Kết quả giải trình tự được so sánh với trình
tự gen APC chuẩn trên NCBI bằng phần mềm
CLC Main Workbench 5 để kiểm tra sự tương
đồng, qua đó phản ánh độ đặc hiệu của mồi
thiết kế và điều kiện phản ứng PCR đã được
tối ưu hóa. Kết quả giải trình tự 15 mẫu DNA
đều xuất hiện các SNP đã được xác định và
công bố trên thế giới. Các SNP phần lớn nằm
trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin
trong chuỗi protein.
Sau khi xây dựng thành công quy trình
khuếch đại và giải trình tự toàn bộ gen APC,
mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng
đến là ứng dụng quy trình trên nhằm xác định
các đột biến gen APC trên bệnh nhân ung thư
đường tiêu hóa và gia đình người bệnh nhằm
sớm phát hiện gen bệnh, cũng như đưa ra các
chiến lược điều trị, tư vấn cần thiết cho người
mang gen bệnh.
7 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 27/01/2022 | Lượt xem: 249 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng quy trình khuếch đại và giải trình tự gen APC, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014
100
XÂY DỰNG QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN APC
Đoàn Nam Khánh*, Nguyễn Ngọc Minh**, Lê Minh Khôi**, Nguyễn Trung Tín**, Đỗ Thị Thanh Thủy**,
Lê Thị Hương Lan***, Nguyễn Thị Băng Sương**
TÓM TẮT
Giới thiệu: Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u gồm 15 exon nằm tại vị
trí 5q21‐q22, sản phẩm dịch mã của gen là protein APC dài 2843 acid amin. Protein APC với vai trò chính là cô
lập các hiệu ứng kích thích tăng trưởng của Beta‐catenin nhằm thúc đẩy sự chết theo chương trình của tế bào.
Người mang gen APC bị đột biến sẽ dẫn đến một số bệnh liên quan như bệnh đa polyp đại trực tràng, bệnh ung
thư hệ tiêu hóa, các tuyến, các cơ quan (não, gan, tuyến thượng thận, tuyến tụy, tuyến giáp,) và một số bệnh
bẩm sinh khác.
Mục tiêu: Xây dựng quy trình khuếch đại toàn bộ 15 exon của gen APC bằng phản ứng PCR và giải trình
tự gen APC.
Đối tượng và phương pháp: DNA được tách chiết từ máu ngoại vi của 15 người khỏe mạnh. Các exon của
gen được khuếch đại bằng 29 cặp mồi, sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự bằng máy tự động. Kết quả
được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
Kết quả: Xây dựng thành công quy trình PCR khuếch đại 15 exon của gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu
là 59oC, độ nhạy của quy trình là 1 ng/ μL. Sản phẩm giải trình tự cho kết quả tương đồng với trình tự gen APC
chuẩn trên NCBI.
Kết luận: Xây dựng thành công quy trình khuếch đại và giải trình tự toàn bộ gen APC.
Từ khóa: gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự.
ABSTRACT
ESTABLISH PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING APC GENE
Doan Nam Khanh, Nguyen Ngoc Minh, Le Minh Khoi, Nguyen Trung Tin, Do Thi Thanh Thuy,
Le Thi Huong Lan, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ No 4 ‐ 2014: 100 ‐ 106
Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene. It contains 15 exons locating
at 5q21‐q22. The 2843 amino‐acid APC protein plays an important role in regulating the Beta‐catein growth
signal factor and leads cells to normal apoptosis. Mutations in APC gene cause colorectal polyposis diseases,
cancer diseases in digestive system, in Endocrine System (pancreas, thyroid, adrenal gland) and cancer in other
organs (brain, liver,).
Aim: Establish protocol to amplify all 15 exons of APC gene by PCR method, then identify all sequences of
APC gene.
Objects and Methods: DNA was extracted from peripheral blood of 15 healthy people. 15 exons of APC
gene were ampliflied by 29 pairs of primer, then sequenced by ABI system. Results were analysed by specialist
software.
Results: PCR method for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at
59oC and protocol has sensitivity of 1 ng /μL. Sequencing products are identical to standard sequence database of
APC gene from NCBI genbank.
* Khoa Sinh học, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, ** Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh,
*** Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên
Tác giả liên lạc: TS. BS. Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0913281386, Email: suongnguyenmd@gmail.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học
101
Conclusion: We have successfully established the protocol for amplifying and identifying all sequences of
APC gene.
Key words: APC gene, amplify gene, sequencing protocol.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gen APC (adenomatous polyposis coli gene)
là một gen ức chế khối u có tổng cộng 15 exon
nằm trên cánh dài của NST số 5. Trong đó exon
15 có kích thước lớn nhất, bao gồm 6574 bp (base
pair), chiếm 75% trình tự mã hóa protein của
gen. Gen APC tổng hợp protein APC dài 2843
acid amin(2,3). Protein APC tham gia vào con
đường truyền tín hiệu Wnt điều hòa quá trình
phân chia tế bào và đổi mới tổ chức mô. Sự kết
hợp giữa protein APC và beta‐catenin trong con
đường tín hiệu này sẽ phân hủy, ức chế vai trò
của beta‐catenin, điều hòa quá trình phân chia
và hướng tế bào đến sự chết theo chương trình(1).
Việc mất chức năng của protein APC do đột biến
dòng mầm trong gen làm tích tụ quá mức Beta‐
catenin trong tế bào, kích thích sự phát triển,
phân chia không kiểm soát của tế bào và dẫn
đến sự hình thành của các khối u(2). Đa số đột
biến gen APC là đột biến vô nghĩa hoặc gây lệch
khung dịch mã, điều này dẫn đến protein APC
bị cắt ngắn, mất chức năng ức chế khối u(6). Do
đó, người mang gen APC bị đột biến sẽ có nguy
cơ cao mắc một số bệnh liên quan như bệnh đa
polyp tuyến gia đình (FAP) với hàng trăm polyp
trong đại trực tràng và 95‐100% nguy cơ tiến
triển thành ung thư đại trực tràng dưới 40
tuổi(2,5). Ngoài ra, đột biến gen APC còn gây các
bệnh như bệnh đa polyp tuyến thể nhẹ (AFAP)
có số lượng polyp ít hơn trong khoảng 10 – 100
polyp(2); u xương lành tính; thêm, mất răng hoặc
răng mọc ngầm dưới hàm; phì đại biểu mô sắc
tố võng mạc bẩm sinh (CHRPE) và nhiều bệnh
ung thư khác; cá biệt như ung thư gan ở trẻ em
dưới 5 tuổi(2,5).
Đột biến dòng mầm trong gen APC là đột
biến trội nên chỉ cần có đột biến ở một trong hai
allen cũng có khả năng gây bệnh, nếu không
được phát hiện kịp thời thì bệnh sẽ chuyển sang
các giai đoạn muộn, gây khó khăn cho quá trình
điều trị, cũng như tỷ lệ sống sót thấp(1,3). Do đó,
việc chẩn đoán sớm đột biến gene APC sẽ giúp
người bệnh, đặc biệt là người thân của bệnh
nhân có thể chủ động trong việc thăm khám
định kỳ các bệnh ung thư liên quan(2,5). Theo cơ
sở dữ liệu về các đột biến gen APC được công bố
hiện nay, có khoảng 96% các đột biến là đột biến
nhỏ nằm rải rác trên toàn bộ chiều dài gen, trong
đó có 38% là đột biến điểm. Với các đột biến nhỏ,
xảy ra trên 1 exon, phương pháp hiệu quả và
chính xác nhật để xác định đột biến gen là
phương pháp giải trình tự. Bằng cách sử dụng
phản ứng PCR khuếch đại 15 exon của gen APC
và kỹ thuật giải trình tự toàn bộ các exon này,
chúng tôi tiến hành chuẩn hóa các điều kiện cần
thiết để thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình
khuếch đại và giải trình tự gen APC ”.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu máu của 15 người khỏe mạnh không
có họ hàng, không bị bệnh đường tiêu hóa. Gia
đình không có tiền sử ung thư đại trực tràng.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế và kiểm tra mồi
Dùng phần mềm LightScanner Primer
Design thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại
15 exon của gene APC và quanh vị trí splicing.
Mồi sau khi thiết kế sẽ được kiểm tra bằng phần
mềm SNPCheck3 (kiểm tra sự hiện diện của
SNP trên mồi), dùng công cụ OligoAnalyzer 3.1
của IDT® để kiểm tra các giá trị ΔG của cấu trúc
thứ cấp. Các giá trị về chiều dài, % GC, Tm,
chiều dài của mồi đều được kiểm tra khi thiết kế
mồi trên phần mềm LightScanner Primer
Design. Tính đặc hiệu của mồi được kiểm tra
bằng công cụ Primer‐BLAST trên NCBI.
Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi
Máu ngoại vi khi thu nhận được giữ trong
ống chống đông bằng EDTA nắp xanh dương và
được ly trích trong vòng 24 giờ. Sử dụng bộ kit
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014
102
QiAamp DNA blood mini kit của hãng Qiagen –
Đức để ly trích DNA. Sản phẩm ly trích được
tiến hành kiểm tra độ nguyên vẹn của mạch
bằng phương pháp điện di trên gel agarose 3%,
đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy
NanoDrop 2000.
Kỹ thuật khuếch đại các exon của gen APC
Dùng phương pháp PCR khuếch đại gen
APC (máy Gene Amp PCR System 9700‐USA).
Thành phần của phản ứng PCR gồm 20 μl
chứa các thành phần: DNA khuôn; 0,2 mmol/L
dNTP; 1,5 mmol/L Mg++; 0,1‐0,2 μmol/L primer
và 1‐1,5 đơn vị Taq polymerase.
Chu trình nhiệt của phản ứng: Biến tính ở
94°C trong 5 phút, tiếp theo là 35‐40 chu kỳ gồm
biến tính ở 94°C trong 30 giây; gắn mồi ở 60°C
trong 30 giây và bước kéo dài 72°C trong 30 giây,
cuối cùng là giai đoạn hoàn chỉnh ở 72°C trong 5
phút và bảo quản tạm thời ở 4°C.
Kết quả PCR sau đó được kiểm chứng bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1,5%.
Kỹ thuật giải trình tự gen
Thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye version 3.1 của công ty Applied
Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược, giải
trình tự DNA (máy sequencer ABI 3500).
Phân tích kết quả giải trình tự
Kết quả giải trình tự được phân tích bằng
phần mềm CLC Main Workbench 5 và so sánh
với trình tự gen APC chuẩn có mã trình tự tham
chiếu trên NCBI là NG_008481.4.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả thiết kế mồi và kiểm tra mồi
Bảng 1: Các cặp mồi thiết kế để khuếch đại 15 exon của gen APC và các thông số của mồi
Exon Mồi Trình tự mồi Kích thước mồi Tm % gc Chiều dài sản phẩm
1
Xuôi GAGTTTTGTTTCCTTTACCCCT 22 60,1 40,9
320 bp
Ngược GTGTCTTACCTCAAGTTTACAAGAG 25 59,9 40,0
2
Xuôi CGTGCTTTGAGAGTGATCTGA 21 60,7 47,6
272 bp
Ngược TGGATCTACACACCTAAAGATGAC 24 60,4 41,7
3
Xuôi TGTTTTCAGTCATGTATATTTGTGGT 26 60,4 30,8
444 bp
Ngược GCTCTAAGTGTAAGCTATCACCT 23 60,6 43,5
4
Xuôi CTGATGTAAGTATTGCTCTTCTGC 24 60,1 41,7
329 bp
Ngược ATTCACGCCTAAAGTTGGGTA 21 60,4 42,9
5
Xuôi TCCAGATTGAGTCTGACACCTA 22 60,0 45,5
503 bp
Ngược GGGGAAATGAATATGGTAAAGACAC 25 60,5 40,0
6
Xuôi GCTTTTAAGTGGTAGCCATAGTATG 25 60,4 40,0
274 bp
Ngược GAACATCTATATTTCAATGGTGTCACA 27 60,5 33,3
7
Xuôi GCCTTGGGCTAAGAAAGC 18 59,9 55,6
307 bp
Ngược TGGTTCTGAATGCTTCTGGAAA 22 61,2 40,9
8
Xuôi CAGACACTTCATTTGGAGTACCTTA 25 60,4 40,0
283 bp
Ngược CTGGGATTACAGGTGTGAGC 20 61,3 55,0
9
Xuôi CATCACTTAATTGGTTTTTGGCT 23 60,8 34,8
557 bp
Ngược CTCCTCTTAGTCATAAAGACAGC 23 60,2 43,5
10
Xuôi CTTAGTCAAGGGCAGATGAGT 21 60,5 47,6
467 bp
Ngược GCTGATAACAGAAGTTGGTGG 21 60,4 47,6
11
Xuôi GGGTGGAGAAACTGGCATAAA 21 60,9 47,6
507 bp
Ngược CGAATGTGAAGCACAGGTTT 20 60,9 45,0
12
Xuôi CCTGTTGCTTATCATTTCTCACC 23 60,3 43,5
422 bp
Ngược GCACAACTGCCCTCTAAG 18 60,1 55,6
13
Xuôi GATAGGATTACAGGCGTGAGTCA 23 60,8 47,8
335 bp
Ngược TCATGGCTAAAAGAAGGCAGC 21 61,2 47,6
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học
103
Exon Mồi Trình tự mồi Kích thước mồi Tm % gc Chiều dài sản phẩm
14
Xuôi ATTTACCAGTGAGGGACGG 19 60,9 52,6
577 bp
Ngược GGGCTACACCTCTCAACTATAA 22 60,1 45,5
15 – A
Xuôi ATGCCTTTTGTCTTCTATCCTTT 23 60,1 34,8
578 bp
Ngược GCCAGTATTAAAATTGTCTGACCTAT 26 60,8 34,6
15 – B
Xuôi AAGCCCTAGAAGCAGAATTAGA 22 60,7 40,9
588 bp
Ngược ATTTGGCATAAGGCATAGAACA 22 60,2 36,4
15 – C
Xuôi TGGGTCTACCACTGAATTACATTG 24 60,9 41,7
598 bp
Ngược CCGTGACCTGTATGGAGAAACA 22 60,8 50,0
15 – D
Xuôi AATGAAAGATGGGCAAGACC 20 60,3 45,0
594 bp
Ngược AGGCTGACCACTTCTACT 18 60,0 50,0
15 – E
Xuôi ATCTGGACAAAGCAGTAAAACC 22 59,9 40,9
597 bp
Ngược GAACGACTCTCAAAACTATCAAGTG 25 60,0 40,0
15 – F
Xuôi CAAAGCTGTTGAATTTTCTTCAGG 24 60,0 37,5
586 bp
Ngược TTCTTTAGGCTGCTCTGATTCTG 23 60,7 43,5
15 – G
Xuôi GAGCCATTTATACAGAAAGATGTGG 25 61,0 40,0
519 bp
Ngược TTCAAATTCACCTGACTGTGC 21 60,1 42,9
15 – H
Xuôi GGGACACCTATAAACTTTTCCACA 24 60,4 41,7
582 bp
Ngược AGCAAAACTTCCTCTGACTCTA 22 60,8 40,9
15 – I
Xuôi CTTCACCAGTAAAACCTATACCACA 25 60,4 40,0
598 bp
Ngược AGAGAACTCAGAGAGGAATTATGAG 25 60,8 40,0
15 – J
Xuôi AAGACATACCAGACAGAGGG 20 60,2 50,0
600 bp
Ngược GGGAAAGGATGGAATCTGAATCA 23 60,1 43,5
15 – K
Xuôi GAACATGGTCTATCCCCTGATTC 23 61,2 47,8
586 bp
Ngược GGCTTAATTCTGATTTCACAGATGG 25 61,1 40,0
15 – L
Xuôi CCTCAAGTACAAGTCCTGTTTC 22 61,0 45,5
579 bp
Ngược CTGATCTATCAGATTCACTTCCAC 24 60,6 41,7
15 – M
Xuôi GGTTTATCCAAGAATGCCAGTAG 23 60,6 43,5
551 bp
Ngược CTTCTCCAAGTGCTTACTCG 20 60,7 50,0
15 – N
Xuôi CGGTCTCATTCTGAAAGTCCT 21 60,9 47,6
585 bp
Ngược GGAGATCAGGCGATTTTCC 19 59,9 52,6
15 – O
Xuôi CAGAAAAGGCAAATCCAAACAT 22 60,9 36,4
598 bp
Ngược CCCTCTAACAAGAATCAAACCTATTTAC 28 60,3 35,7
Nhận xét: Các mồi có chiều dài 20 ‐ 30 bp.
Nhiệt độ biến tính (Tm) không chênh lệch nhiều
(59.9 oC ‐ 61.2 oC), thuận lợi cho việc chọn nhiệt
độ bắt cặp chung cho cả 29 cặp mồi. Kích thước
đoạn khuếch đại từ 272 – 600 bp. Đa số các mồi
có tỷ lệ GC cao trên 40%, một số ít trên 30%. Các
giá trị ΔG đều đạt yêu cầu. Kết quả kiểm tra SNP
trên mồi cho thấy tất cả các mồi đều không chứa
SNP ở đầu 3’ do đó sẽ không làm ảnh hưởng
đến hoạt động của enzyme polymerase. Kết quả
primerBlast trên NCBI ở các mồi đều có độ đặc
hiệu cao.
Kết quả chuẩn hóa phản ứng PCR
Nhiệt độ bắt cặp mồi
Nhiệt độ bắt cặp mồi được khảo sát nằm
trong khoảng 55oC ‐ 61oC. Khảo sát nhằm xác
định nhiệt độ tối ưu cho mồi bắt cặp đặc hiệu lên
DNA mạch khuôn. Các mức nhiệt độ cách nhau
2oC để đảm bảo ý nghĩa của các nghiệm thức
khảo sát. Khảo sát được tiến hành lặp lại 3 lần ở
tất cả các cặp mồi. Do kết quả khảo sát ở tất cả
các cặp mồi đều khá tương đồng nên chúng tôi
chỉ đưa ra kết quả của cặp mồi khuếch đại exon
15‐A trong khảo sát.
Cả 4 mức nhiệt độ gắn mồi khảo sát đều
cho vạch điện di có kích thước đúng với kích
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014
104
thước được khuếch đại của cặp mồi exon 15‐A
và phản ứng PCR không có sản phẩm phụ cho
thấy các mồi đạt độ đặc hiệu cao ở cả bốn nhiệt
độ (Hình 1).
Hình 1: Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi
exon 15‐A ở các mức nhiệt độ khác nhau. (T) Thang
chuẩn 1kb plus;(1) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp
55oC;(2) Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 57oC;(3)
Sản phẩm PCR ở nhiệt độ bắt cặp 59 oC;(4) Sản phẩm
PCR ở nhiệt độ bắt cặp 61 oC;(‐) Chứng âm.
Độ nhạy của quy trình
Độ nhạy của quy trình được xác định với
nồng độ DNA giảm dần từ 50ng/μl đến 0,1
ng/μl. Phản ứng PCR thực hiện ở nhiệt độ 59oC.
Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại ba lần.
Theo kết quả điện di, bắt đầu từ nồng độ
DNA khuôn 5 ng/μL trở xuống, sản phẩm PCR
cho vạch điện di mờ dần. Ở nồng độ DNA 0,5
ng/μL và 0,1 ng/μL không thấy vạch điện di của
sản phẩm PCR. Kết quả cho thấy quy trình có độ
nhạy đạt 1 ng/μl.
Hình 2: Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình PCR khuếch đại gen exon 15‐A ở các nồng độ DNA khác nhau.
Hình A: (1) 0,1 ng/μL; (2) 0,5 ng/μL; (3) 1 ng/μL; (4) 2 ng/μL; (5) 3 ng/μL. Hình B: (1) 1 ng/μL; (2) 2 ng/μL;
(3) 3 ng/μL; (4) 4 ng/μL; (5) 5 ng/μL; (6) 10 ng/μL; (7) 15 ng/μL; (8) 20 ng/μL; (9) 30 ng/μL; (10) 40 ng/μL;
(11) 50 ng/μL. (T) Thang chuẩn; (‐) Chứng âm.
Kết quả chạy điện di sản phẩm bằng phản ứng
PCR đã chuẩn hóa.
Tiến hành khuếch đại toàn bộ các exon bằng
phản ứng PCR với nồng độ DNA sử dụng là 50
ng/ μL. Nhiệt độ bắt cặp dùng cho phản ứng
PCR là 59oC.
Phương pháp PCR đã được chuẩn hóa và
cho kết quả khuếch đại tốt, sản phẩm PCR khi
điện di đậm, sáng rõ, đúng kích thước và không
có sản phẩm phụ.
A B
A
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014 Nghiên cứu Y học
105
Hình 3: Sản phẩm khuếch đại của exon 1 đến 9 với quy trình PCR đã chuẩn hóa. Thí nghiệm được lập lại 3 lần.
(T) Thang; (‐) Chứng âm; (1)‐(9) Sản phẩm khuếch đại exon 1 đến 9.
Kết quả giải trình tự gen APC ở người bình
thường khỏe mạnh.
Hình 4: Kết quả giải trình tự exon 15‐F gen APC của
mẫu 01 bằng cả hai mồi xuôi (F) và mồi ngược (R),
tìm thấy SNP (rs42427) tại c.5034.
Các exon được giải trình tự bằng cả mồi xuôi
và mồi ngược. Kết quả giải trình tự được phân
tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5.
Nhận xét: Tất cả 15 người bình thường tham
gia nghiên cứu đều tìm thấy các SNP đã được
công bố và không làm thay đổi acid amin.
BÀN LUẬN
Protein APC điều hòa quá trình phosphoryl
hóa và ubiquitin hóa beta‐catenin(7), qua đó điều
hòa quá trình phân chia, biệt hóa và sự chết theo
chương trình của tế bào. Đột biến dòng mầm
trong gene sẽ làm mất chức năng protein APC,
dẫn đến sự phân chia không kiểm soát của các tế
bào, tình trạng dễ tiến triển thành các dạng ung
thư đường tiêu hóa(2). Đặc biệt, ung thư gan ở trẻ
em dưới 5 tuổi cũng là một hệ quả nguy hiểm ở
các bệnh nhân có đột biến gen APC với tỷ lệ mắc
bệnh khoảng 1,5 %(2). Hầu hết các đột biến là đột
biến nhỏ xảy ra trên 1 exon, nằm rải rác ở tất cả
15 exon của gen. Các đột biến này thường tạo bộ
ba kết thúc (stop codon), làm quá trình dịch mã
kết thúc sớm và tổng hợp nên protein bị cắt cụt,
làm mất chức năng ức chế sự tăng sinh tế bào
của protein APC. Nghiên cứu của Powell và
cộng sự năm 1992 cho thấy đột biến gen APC
gây ra 63% các ca ung thư tuyến(6). Vì vậy, đề tài
thật sự có ý nghĩa trong việc chẩn đoán sớm các
đột biến dòng mầm ở gen, giúp người mang đột
biến có thể chủ động thăm khám định kì và điều
trị tích cực các bệnh liên quan ở giai đoạn đầu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thiết kế
29 cặp mồi đặc hiệu, do exon 15 có kích thước
6574 bp lớn hơn rất nhiều so với các exon còn lại
(có chiều dài 78‐379 bp), chúng tôi đã quyết định
dùng 15 cặp mồi khuếch đại exon 15 thành 15
amplicon có kích thước từ 500 đến 600 bp nhằm
đồng bộ hóa quá trình giải trình tự. Các mồi
được thiết kế bằng phần mềm LightScanner
Primer Design, kiểm tra bằng phần mềm
SNPCheck3, OligoAnalyzer 3.1 và công cụ
Primer‐BLAST của NCBI. Kết quả kiểm tra các
thông số: tỷ lệ GC (% GC), các số liệu về nhiệt độ
biến tính mồi (Tm), chiều dài mồi, các giá trị ΔG
của các cấu trúc thứ đều đạt yêu cầu(4). Đa số các
mồi không có SNP hoặc có SNP ở vị trí không
ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp của mồi lên
(T) (-) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 4 * 2014
106
mạch khuôn. Kết quả Primer‐BLAST trên NCBI
cho thấy các mồi có tính đặc hiệu cao. Kết quả
khảo sát nhiệt độ bắt cặp đều cho vạch điện di
đặc hiệu, có kích thước khuếch đại đúng và
không có sản phẩm phụ. Nhiệt độ càng cao, tính
đặc hiệu của phản ứng PCR càng cao. Tuy nhiên,
do các mồi được thiết kế có nhiệt độ nóng chảy
trung bình khoảng 60‐61oC, vì vậy chúng tôi
không lựa chọn nhiệt độ gắn mồi ở 61oC nhằm
hạn chế khả năng mồi bị nóng chảy và làm giảm
hiệu suất phản ứng PCR. Do đó, chúng tôi lựa
chọn nhiệt độ gắn mồi 59 oC cho quy trình chuẩn
nhằm đạt hiệu suất PCR cao nhất và hạn chế các
sản phẩm phụ. Quy trình sau khi chuẩn hóa cho
sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, đúng kích
thước và không có sản phẩm phụ. Độ nhạy quy
trình cao (nồng độ DNA thấp nhất là 1 ng/μL),
cũng như với nồng độ DNA khuôn trên 10
ng/μL sẽ cho kết quả khuếch đại ổn định, vạch
điện di đậm màu và dễ kết luận.
Kết quả giải trình tự được so sánh với trình
tự gen APC chuẩn trên NCBI bằng phần mềm
CLC Main Workbench 5 để kiểm tra sự tương
đồng, qua đó phản ánh độ đặc hiệu của mồi
thiết kế và điều kiện phản ứng PCR đã được
tối ưu hóa. Kết quả giải trình tự 15 mẫu DNA
đều xuất hiện các SNP đã được xác định và
công bố trên thế giới. Các SNP phần lớn nằm
trên exon 15 và không làm thay đổi acid amin
trong chuỗi protein.
Sau khi xây dựng thành công quy trình
khuếch đại và giải trình tự toàn bộ gen APC,
mục tiêu của các nghiên cứu tiếp theo cần hướng
đến là ứng dụng quy trình trên nhằm xác định
các đột biến gen APC trên bệnh nhân ung thư
đường tiêu hóa và gia đình người bệnh nhằm
sớm phát hiện gen bệnh, cũng như đưa ra các
chiến lược điều trị, tư vấn cần thiết cho người
mang gen bệnh.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thiết kế thành công bộ mồi,
chuẩn hóa và xây dựng thành công quy trình
giải trình tự gen APC. Kết quả của nghiên cứu có
tính ứng dụng cao nhằm xác định đột biến gen
APC và xây dựng bản đồ gen đột biến ở cộng
đồng người Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Benchabane H, Ahmed Y (2009). The adenomatous polyposis
coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of
apoptosis. Adv Exp Med Biol. 656:75‐84.
2. Half E, Bercovich D and Rozen P (2009). Familial
adenomatous polyposis. Orphanet J Rare Dis, 4: 22.
3. Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY,
Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987).
The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of
chromosome 5. Science, 238(4832):1411‐3.
4. OligoArchitectTM Online Glossary of Parameters.
5. Plawski A, Slomski R (2009). APC gene mutations causing
familial adenomatous polyposis in Polish patients. J Appl
Genet, 49(4): 407–414.
6. Powell SM, Zilz N, Beazer‐Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR,
Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW (1992). APC
mutations occur early during colorectal tumorigenesis. Nature
359: 235‐237.
7. Yang J, Zhang W, Evans PM, Chen X, He X, Liu C
(2006). Adenomatous polyposis coli (APC) differentially
regulates beta‐catenin phosphorylation and ubiquitination in
colon cancer cells. J. Biol. Chem. 281: 17751‐17757.
Ngày nhận bài báo: 03/08/2014
Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/08/2014
Ngày bài báo được đăng: 30/08/2014
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- xay_dung_quy_trinh_khuech_dai_va_giai_trinh_tu_gen_apc.pdf