Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng của cao chiết hà thủ ô đỏ (polygonum multiflorum thunb.) kết hợp mè đen (sesamum indicum nigrum l.) trên chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch bởi Cyclophosphamid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 269 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM THUNB.) KẾT HỢP MÈ ĐEN (SESAMUM INDICUM NIGRUM L.) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BỊ SUY GIẢM MIỄN DỊCH BỞI CYCLOPHOSPHAMID Nguyễn Thị Phương Thùy∗, Nguyễn Phương Dung** TÓM TẮT Mở đầu - Mục tiêu nghiên cứu: Hà thủ ô đỏ và Mè đen được sử dụng trong Y học cổ truyền với tác dụng tăng cường sức khỏe, chống lão hóa... Với định hướng nghiên cứu thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng của cao chiết nước Hà thủ ô đỏ kết hợp Mè đen, đồng thời so sánh với tác dụng của cao chiết nước Hà thủ ô đỏ trên mô hình suy giảm miễn dịch thực nghiệm thông qua các chỉ tiêu thuộc chức năng miễn dịch không đặc hiệu. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xác định sự hiện diện của các nguyên liệu trong cao Hà thủ ô – Mè đen bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng. Định lượng polyphenol toàn phần trong Cao HTO-MĐ bằng phương pháp đo quang và xác định chỉ số acid theo Dược điển Việt Nam IV. Nghiên cứu tác dụng của cao chiết nước Hà thủ ô đỏ - Mè đen và cao chiết nước Hà thủ ô đỏ trên chuột bình thường và chuột bị gây suy giảm miễn dịch bởi chất ức chế miễn dịch cyclophosphamid (150 mg/kg, tiêm phúc mô). Kết quả đánh giá dựa trên các chỉ tiêu: công thức máu, trọng lượng các nội quan có liên quan đến chức năng miễn dịch, hàm lượng MDA và GSH trong gan. Kết quả: Đã xây dựng được một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen. Định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng cho thấy trong cao có sự hiện diện của 2 dược liệu. Hàm lượng polyphenol toàn phần trong cao là 0,2969%, chỉ số acid là 2,84. Kết quả khảo sát huyết học cho thấy cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen (20 g dược liệu/kg và 40 g dược liệu/kg, uống) và cao Hà thủ ô đỏ (20 g dược liệu/kg, uống) đều có tác dụng phục hồi sự giảm số lượng bạch cầu, tiểu cầu và phục hồi sự suy giảm hàm lượng hemoglobin gây bởi cyclophosphamid. Cao Hà thủ ô đỏ kết hợp Mè đen (40 g dược liệu/kg, uống) làm giảm sự gia tăng hàm lượng MDA và làm tăng hàm lượng GSH bị giảm trong gan chuột do cyclophosphamid có ý nghĩa thống kê. Kết luận: Cao Hà thủ ô – Mè đen đã được tiêu chuẩn hóa, làm cơ sở cho các nghiên cứu triển khai tiếp theo. Kết quả thực nghiệm dược lý có thể là cơ sở cho nghiên cứu sử dụng cao Hà thủ ô – Mè đen cho các dạng bào chế thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư. Từ khóa: Hà thủ ô đỏ, Mè đen, cyclophosphamid ABSTRACT STANDARDIZATION OF EXTRACTS COMBINED POLYGONUM MULTIFLORUM AND SESAMUM INDICUM NIGRUM AND STUDY ON EFFECTS OF THE EXTRACT ON CYCLOPHOSPHAMID-INDUCED IMMUNOSUPPRESSIVE MICE Nguyen Thi Phuong Thuy, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 269 - 276 ∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: ThS.DS. Nguyễn Thị Phương Thùy ĐT: 0987188759 Email: thuyntp.pharma@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 270 Background - Objectives: Polygonum multiflorum and Sesamum indicum nigrum are used in traditional medicine to enhance the health effects, anti-aging The aim of the study was to build the standard for the aqueous extract combined Polygonum multiflorum and Sesamum indicum nigrum and compare the effect of this extract in normal mice and cyclophosphamide-induced immunosuppressive mice with the effect of the aqueous extract from Polygonum multiflorum. Materials and methods: Chemical reactions and thin layer chromatography were used to identify the presence of herbal medicines in the extract. Quantitatitive determination of polyphenols in the extract by spectrophotometric method and the acid index by method in Vietnamese Pharmacopoeia IV. Cyclophosphamide (single dose at 150 mg/kg, intraperitoneal injection) was used to induce immuno suppressive model in mice. The observation indexes were CBC, the weight of immune-related organs (adrenal glands, liver, spleen, thymus), hepatic malondialdehyde and glutathione content. Results: Standards for testing of the aqueous extract combined Polygonum multiflorum and Sesamum indicum nigrum were established. Identification by chemical reactions and TLC showed the presence of herbal medicines. Polyphenol content was 0.2969%, the acid index was 2.84. The results indicated that both extracts effectively restored leukocyte, platelet and hemoglobin concentration depletion caused by cyclophosphamid. The aqueous extract combined Polygonum multiflorum and Sesamum indicum nigrum (40 g medicinal / kg, oral) reduced significantly concentration of MDA and increased significantly concentration of GSH in rat liver. Conclusion: The aqueous extract combined Polygonum multiflorum and Sesamum indicum nigrum has been standardized, as a basis for subsequent research. The pharmacological experimental results revealed that the extract could be a source for natural medicines which have supportive treatment for cancer patients. Key words: Polygonum multiflorum, Sesamum indicum nigrum, cyclophosphamid. ĐẶT VẤN ĐỀ Cyclophosphamid là một chất gây ức chế miễn dịch được sử dụng phổ biến trong hóa trị liệu ung thư trên lâm sàng và là một chất gây độc ức chế các chỉ tiêu liên quan đến chức năng miễn dịch trong các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật(1,5,11). Hà thủ ô đỏ và Mè đen là hai dược liệu phổ biến, dễ tìm và được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền với các tác dụng như: tăng cường sức khỏe, chống lão hóa, bổ huyết, nhuận tràng, giải độc, kích thích mọc tóc, làm đen tóc, giúp sống lâu(4,8,9). Với định hướng nghiên cứu thuốc từ dược liệu giúp hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân bị ung thư, đề tài này được tiến hành nhằm xây dựng một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng của cao chiết nước Hà thủ ô đỏ kết hợp Mè đen, đồng thời so sánh với tác dụng của cao chiết nước Hà thủ ô đỏ trên mô hình suy giảm miễn dịch thực nghiệm bằng cyclophosphamid thông qua các chỉ tiêu thuộc chức năng miễn dịch không đặc hiệu. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dược liệu nghiên cứu là Hà thủ ô đỏ (đã được chế với Đậu đen) và Mè đen, được cung cấp bởi nhà thuốc Vĩnh Sanh. Cao nước được chiết bằng cách đun nguyên liệu 2 lần với nước nóng, mỗi lần trong 1 giờ ở 100 0C, rồi cô cách thủy dịch chiết. Bảng 1: Hiệu suất và độ ẩm của các cao chiết. Cao Hà thủ ô Cao Hà thủ ô kết hợp Mè đen Hiệu suất chiết 27,5% 17,52% Độ ẩm 16% 13,47% Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng cái, chủng Swiss albino, 5- 6 tuần tuổi, trọng lượng 23-25g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – TP. Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Thể tích cho uống hay tiêm là 10 ml/kg thể trọng chuột. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 271 Hóa chất – Thiết bị Hóa chất: Chất chuẩn acid gallic (Merck Co. Germany); Endoxan® chứa 534,5 mg cyclophosphamid monohydrat tương đương với 500 mg cyclophosphamid khan (Baxter Oncology GmbH, Germany); Silymarin (Sigma Co.Ltd, USA). Thiết bị: Tủ sấy hiệu Memmert (Đức), lò nung Carbolite CSF 1200 (Anh) FLF11/14, máy đo UV-Vis Hitachi U-2010 (Nhật), máy ly tâm Sigma 3K30, Nhật. Phương pháp nghiên cứu Xây dựng một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao HTO-MĐ (2,3). Cảm quan: Trải 2 g chế phẩm lên mặt kính đồng hồ, quan sát bằng mắt thường. Xác định tro toàn phần (PL 9.8, Dược Điển Việt Nam IV): Dùng 1 g cao HTO-MĐ. Mất khối lượng do làm khô (PL 9.6, Dược Điển Việt Nam IV): Dùng 1 g cao HTO-MĐ. Cắn không tan trong nước: Hòa tan 1,0 g chế phẩm trong 50 ml nước cất, lọc thu cắn và sấy khô ở 100 – 150 0C đến khối lượng không đổi. Định tính bằng phương pháp hóa học: Thực hiện các phản ứng hóa học để xác định sự hiện diện của anthranoid và acid béo trong cao. Hợp chất anthranoid: có màu đỏ trong môi trường kiềm (phản ứng Bortrager). Acid béo: có vết trong mờ trên giấy. Định tính bằng phương pháp SKLM (PL 5.4, Dược Điển Việt Nam IV): Lấy 0,2g cao chiết Hà thủ ô đỏ - Mè đen để chiết dung dịch mẫu thử, 0,25g bột Hà thủ ô đỏ và 0,25g bột Mè đen để chiết dung dịch mẫu chuẩn. Mẫu cao hay bột dược liệu được thêm 20 ml ethanol 96% (TT), đun hồi lưu cách thủy trong 30 phút, lọc, để bay hơi đến cắn khô. Cắn thêm vào 10 ml nước và 1 ml dung dịch HCl 10 % (TT) đun cách thủy 30 phút, để nguội sau đó lắc với 20 ml ether ethylic (TT) 2 lần, dich ether bay hơi còn khoảng 1 ml dùng làm dung dịch chấm sắc ký. Bản mỏng: Silicagel G F254. Dung môi khai triển: Ethyl acetat – methanol - nước (100:17:13). Thể tích chấm: 20 µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Phát hiện: soi UV 365 nm. Xác định chỉ số acid (PL 7.2 – Dược Điển Việt Nam IV): Dùng 10g chế phẩm. Định lượng polyphenol toàn phần: theo phương pháp Folin-Ciocalteu. Cân chính xác 0,5000 g cao HTO-MĐ, hòa tan trong nước cất, lọc và định mức chính xác trong bình 100 ml. Thực hiện phản ứng với thuốc thử Folin Ciocalteu trong môi trường kiềm. Hỗn hợp phản ứng được lắc kỹ, để yên 2 giờ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, đem đo quang ở bước sóng 758 nm. Hàm lượng polyphenol trong mẫu thử được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn acid gallic. Bố trí thí nghiệm dược lý (6,7,10). Chuột thí nghiệm được chia thành 2 nhóm: Nhóm bình thường (CY(-)) và nhóm bị gây suy giảm miễn dịch (CY(+): tiêm phúc mô liều duy nhất cyclophosphamid 150 mg / kg thể trọng). Mỗi nhóm được chia làm 5 lô: Lô chứng (uống nước cất.); 3 lô thử (uống cao Hà thủ ô (cao HTO) liều 20g dược liệu/ kg và cao Hà thủ ô - Mè đen (cao HTO-MĐ) liều 20g dược liệu/ kg và 40g dược liệu/ kg); Lô đối chiếu (uống silymarin 100mg/kg). Cao được hòa trong nước cất và cho chuột uống liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamid 150 mg/kg. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng lấy máu khảo sát về huyết học hay mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH. Khảo sát huyết học Máu tĩnh mạch đuôi chuột được pha loãng bằng dung dịch ly giải hồng cầu. Đếm số lượng bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu và xác định Hb, Hct bằng máy huyết học tự động. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 272 Trọng lượng tương đối của các cơ quan liên quan đến hệ miễn dịch Tách lấy gan, lách, tuyến ức, tuyến thượng thận để xác định trọng lượng tương đối của các cơ quan bằng công thức: g %=(Pcq/Pct)*100 Pcq: Trọng lượng của cơ quan; Pct: Trọng lượng cơ thể chuột tại thời điểm khảo sát. Xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) và glutathion (GSH) trong gan chuột Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 %. Lấy 1-2 ml dịch đồng thể, thêm dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vđ 3 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút, dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10% và ly tâm lấy dịch trong. Định lượng MDA: Lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 100oC trong 15 phút và đo quang ở λ = 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/ml dịch đồng thể) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. Định lượng GSH: Lấy 1 ml dịch trong cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5’– dithiobis–(2–nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA phosphat vừa đủ 3 ml. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/ml dịch đồng thể) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH. Đánh giá kết quả Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: M ± SEM (Standard Error of the Mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê dựa vào phép kiểm t-student, One– Way ANOVA (hay Student-Newman-Keuls test (phần mềm SigmaStat-3.5) với độ tin cậy 95% (P < 0,05). KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Kết quả xác định các chỉ tiêu kiểm nghiệm cao HTO-MĐ Mất khối lượng do làm khô của cao HTO- MĐ là 13,47% < 20%, đạt yêu cầu của cao đặc theo Dược điển Việt Nam IV. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học và SKLM cho thấy trong cao có sự hiện diện của Hà thủ ô đỏ (thành phần chính là anthranoid) và Mè đen (thành phần chính là acid béo). Bảng 2: Kết quả xác định các chỉ tiêu hóa lý của cao HTO-MĐ. Chỉ tiêu Tiến hành Kết quả Cảm quan Quan sát bằng mắt thường Cao đặc HTO-MĐ có thể chất mềm, đồng nhất, màu nâu sẫm. Xác định tro toàn phần Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 6,12 ± 0,36 % Mất khối lượng do làm khô Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 13,47 ± 0,25 % Cắn không tan trong nước Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 2,33 ± 0,12 % Xác định chỉ số acid Số lần lặp lại thí nghiệm: 3 2,84 ±0,031 Định tính Phản ứng hóa học Anthranoid Tạo màu đỏ trong môi trường kiềm ++ Acid béo Vết trong mờ trên giấy lọc + SKLM Dung môi khai triển: Ethyl acetat – methanol - nước (100:17:13). Phát hiện: soi UV 365 nm Cao HTO-MĐ có 3 vết có cùng Rf với mẫu chuẩn Hà thủ ô đỏ và có 1 vết có cùng Rf với mẫu chuẩn Mè đen Kết quả định lượng polyphenol toàn phần trong cao HTO-MĐ Từ tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD 758 nm, xây dựng được phương trình đường chuẩn của chất chuẩn acid gallic là: 0021,0014,0 −= xy (R2 = 0,9955). Bảng 3: Tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD 758 nm. Hàm lượng acid gallic (µg) OD trung bình (758 nm) 10 0,132 ± 0,007 20 0,285 ± 0,005 30 0,410 ± 0,002 40 0,582 ± 0,002 50 0,685 ± 0,007 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 273 Bảng 4: Kết quả định lượng polyphenol toàn phần của cao HTO-MĐ. OD 758 nm Hàm lượng polyphenol / cao HTO-MĐ (%) Lần 1 0,203 0,2980 Lần 2 0,208 0,3035 Lần 3 0,193 0,2893 Trung bình 0,205 0,2969 SEM 0,0044 0,0041 Từ những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đề nghị một số tiêu chuẩn chất lượng cho cao chiết Hà thủ ô – Mè đen Bảng 5: Bảng tiêu chuẩn chất lượng của cao HTO- MĐ. Chỉ tiêu Mức chất lượng Chỉ tiêu Mức chất lượng Cảm quan Cao đặc Hà thủ ô đỏ - Mè đen có thể chất mềm, đồng nhất, màu nâu sẫm. Xác định tro toàn phần Không quá 7 % Mất khối lượng do làm khô Không quá 20,0 % Cắn không tan trong nước Không quá 3 %. Định tính Có phản ứng đặc trưng của anthranoid (phản ứng Bortrager). Có vết trong mờ trên giấy. SKLM: mẫu thử (cao chiết) phải có sự hiện diện của Hà thủ ô đỏ và Mè đen Định lượng polyphenol toàn phần Cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen phải có hàm lượng polyphenol toàn phần > 0,27% Xác định chỉ số acid béo Cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen phải có chỉ số acid > 2,5. Kết quả khảo sát huyết học trên chuột nhắt trắng tiêm cyclophosphamid Bảng 6: Tác dụng của các cao thử trên số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, Hemoglobin và Hematocrit. Nhóm Lô (N=10 – 12) Số lượng hồng cầu (M/µL) Số lượng bạch cầu (K/µL) Số lượng tiểu cầu (K/µL) Hemoglobin (g/dL) Hematocrit (%) CY (-) Chứng 1 5,99 ± 0,51 5,90 ± 0,59 500, 0 ± 54,24 10,92 ± 0,47 33,35 ± 2,72 Cao HTO 20g DL/kg 5,18 ± 0,32 5,57 ± 0,67 443,93 ± 50,61 9,86 ± 0,47 29,39 ± 1,12 Cao HTO-MĐ 20g DL/kg 5,82 ± 0,25 5,30 ± 0,45 499,33 ± 40,21 10,0 ± 0,44 29,57 ± 1,29 Cao HTO- MĐ 40g DL/kg 5,99 ± 0,31 6,33 ± 1,15 459,44 ± 49,32 10,50 ± 0,46 31,56 ± 1,41 Silymarin 100mg/kg 6,03 ± 0,13 5,40 ± 0,61 432,0 ± 69,91 10,80 ± 1,0 30,25 ± 3,11 CY (+) Chứng 2 5,24 ± 0,21 3,31 ± 0,42# 204,22 ± 20,78# 7,80 ± 0,50# 27,30 ± 1,23 Cao HTO 20g DL/kg 5,25 ± 0,17 5,32 ± 0,64* 295,5 ± 22,84* 9,46 ± 0,25* 26,89 ± 0,87 Cao HTO-MĐ 20g DL/kg 5,42 ± 0,17 5,80 ± 0,51* 250,0 ± 23,99 9,60 ± 0,22* 27,40 ± 0,98 Cao HTO- MĐ 40g DL/kg 4,94 ± 0,18 5,15 ± 0,70* 332,5 ± 43,62* 9,10 ± 0,32* 26,15 ± 0,75 Silymarin 100mg/kg 4,81 ± 0,34 5,45 ± 0,49* 232,5 ± 14,28 8,40 ± 0,56 24,75 ± 1,77 # P< 0,05 so với lô chứng CY(-), *P< 0,05 so với lô chứng CY(+) tương ứng. Nhận xét và bàn luận kết quả ở Bảng 6: Lô chứng bệnh lý CY(+) Lô chứng bệnh lý có số lượng bạch cầu, tiểu cầu và hemoglobin giảm có ý nghĩa so với lô chứng bình thường. Điều này tương đồng với các tác dụng phụ của cyclophosphamid trên người: gây suy tủy ở các mức độ khác nhau, liên quan đến giảm bạch cầu, tiểu cầu và gây thiếu máu kèm giảm hemoglobin. Lô thử CY(+) Số lượng hồng cầu, Hematocrit: ở nhóm tiêm cyclophosphamid không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường không tiêm cyclophosphamid. Các mẫu thử cũng như silymarin không có ảnh hưởng trên chỉ tiêu số lượng hồng cầu và hematocrit. Số lượng bạch cầu: số lượng bạch cầu ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho uống các cao HTO, cao HTO-MĐ hay Silymarin đều tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, chứng tỏ các mẫu cao thử đều có tác dụng phục hồi sự suy giảm số lượng bạch cầu gây bởi cyclophosphamid. Số lượng tiểu cầu: số lượng tiểu cầu ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho cao HTO hay cao HTO-MĐ liều 40 g dược liệu/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, chứng tỏ các mẫu cao thử đều có tác dụng phục hồi sự suy giảm số lượng tiểu cầu gây bởi cyclophosphamid. Silymarin không ảnh hưởng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 274 trên sự suy giảm số lượng tiểu cầu gây bởi cyclophosphamid. Hàm lượng hemoglobin: hàm lượng hemoglobin ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho uống cao HTO hay cao HTO-MĐ tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, chứng tỏ các mẫu cao thử đều có tác dụng phục hồi sự suy giảm hàm lượng hemoglobin gây bởi cyclophosphamid. Silymarin không ảnh hưởng trên sự suy giảm hàm lượng hemoglobin gây bởi cyclophosphamid. Trọng lượng gan, lách, tuyến ức, tuyến thượng thận Bảng 7: Trọng lượng gan và lách ở các lô. Nhóm Lô (N=10-12) Gan (g%) Lách (g%) Tuyến ức (g%) Tuyến thượng thận (g%) CY (-) Chứng 1 6,26 ± 0,24 0,55 ± 0,07 0,26 ± 0,03 0,03 ± 0,0 Cao HTO 20g DL/kg 5,47 ± 0,26 0,52 ± 0,04 0,25 ± 0,04 0,03 ± 0,0 Cao HTO-MĐ 20g DL/kg 5,23 ± 0,17 0,58 ± 0,04 0,26 ± 0,02 0,03 ± 0,0 Cao HTO- MĐ 40g DL/kg 5,50 ± 0,36 0,58 ± 0,04 0,27 ± 0,04 0,03 ± 0,0 Silymarin 100mg/kg 5,62 ± 0,12 0,53 ± 0,04 0,29 ± 0,02 0,03 ± 0,0 CY (+) Chứng 2 4,32 ± 0,42 # 0,48 ± 0,06 0,12 ± 0,02 # 0,03 ± 0,0 Cao HTO 20g DL/kg 5,71 ± 0,34 * 0,89 ± 0,05 * 0,10 ± 0,01 0,04 ± 0,0 * Cao HTO-MĐ 20g DL/kg 5,69 ± 0,30 * 0,86 ± 0,09 * 0,15 ± 0,02 0,03 ± 0,0 Cao HTO-MĐ 40g DL/kg 5,06 ± 0,25 0,77 ± 0,09 * 0,12 ± 0,02 0,03 ± 0,0 Silymarin 100mg/kg 5,83 ± 0,38 * 0,76 ± 0,07 * 0,16 ± 0,02 0,04 ± 0,0 * # P< 0,05 so với lô chứng CY(-),*P< 0,05 so với lô chứng CY(+) tương ứng. Nhận xét kết quả Bảng 7: Trọng lượng gan: Lô tiêm cyclophosphamid giảm đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường. Trọng lượng gan ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho uống cao HTO hay cao HTO-MĐ (20 g dược liệu/kg) hay silymarin tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng, chứng tỏ các mẫu cao thử đều có tác dụng phục hồi sự suy giảm trọng lượng gan gây bởi cyclophosphamid. Trọng lượng lách: Lô tiêm cyclophosphamid không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường. Trọng lượng lách ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho uống Cao HTO, Cao HTO-MĐ hay silymarin đều tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng. Trọng lượng tuyến ức: Lô tiêm cyclophosphamid giảm đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường. Trọng lượng tuyến ức ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho uống Cao HTO hay Cao HTO-MĐ cũng như silymarin đều chưa có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng. Trọng lượng tuyến thượng thận: Lô tiêm cyclophosphamid không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với nhóm bình thường. Trọng lượng tuyến thượng thận ở nhóm tiêm cyclophosphamid và cho uống Cao HTO hay silymarin đều tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tương ứng. Kết quả này cần được kiểm tra lại khi nghiên cứu tiếp tục. Kết quả khảo sát hàm lượng MDA và GSH trong gan sau khi gây suy giảm miễn dịch Nhận xét và bàn luận kết quả Trên chuột bình thường, không tiêm CY: Cao HTO có tác dụng làm tăng hàm lượng MDA trong gan, nhưng không có tác dụng trên hàm lượng GSH. Các lô uống cao HTO-MĐ hay silymarin có hàm lượng MDA và GSH không thay đổi đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao HTO-MĐ hay silymarin không có tác dụng trên hàm lượng MDA hay GSH trong gan của chuột bình thường. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 275 Bảng 8: Kết quả khảo sát hàm lượng MDA và GSH trong gan. Nhóm Lô (N=10 – 12) Hàm lượng MDA (nM/g protein) Hàm lượng GSH (nM/g protein) CY (-) Chứng 1 108,58 ± 9,02 11564,4 ± 319,9 Cao HTO 20g DL/ kg 146,65 ± 6,77 * 11797,7 ± 1022,2 Cao HTO-MĐ 20g DL/ kg 137,60 ± 6,97 11154,4 ± 771,8 Cao HTO-MĐ 40g DL/ kg 128,69 ± 6,71 11621,2 ± 879,4 Silymarin 100mg/kg 113,23 ± 9,59 11243,0 ± 857,5 CY (+) Chứng 2 187,08 ± 9,40 # 8638,8 ± 425,4 # Cao HTO 20g DL/ kg 166,14 ± 11,65 9000,8 ± 579,8 Cao HTO-MĐ 20g DL/ kg 167,43 ± 9,38 9085,6 ± 388,8 Cao HTO-MĐ 40g DL/ kg 159,48 ± 6,42 * 10164,6 ± 492,3 * Silymarin 100mg/kg 136,55 ± 9,39 * 12017,3 ± 1191,1 * # P< 0,05 so với lô chứng CY(-) *P< 0,05 so với lô chứng CY(+) tương ứng. MDA gan là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan, hàm lượng MDA trong gan càng cao chứng tỏ gan bị tổn thương oxy hóa càng nặng. Lô chứng tiêm cyclophosphamid và uống nước cất trong 8 ngày có hàm lượng MDA trong gan tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường, chứng tỏ cyclophosphamid gây tổn thương peroxy hóa tế bào gan dẫn đến việc làm tăng hàm lượng MDA trong gan. Kết quả bảng 4 cũng ghi nhận là có sự giảm hàm lượng GSH ở lô chứng tiêm cyclophosphamid so với lô chứng sinh lý CY (-). Điều này cho thấy GSH và những nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein và N-acetylcystein) với chức năng giải độc đã thông qua hệ thống cytocrom P-450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa của cyclophosphamid trong cơ thể. Độc tính của cyclophosphamid tăng kéo theo sự suy giảm GSH nội sinh trong gan, do đó gián tiếp làm tăng quá trình peroxy hóa lipid dẫn đến hàm lượng MDA tăng. Hàm lượng MDA trong gan của các lô thử tiêm cyclophosphamid và uống cao HTO có xu hướng giảm, tuy nhiên kết quả này chưa có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Hàm lượng MDA trong gan của các lô thử tiêm cyclophosphamid và uống cao HTO-MĐ liều 40 g dược liệu/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao HTO-MĐ liều 40 g dược liệu/kg có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan theo cơ chế chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA trong gan gây bởi CY. Hàm lượng GSH trong gan của các lô thử tiêm cyclophosphamid và uống cao HTO chưa có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Hàm lượng GSH trong gan của các lô thử tiêm cyclophosphamid và uống cao HTO-MĐ liều 40g dược liệu/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, chứng tỏ cao HTO-MĐ liều 40 g dược liệu/kg có tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm phục hồi hàm lượng GSH trong gan bị suy giảm do CY. Kết quả bảng 8 còn cho thấy tác dụng của cao HTO-MĐ liều 40g dược liệu/kg tương đương với silymarin, một chất chống oxy hóa đã được nghiên cứu rất nhiều, được sử dụng trong thời gian dài và cho hiệu quả đáng tin cậy. KẾT LUẬN Cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen đã được xây dựng một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm về cảm quan, tro toàn phần (≤ 7%), mất khối lượng do làm khô (≤20%), cắn không tan trong nước (≤ 3%), định tính xác định Hà thủ ô đỏ và Mè đen (bằng phản ứng hóa học và SKLM), chỉ số acid (> 2,5) và hàm lượng polyphenol toàn phần (> 0,27%). Cao Hà thủ ô đỏ – Mè đen và cao Hà thủ ô đỏ đều có tác dụng phục hồi sự giảm số lượng bạch cầu, tiểu cầu và sự suy giảm hàm lượng hemoglobin gây bởi độc tính của cyclophosphamid. Ở liều 40 g dược liệu / kg, cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen đã làm giảm 14,75% hàm lượng MDA và làm tăng 17,66% hàm lượng GSH, tốt hơn cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen (20 g Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 276 dược liệu/kg) và cao Hà thủ ô đỏ trong cùng điều kiện thử nghiệm. Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao Hà thủ ô đỏ - Mè đen (40g dược liệu/kg) tương đương với chất đối chiếu silymarin (100mg, uống). Những kết quả thu được góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm chất lượng cao chiết Hà thủ ô đỏ - Mè đen, làm cơ sở cho các nghiên cứu triển khai tiếp theo. Kết quả thực nghiệm dược lý có thể là cơ sở cho nghiên cứu sử dụng cao Hà thủ ô – Mè đen cho các dạng bào chế thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abraham P, Sugumar E (2008), “Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamid: a defense mechanism?”, Exp. Toxicol. Pathol., 59(5), 301-306. 2. Bộ Y Tế và Bộ Giáo dục Đào tạo (1998), Bài giảng dược liệu tập 1, tr. 225-227, 247-249, 370. 3. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, tr. 682, 756-757, 772-773, PL-157, PL-182 -183, PL-239-240. 4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 833 - 836, 898-900. 5. Kumar RA, Sridevi K, Kumar NV, Nanduri S, Rajagopal S (2004), “Anticancer and immunostimulatory compounds from Andrographis paniculata”, J. Ethnopharmacol., 92(2-3), 291-295. 6. Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008). “Tác dụng của Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm. F. Nees, Acanthaceae) trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid”. Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 12 (4), tr.142-147. 7. Ngô Quốc Hận, Nguyễn Thị Thu Hương (2011). “Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của polysaccharid chiết từ nấm linh chi vàng (Ganoderma colossum)”. Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 15, Phụ bản của số 1, 50 - 55. 8. Nguyễn Phương Dung (2008). “Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp bào chế đối với tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) trên chuột nhắt trắng”. Y học TP. Hồ Chí Minh, 12(4), tr.75 - 79. 9. Nguyễn Phương Dung (2007). “Ảnh hưởng của phương pháp bào chế đối với tác dụng bổ huyết của Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) trên chuột nhắt trắng thiếu máu thực nghiệm”. Y học TP. Hồ Chí Minh, 11(2), tr.121 - 125. 10. Nguyễn Thị Thu Hương, Trịnh Văn Tấn (2011). “Nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch của nấm linh chi đỏ trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid”. Tạp chí Dược liệu, tập 16(1+2), tr. 69 - 74. 11. Sato M, Shiozawa K, Uesugi T, Hiromatsu R, Fukuda M, Kitaura K, Minami T, Matsumoto S (2009). “Effects of 2- or 4- week repeated to dose studies and fertility study of cyclophosphamid in female rats”. The Journal of Toxicologycal Sciences, Vol 34, Special Issue I, pp. SP83 – SP89 Ngày nhận bài báo : 20/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo : 24/10/2013 Ngày bài báo được đăng : 02/01/2014