quy  trình  khuếch  đại  và  giải  trình  tự  toàn  bộ  gen APC,  mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng  đến  là ứng dụng quy  trình  trên nhằm xác định  các  đột biến gen APC  trên bệnh nhân ung  thư  đường  tiêu hóa và gia  đình người bệnh nhằm  sớm phát hiện gen bệnh,  cũng như đưa  ra  các  chiến  lược  điều  trị,  tư vấn  cần  thiết  cho người  mang gen bệnh.    KẾT LUẬN  Nghiên cứu đã  thiết kế  thành công bộ mồi,  chuẩn  hóa  và  xây  dựng  thành  công  quy  trình  giải trình tự gen APC. Kết quả của nghiên cứu có  tính ứng dụng cao nhằm xác định đột biến gen  APC và xây dựng bản  đồ gen  đột biến  ở  cộng  đồng người Việt Nam.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Benchabane H, Ahmed Y (2009). The adenomatous polyposis  coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of  apoptosis. Adv Exp Med Biol. 656:75‐84.     2. Half  E,  Bercovich  D  and  Rozen  P  (2009).  Familial  adenomatous polyposis. Orphanet J Rare Dis, 4: 22.   3. Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY,  Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987).  The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of  chromosome 5. Science, 238(4832):1411‐3.  4. OligoArchitectTM Online Glossary of Parameters.    5. Plawski A,  Slomski  R  (2009). APC  gene mutations  causing  familial  adenomatous  polyposis  in  Polish  patients.  J  Appl  Genet, 49(4): 407–414.  6. Powell SM, Zilz N, Beazer‐Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR,  Thibodeau  SN,  Vogelstein  B,  Kinzler  KW  (1992).  APC  mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature  359: 235‐237.  7. Yang  J,  Zhang  W,  Evans  PM,  Chen  X,  He  X,  Liu  C  (2006). Adenomatous  polyposis  coli  (APC)  differentially  regulates beta‐catenin phosphorylation and ubiquitination in  colon cancer cells. J. Biol. Chem. 281: 17751‐17757.    Ngày nhận bài báo:       03/08/2014  Ngày phản biện đánh giá bài báo:   10/08/2014  Ngày bài báo được đăng:     30/08/2014