Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Diethylhexyl Phthalate (Dehp) và Diisononyl Phthalate (Dinp) trong thức uống

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 688 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DIETHYLHEXYL  PHTHALATE (DEHP) VÀ DIISONONYL PHTHALATE (DINP)   TRONG THỨC UỐNG  Trần Thị Ánh Nguyệt*, Trần Ngọc Minh Tuấn*  TÓM TẮT  Đặt vấn đề: Diethylhexyl Phthalate (DEHP) và Diisononyl Phthalate (DINP) là những chất hoá dẻo hữu  hiệu nhất trong ngành công nghiệp nhựa và chất dẻo. Trong quá trình sản xuất, vì mục đích lợi nhuận, một số  doanh nghiệp đã sử dụng tùy tiện DEHP và DINP cho vào sản phẩm thức uống, gây ảnh hưởng đến sức khỏe  người tiêu dùng. Bởi vì, DEHP và DINP có khả năng tạo độ độ nhớt, độ đục, độ đặc trong nhiều sản phẩm như  đồ uống thể thao, nước ép trái cây, sữa.  Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định hàm lượng DEHP, DINP trong thức uống.  Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát việc tách 2 chất DEHP và DINP trên hệ thống máy sắc ký khí kết nối  với đầu dò khối phổ.  Kết quả nghiên cứu: Xây dựng được quy trình xác định hàm lượng cùng lúc 2 chất DEHP, DINP trong  thức uống trên hệ thống máy sắc ký khí kết nối với đầu dò khối phổ.  Kết  luận: Phương pháp  sắc  ký  khí  kết nối với  đầu dò  khối phổ  là phương pháp  đơn giản  để phân  tích  Phthalate trên nền mẫu thức uống.  Từ khóa: Hàm lượng Diethylhexyl phthalate, Diisononyl Phthalate, sắc ký khí.  ABSTRACT  DEVELOPING THE DIETHYLHEXYL PHTHALATE (DEHP)   AND DIISONONYL PHTHALATE (DINP) DETERMINATION PROCESS IN BEVERAGE  Tran Thi Anh Nguyet, Tran Ngoc Minh Tuan   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6 ‐ 2014: 689 ‐ 694  Background: Diethylhexyl Phthalate (DEHP) and Diisononyl Phthalate  (DINP) are primary plasticizers  used  in many  flexible vinyl products. Some manufacturers used plasticizers  in an attempt  to reduce cost and  increase  stability. They were used  to  replace palm oil  in drinks as a  clouding agent. The  chemical  substances  affected large to human health.    Objectives: To develop a new method for identifying concentration of DEHP, DINP in beverage.  Methods: Evaluate the separation of 2 phthalates including: DEHP, DINP using gas chromatography and  mass spectrometry detector.   Result:  This  study  established  a method  to  analyze  2  phthalates  using  gas  chromatography  and mass  spectrometry detector in samples of beverage.   Conclusion: Gas chromatography and mass spectrometry method is simple to analyze phthalate in samples  of beverage.   Keywords: Diethylhexyl Phthalate, Diisononyl Phthalate, gas chromatography.  * Viện Y Tế Công Cộng TP. Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: CN. Trần Thị Ánh Nguyệt  ĐT: 0982 11 98 76  Email: labogc@ihph.org.vn  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  689 ĐẶT VẤN ĐỀ  Vệ  sinh An  toàn  thực phẩm ngày  càng  trở  thành vấn đề thu hút nhiều sự quan tâm của xã  hội,  tác  động  đến  sự  phát  triển  kinh  tế,  ảnh  hưởng đến sức khỏe con người, đến chất lượng  cuộc sống và về  lâu dài còn ảnh hưởng đến sự  phát triển nòi giống, dân tộc(1).  Trong  quá  trình  sản  xuất,  vì mục  đích  lợi  nhuận, nên một số doanh nghiệp đã sử dụng tùy  tiện  những  hóa  chất  cấm,  gây  ảnh  hưởng  đến  sức khỏe người  tiêu dùng(1). Vào  tháng  5/2011,  Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Đài  Loan đã phát hiện hàng loạt chai nước giải khát  của  nhiều  hãng  nổi  tiếng  có  chứa  DEHP  và  DINP(1). Những  nghiên  cứu  hiện  nay  cho  thấy  DEHP, DINP  thuộc nhóm phthalate có  thể gây  ung  thư,  hủy  hoại  thận,  phá  hủy  hệ  thống  hormone của cơ  thể con người. Đối với  trẻ em,  nguy cơ mắc các bệnh hen suyễn và dị ứng là rất  cao, gây vô sinh  ở nữ và  làm giảm hàm  lượng  testosterone khiến chất lượng tinh trùng kém đi  ở nam.  Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên, việc  thực  hiện  “Xây  dựng  quy  trình  xác  định  hàm  lượng  DEHP,  DINP  trong  thức  uống”  là  cần  thiết. Từ đó sẽ ứng dụng quy trình này vào công  tác giám sát kiểm tra chất lượng an toàn vệ sinh  thực phẩm.  Giới thiệu về DEHP, DINP  DEHP,  DINP  là  dẫn  xuất  của  phthalate,  dạng hợp chất hữu cơ  lỏng không màu, không  mùi, dễ  hòa  tan  trong  ethylether,  ethanol, dầu  mỏ, dầu (mỡ) nhưng khó tan trong nước. Về mặt  hoá  học,  các  phthalate  là  những  este  của  acid  phthalic. Các este này đều có chung một gốc  là  acid phthalic,  chúng  chỉ  khác nhau phần  rượu  còn lại. Trong các este này, DEHP, DINP là chất  khá phổ biến và thông dụng. Chúng phổ biến vì  là chất hoá dẻo hữu hiệu nhất trong ngành công  nghiệp nhựa và chất dẻo(4).  DEHP ( Di‐(2‐ethylhexyl) phthalate)  DINP (Diisononyl phthalate)  Nguyên nhân DEHP, DINP  có  trong  thực  phẩm(3)  DEHP, DINP  có khả năng  tạo  độ nhớt,  độ  đục, độ đặc cho các chế phẩm. Loại hóa chất này  hiện diện  trong nhiều  sản phẩm như  đồ uống  thể  thao, nước ép  trái  cây,  sữa, mứt,  sữa  chua,  thạch,  thực  phẩm  chức  năng. DEHP, DINP  bị  thôi ra từ trong bao bì chứa thực phẩm như các  can,  chai  nhựa,  bát  nhựa,  đầu  ti  cho  trẻ  ngậm  trong  bình  sữa,  đồ  chơi  làm  bằng  chất  dẻo(5).  Ngoài  ra,  nhiều  nhà  sản  xuất  (chủ  yếu  ở  các  nước Châu Á) muốn  tăng  lợi nhuận nên đã sử  dụng DEHP, DINP cho vào thực phẩm nhằm hạ  giá thành thay vì sử dụng chất tạo đục được chế  biến từ cùi chanh, cam, bưởi với giá thành cao(1).  Tiêu  chuẩn  cho phép DEHP, DINP  trong  thực phẩm(1)  Năm 2011, Bộ Y tế Việt Nam ban hành quy  định  tạm  thời mức giới hạn nhiễm chéo DEHP  trong thực phẩm được cho phép là 1,5 mg/kg đối  với  thực  phẩm  rắn  và  lỏng  (không  bao  gồm  nước uống đóng chai).  DINP : Việt Nam chưa có quy định.  Mục tiêu nghiên cứu  Xây  dựng  quy  trình  xác  định  hàm  lượng  DEHP,  DINP  bằng  phương  pháp  sắc  ký  khí  ghép khối phổ(5).  Công thức phân tử: C 24 H 38 O 4 Khối lượng phân tử: 390.6  Công thức phân tử: C26H42O4  Khối lượng phân tử: 420,6   Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 690 Đánh giá quy trình phân tích xây dựng được  qua  các  thông  số(2,4):  độ  lặp  lại,  độ  tái  lập, hiệu  suất  thu hồi, giới hạn phát hiện, giới hạn  định  lượng, khoảng  tuyến  tính của chuẩn, độ không  đảm bảo đo.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Quy trình xác định hàm lượng DEHP, DINP  bằng máy sắc ký khí ghép khối phổ trên hai nền  mẫu thức uống là nước ép và sữa chua.  Phương pháp nghiên cứu  Phương pháp thu thập tài liệu  Dựa trên các công trình nghiên cứu liên quan  đã được công bố ngoài nước.   Phương pháp thực nghiệm  Sử dụng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ  để phân tích DEHP, DINP và áp dụng quy trình  phân tích mẫu thực tế.  Thiết bị phân tích: Máy sắc ký khí ghép khối  phổ GC‐MS .  Phương pháp phân tích số liệu  Sử dụng các phương pháp thống kê đánh giá  số liệu phân tích.  KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN  Xây dựng quy trình  Hiện nay, trên thế giới chưa có phương pháp  chuẩn để phân  tích DEHP và DINP  trong  thức  uống. Chính vì vậy, đa số các phòng thí nghiệm  tự xây dựng phương pháp phân  tích DEHP và  DINP phù hợp với trang thiết bị sẵn có.  Theo một số nghiên cứu, tách chiết DEHP,  DINP  trong  thức  uống  có  các  phương  pháp:  chiết lỏng – lỏng (liquid/liquid ), chiết pha rắn  (solid  phase  extraction),  sắc  ký  gel  (gel  permeation  chromatography)(3).  Trong  ba  phương pháp tách chiết trên, chiết lỏng – lỏng  được sử dụng nhiều nhất.  Bảng 1: Một số dung môi dùng để chiết DEHP,  DINP  Dung môi Nền mẫu Methanol: Diethyleter: n-Hexane (1:5:4) Thực phẩm lỏng n-Hexane Kem, sữa, phomai Acetonitrile Thực phẩm ăn kiêng Cyclohexane:Dichlometane (1:1) Thực phẩm Acetone: n-Hexan: Methanol (2:1:1) Thực phẩm dạng rắn Qua một  số hệ dung môi  đã  được nghiên  cứu  để  tách  chiết  DEHP,  DINP  trong  thực  phẩm  ở  bảng  1,  hệ  dung  môi  Methanol:  Diethyleter: n‐Hexane với tỷ lệ (1:5:4) được sử  dụng  tách  chiết DEHP, DINP  trong nền mẫu  thực phẩm dạng lỏng và đây cũng là nền mẫu  mà đề tài thực hiện.  Trong  quá  trình  xử  lý  mẫu  và  phân  tích  DEHP,  DINP  có  một  số  ảnh  hưởng:  (1)  do  phthalate  có  trong  không  khí  nên  hạn  chế  để  mẫu  tiếp xúc với môi  trường quá  lâu;  (2) dung  môi  chiết  có  thể  có DEHP, DINP nên  cần  thực  hiện kiểm  tra dung môi mỗi khi phân  tích;  (3)  dụng cụ cần sấy ở nhiệt độ cao để loại trừ yếu tố  nhiễm DEHP, DINP trong dụng cụ.  Quy trình xử lý mẫu  Cân  5g  mẫu  đã  được  đồng  nhất  vào  lọ  headspace 20ml, thêm 50l DEHP_d4 10ppm và  50l  DINP_d4  100ppm.  Hút  5ml  dung  dịch  Methanol: Diethyleter: n‐Hexan (1:5:4). Vortex 1  phút,  siêu  âm  5  phút,  ly  tâm  4500  vòng/  phút  trong 5 phút. Lấy lớp trên cho vào vial, đem đo  trên máy GCMS.  Trong  quy  trình  xử  lý mẫu DEHP, DINP  với  kỹ  thuật  chiết  lỏng  ‐  lỏng,  việc  sử  dụng  bình lóng có nhiều bất lợi hơn so với việc dùng  chai  Headspace  20ml.  Khi  dùng  bình  lóng,  dung môi sẽ tiêu tốn nhiều hơn, phải tìm giải  pháp loại trừ nhũ hóa, phải cô quay nhằm làm  giàu mẫu. Do  đó,  thời  gian  chiết mẫu  sẽ dài  hơn,  dụng  cụ  sử  dụng  nhiều  hơn,  số  lượng  mẫu cho mỗi lần chiết ít và có khả năng nhiễm  DEHP, DINP  từ môi  trường,  từ  dụng  cụ. Vì  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  691 vậy, việc sử dụng chai Headspace có nhiều ưu  điểm hơn so với dùng bình lóng.  Dụng cụ, trang thiết bị  Máy sắc ký khí khối phổ GC‐MS .  Máy ly tâm.  Cân phân tích chính xác đến 0,1mg .  Máy siêu âm.  Lọ headspace 20ml.  Bình định mức 10ml, 100ml.  Pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml.  Vial 1,5ml.  Hóa chất, thuốc thử  Chuẩn DEHP ≥99,0%   Chuẩn DINP ≥99,0%   Nội chuẩn DEHP_d4   Nội chuẩn DINP_d4   n_Hexan   Diethyl Eter   Nước cất   Điều kiện chạy máy(3)  Cột  sắc  ký  DB‐5MS  (30m  x  0,25mm  x  25  mcm).  Thể tích tiêm mẫu 1μl, không chia dòng.  Nhiệt độ buồng tiêm: 2800 C.  Nhiệt độ nguồn ion (EI): 2300 C.  Khí mang Heli, tốc độ 1ml/phút.  Đầu dò khối phổ:  chạy  đồng  thời 2  chế độ  quét toàn dãy và quét ion.  Quét toàn dãy: 50 – 400 m/z.  Quét  ion: DEHP:  149;  167;  279.  Ion  279  để  định lượng.   DEHP_d4 : 153   DINP: 149; 167; 293 . Ion 293 để định lượng.   DINP_d4 : 297  Tính toán kết quả  Hàm lượng DEHP, DINP được tính dựa vào  đường chuẩn, tương quan giữa tỷ lệ diện tích và  tỷ lệ nồng độ của chuẩn và nội chuẩn.  X = (V  Cm)/m  Trong đó:  ‐ m: lượng mẫu lấy (g)  ‐ V: thể tích dung môi chiết mẫu (ml)  ‐ Cm: nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đường chuẩn  (mg/kg).  ‐ X: hàm lượng DEHP/DINP trong mẫu thử (mg/kg)  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 692 Hình 1: Sắc ký đồ và khối phổ DEHP  Hình 2: Sắc ký đồ và khối phổ DINP  Để  khẳng  định  chắc  chắn DEHP, DINP  có  trong mẫu phân tích, ngoài việc căn cứ vào thời  gian lưu, sự có mặt của ion đặc trưng của DEHP,  DINP còn phải tính toán  tỷ  lệ diện tích  ion của  mẫu so với chuẩn. (xem bảng 2).  Cách kiểm tra này được áp dụng khi phân  tích mẫu thực để có thể kết luận chắc chắn và  chính xác mẫu  thật sự dương  tính với DEHP,  DINP.  Bảng 2: Tỷ lệ diện tích của ion trong chuẩn   Chất phân tích Tỷ lệ diện tích ion phụ so với ion chính Khoảng dao động cho phép DEHP 26% (ion 279/ion 149) ±15 % DINP 10% (ion 293/ion 149) ± 20% Quy trình phân tích DEHP, DINP được khảo  sát với các kết quả như sau:  Bảng 3: Bảng các thông số đánh giá quy trình phân  tích DEHP,DINP   Các thông số định trị DEHP DINP Khoảng tuyến tính từ 0,02-5µg/kg từ 2-50µg/kg Giới hạn phát hiện phương pháp 0,1 µg/g 1 µg/g Giới hạn định lượng phương pháp 0,3 µg/g 3 µg/g Độ lặp lại (n=10) 2,27-7,03% 2,66-6,69% Độ tái lập (n=10) 2,45-3,43% 2,66-6,53% Hiệu suất thu hồi (n=10) 90–107,47% 97,18-101,17% Độ không đảm bảo đo 13,63-18,37% 10,41-13,19% Nhìn  chung,  với  quy  trình  phân  tích  trên,  quá trình phân tích nhanh, đơn giản và hiệu quả.  Phương pháp  có  độ nhạy  cao,  ổn  định và  đáp  ứng  được  khả  năng  ứng  dụng  để  phân  tích  DEHP, DINP.  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  693 KIẾN NGHỊ  Quy  trình phân  tích chúng  tôi đã xây dựng  thích hợp để  triển khai phân  tích DEHP, DINP  trong  thức uống  trên  thị  trường. Do  đề  tài  chỉ  kiểm  chứng  quy  trình  phân  tích  trên  hai  nền  mẫu lỏng là nước ép và sữa chua, cần thực hiện  trên các nền mẫu rắn khác để mở rộng phạm vi  ứng dụng của phương pháp.  Ứng dụng quy  trình  đánh giá hàm  lượng  DEHP, DINP  trong một số  thức uống  trên  thị  trường.  Nghiên cứu kỹ  thuật xử  lý mẫu siêu chiết  pha  rắn  (SPME) kết hợp với hệ  thống  sắc ký  khí  ghép  khối  phổ  để  phân  tích  định  lượng  DEHP, DINP nhằm hạn  chế việc nhiễm  chéo  từ môi trường.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Cục  an toàn vệ sinh thực phẩm  (2011).  Bộ  Y  Tế  ban  hành  ngưỡng DEHP trong thực phẩm. Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm  Việt Nam. Tr. 5‐10.  2. Magnusson  B,  Naykki  T,  Hovind  H,  Krysell  M.  (2004).  Handbook  for  calculation  of  measurement  uncertainty  in  environmental  laboratories. Nordtest  report.  TR537:  06‐20.  Pp.  48‐90.  3. Thomas W  (2009). Method  for  determinationn  of  phthalates  in  food. JRC Scientific and Technical Reports. EUR 23682EN.  4. Trần Cao Sơn  (2010). Thẩm định phương pháp  trong phân  tích  hóa học và vi  sinh vật. NXB Khoa  học  và  kỹ  thuật. Hà Nội.  Tr.15‐58.  5. United  States  consumer  product  safety  commission  directorate  for  laboratory  sciences  division  of  chemistry  (2009).  Test Method: CPSC‐CH‐C1001‐09.1 Standard Operating  Procedure for Determination of Phthalates. Pp 5‐8.  Ngày nhận bài báo:       25/5/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   13/6/2014  Ngày bài báo được đăng:     14/11/2014