Khóa luận Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố

1. Việc phát hiện một tỷ lệ cao ngô trước thu hoạch đã nhiễm mốc, đặc biệt là Aspergillus cho ta thấy công tác sơ chế ngô (tẽ hạt, làm khô, đóng gói) có ý nghĩa rất quan trọng. Vì theo kết quả nghiên cứu của nhiều nước, nếu ngô không kịp làm khô sau 3 đến 6 ngày độc tố nấm sẽ tăng lên nhanh chóng. Vì vậy cần giới thiệu cho bà con nông dân phương pháp sấy thuận lợi khi thu hoạch ngô, cũng như việc bảo quản ngô, lạc sau thu hoạch. 2. Việc sử dụng môt số loại nấm có tính đối kháng với có khả năng tạo độc tố cần được nghiên cứu thêm để có thể ứng dụng vào thực tiễn phòng trừ aflatoxin trên nông sản bằng phương pháp sinh học.

doc69 trang | Chia sẻ: linhlinh11 | Ngày: 25/12/2018 | Lượt xem: 95 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ng biện pháp tương tự dựa trên sự phát quang đã được đề xuất đối với hạt dẻ và hạt bông [24]. 2.4.4. Các quy trình chiết xuất bằng dung môi: Việc chiết xuất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện: - Aflatoxin có thể được loại trừ hoàn toàn một cách cơ bản trong điều kiện thuận lợi. - ít có khả năng tạo từ aflatoxin những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng. - Việc chiết xuất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất mát dinh dưỡng trong nhiều trường hợp. Những điều bất lợi: Cần phải có thiết bị chiết xuất dung môi đặc biệt. Sẽ chiết xuất luôn một số thành phần hoà tan cùng aflatoxin. Giá thành của việc chiết xuất cao. Có thể bị mất mùi của sản phẩm xử lý. Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu xuất thu hồi chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa là độc tính của dung môi và dư lượng của chúng và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy, dễ nổ điểm sôi của dung môi. Các aflatoxin có thể được chiết xuất bằng các dung môi như cloroform/nước, axeton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hoả/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan- metanol, hexan- etanol, hexan-etanol-nước, hexan – axeton – nước. Hệ thống bao gồm 54% axeton, 44% hexan và 2% nước (tính theo khối lượng) đã tìm thấy một trong những hệ thống thành công nhất có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12 -15% dầu, dư lượng lipit gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg. 2.4.5. Các phương pháp khử độc tố bằng hoá chất: Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. những hoá chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrrochlorit và etanolamin. Các hoá chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thoả mãn các tiêu chuẩn sau: Phải phá huỷ hay khử aflatoxin. - Nó phải không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng. Phải phá huỷ các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm. Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Đáng tiếc, nhiều hoá chất khảo sát đã không thoả mãn tất cả những tiêu chuẩn trên. Mặc dù chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có các tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hoá chất có hiệu quả trong việc phá huỷ aflatoxin thoả mãn những tiêu chuẩn trên. Những hoá chất này bao gồm hydrogen peroxit hay những chất oxy hoá tương tự, canxihydroxit, canxihydroxit/formaldehyt, natrihydroxit, natrihypochlorit, dimetylamin hay metylamin và amoniac. Trong số này, hydrogen peroxit, natri hydroxit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi đó dimetylamin, metylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu hay ngô. Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng rộng rãi trong việc xử lý thức ăn nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Về cơ chế ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến aflatoxin B1 bởi amoniac. 2.5. Vấn đề phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản: Để phòng chống nấm mốc và độc tố người ta đã áp dụng những biện pháp khác nhau. Để phòng chống nấm mốc người ta áp dụng: Làm khô bằng nhiệt: làm khô tự nhiên (phơi dưới ánh nắng mặt trời). Sấy khô (than, điện) làm cho cơ chất đạt lượng nước cho phép. Ví dụ: ngô cần làm khô tới ≤13% trước khi bảo quản. Phần lớn các loại nấm mốc phát triển tốt ở hàm lượng nước trong cơ chất 18-25%. Chiếu xạ: chiếu xạ tia cực tím, tia λ với mục đích tiêu diệt các loại vi khuẩn, nấm mốc để làm giảm sự thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biến đổi các cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleotit, protein, làm tác động chuyển hoá tế bào, tác dụng diệt nấm, vi khuẩn. Phần lớn các loài nấm mốc đều bị diệt ở liều 4,5 kGy (1kGy =100 krad = 1kj/kg). Sử dụng các loại khí: Methylbromid ở liều 129 mg/l/h hoặc 40mg/l/h có thể diệt được nhiều loài nấm mốc. Khí ozon ở liều 10mg/m3 không khí được tiếp xúc liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản sự phát triển của nấm mốc. Khí CO2 được ứng dụng trong bảo quản lương thực trong túi PE kín có thể chống được nấm mốc. Hoá học: được ứng dụng và nghiên cứu do tính chất an toàn của một số hoá chất, đặc biệt là axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic, axit benzoic, các muối Na và Ca của chúng như canxi propionat hay natriropi, ở liều 1 - 3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc trong thời gian dài. Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na2SO3, KHSO2, NaHSO3, Na2S2O5, thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật (tinh dầu cam ở liều 0,2%) có thể ức chế đựoc nhiều loài nấm mốc, mentho liều 1,1%, một số tinh dầu khác: tinh dầu hôi, tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng ức chế nấm mốc. Sinh học: dùng các loại lá cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấm mốc trong thực phẩm. VD: dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit formic. Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn. Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13%, có thể kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày. Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì aflatoxin có thể chịu được nhiệt độ >100-105 0C. Nếu chiếu xạ 10KGy thì sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Dùng hấp ướt (autoclave) 1,5at trong 60 phút nhưng lại có ít giá trị ứng dụng trong thực tế. Phương pháp hấp thụ: các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic, than hoạt tính có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hoá, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngoài qua phân. Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxy hoá khử Na2SO4, NaHSO3 1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin. Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo) hoặc trong các túi P.E có thể chứa tới 20-30 tấn ngô. Ngô có hàm lượng aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1,5 % NH3 ở nhiệt độ 320C dã làm giảm xuống còn 7ppb. Phần III: Vật liệu và các phương pháp nghiên cứu 3.1. Vật liệu: 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Trong quá trình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 30 mẫu ngô, bao gồm: 21 mẫu ngô được lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ An. 7 mẫu ngô được lấy tại một số cửa hàng ở thị trường Nghệ An và Hà Nội, 4 mẫu được lấy tại thị trường Đồng Nai 4 mẫu lạc lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ An và 15 mẫu lấy tại thị trường Đồng Nai 3.1.2. Các môi trường PDA: * Môi trường thạch khoai tây (PDA): 200 g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4.500 ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây. 1000 ml dịch chiết khoai tây 20 g glucoza 20 g thạch Đun cho tan chạy thạch và glucoza, thử pH, rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1 at trong 30 phút, pH = 6. 3.1.3. Môi trường Czapex – Dox (g/l): Sacaroza 30 NaNO3 3 K2HPO4 1 MgSO4.7H2O 0,5 KCL 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 Thạch 20 Nước 1lít pH = 5 – 6. Khử trùng 0,8 at/30 phút 3.1.4. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B1 NaCL tinh khiết (Trung Quốc) Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc kí lớp mỏng. NaSO3 khan (Trung Quốc). NaHCLO, Nhà máy hóa chất Việt Trì. H2O2 Công ty dược phẩm Hà Nội. Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc). Nước cất (Viện công nghệ sau thu hoạch). Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma). 3.1.5. Dụng cụ thí nghiệm: Buồng sắc kí lớp mỏng (chromatography tank), Thụy Sĩ. Đèn cực tím sóng dài 254 nm, 366 nm, Camag, Thụy Sĩ. Bản mỏng cho sắc ký 20x20 cm, Đức. Phễu chiết phân tách pha dung môi, Trung Quốc. Máy nghiền đồng thể polytron. ống hút 0,2 ml và 0,1 ml, Trung Quốc. Máy lắc, máy xay. Bình phun dung dịch lỏng có quả roa. Giấy lọc Whatman N01, chemapoli, Tiệp Khắc. Kính hiển vi olympus có gắn máy chụp ảnh, Nhật. Tủ cấy vô trùng tự động, Tủ cấy vô trùng tự động, Sanyo, Nhật Bản Máy có chân không quay, Đức Hộp petri, bình tam giác, ống đong 50ml, 100ml.. 3.2. Phương pháp: 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố aflatoxin: Tiến hành lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu của FAO [32] Cách lấy mẫu ngô bắp: lấy khoảng 50 hạt mỗi giống, ở 3 vị trí của bắp đầu, giữa, cuối, sau đó trộn đều, dàn mỏng thành hình vuông hay chữ nhật. Lấy theo kiểu đường chéo đến khi nào được 50 hạt thì dừng. Cách lấy mẫu lạc: Lạc được lấy từ các hộ nông dân trong tình trạng đã phơi khô và bảo quản trong các bao, lấy 1kg làm đại diện cho mỗi mẫu. Mỗi đại diện của từng mẫu trôn đều rồi chia tư. Từ một phần tư mẫu lại tiêp tục chia tư cho tới khi được 100 làm mẫu phân tích. Đối với các mẫu ngô thu thập từ các chợ, khối hạt ngô được trộn đều lấy 1kg làm đại diện. Một đại diện được xay nhỏ, trộn đều rồi chia tư, một phần từ đó lại được trộn đều và chia tư lấy 100g làm mẫu phân tích. 3.2.2. Phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm mốc bên trong hạt ngô; lạc. Mức độ nhiễm này được tính bằng phần trăm hạt bị nhiễm từ bên trong hạt lương thục, được tiến hành theo phương pháp phát hiện hệ nấm mốc bên trong hạt lương thực của Christensen [22]. Khử trùng hệ nấm mốc bên ngoài hạt bằng dung dịch H2O2 5% trong 6 - 7 phút (Có thể rửa bằng dung dịch NaClO 3% hoặc AgCl 1% trong 4 phút), lắc mạnh và đều sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. Để ráo hạt và đặt hạt vào hộp petri có môi trường PDA đặc để phân lập các loại nấm mốc. Mỗi đĩa đặt 10 hạt, thí nghiệm nhắc lại 3 lần. Đặt đĩa đã cấy vào tủ ấm 300 C, sau 72 giờ lấy ra quan sát. Cho tiếp vào tủ ấm theo dõi 7 - 8 ngày. Đem ra đọc kết quả. 3.2.3. Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc: Dựa trên những đặc điểm hình dạng, kích thước của nấm mốc để phân loại sơ bộ các loài nấm mốc khác nhau. Nhỏ một giọt cồn: nước theo tỷ lệ 2:1 lên lam kính, dùng que cấy mốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên, nhỏ một giọt xanh metylen, đậy lá kính lên, để khô, tiến hành soi kính. 3.2.4. Phân loại các loài nấm mốc: Các bào tử được tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này được pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc: 1:10. Một ml từ hai hay ba độ pha loãng được chọn, tùy theo mật độ của hỗn dịch ban đầu, được cho vào các hộp petri. Sau đó đun tan chảy thạch, đợi nguội đến gần 450 C rồi phân vào các hộp này, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào tử được pha loãng. Để vào tủ ấm 300 C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số lượng khuẩn lạc giới hạn riêng biệt đồng đều. Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi sử dụng tài liệu của Raper và Fennell [44]. 3.2.5. Phương pháp phân tích aflatoxin: Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko[29] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC)[20] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dung dịch NaCL 10% (50ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman N0 1. Lấy 50ml dịch lọc và tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman N0 1. 80ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết xuất bằng hai pha lỏng – lỏng với 40ml hexan (2lần). Lớp nước axeton được chiết xuất với 40ml cloroform (3lần), loại bỏ lớp nước axeton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100 μl cloroform, giữ ở 40C cho đến lúc tiến hành định tính và định lượng aflatoxin. 25 g Mẫu ngô( lạc) Nghiền nhỏ Ngâm 24 h(trong tủ tối) 25 ml NaCl 10% 100ml acetol Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể Lọc lấy 50 ml dịch 50ml chì axetat 10% Lọc 80ml dịch Phễu chiết 40 ml n-hexan Lấy phần dich trong Bỏ phần dịch nổi trên chlorofoom Lấy pha trên cho vào bình cầu Cất quay( cô chân không) lấy 3ml cặn ống nhót, để bay hơi lấy cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 40C Na2SO4 khan Nhắc lại 2 lần Nhắc lại 3 lần Quy trình chiết tách aflatoxin được biểu thị qua sơ đồ sau 100 ml chlorofoom Định tính aflatoxin: Dùng bơm tiêm vi lượng (microsyring) nhỏ trên sắc ký lớp mỏng 2μl, 6μl và 2 lần 10μl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép 2cm (từ mép dưới của phiến mỏng) và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho các vết nhỏ không có đường kính quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2, 6, 10μl chuẩn aflatoxin B1 với nồng độ 0,71 ng/μl trên cùng một phiến bản mỏng. Nhỏ 5μl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10μl) như chuẩn trong. Hệ dung môi dùng cho sắc ký bản mỏng một chiều là: cloroform : aceton 9:1. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 μg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3 – 5,0. Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (độ phát xạ cực đại 365nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng của aflatoxin. Thử xác minh aflatoxin: Thử với axit vô cơ : Phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trong nước, tỷ lệ 1: 2. Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có aflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều đó có thể xem như là có aflatoxin trong mẫu thử. Định lượng aflatoxin: Nếu aflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau: Nhỏ 10μl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới, bên phải của bản mỏng, 1,5 cm cách mép. ở góc dưới bên trái, 1,2 và 3 cm cách mép và 1,5cm từ mép dưới của bản mỏng, nhỏ 2, 4, 6 μl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin. Nhỏ 6μl dung dịch chuẩn lên phía bên phải góc trên, 1,5cm cách mép phiến mỏng. Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1). So sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử. Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau: (ng/g hay ppb) C là nồng độ aflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phõn tớch ng/g (ppb) V1 là thể tớch hỗn hợp nước – axeton (ml) V2 là thể tớch hỗn hợp nước – axeton lấy cho phõn tớch (ml) V3 là thể tớch hỗn hợp nước – axeton và acetate – chỡ (ml) V4 là thể tớch dịch lọc sau khi làm sạch bằng acetate – chỡ (ml) V5 là thể tớch dung dịch chiết đó bay hơi làm sạch ở chloroform trước khi làm sắc ký bản mỏng (àl) V6 là thể tớch dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (àl) m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trờn phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phõn tớch (g). 3.2.6. Quy trỡnh nuụi cấy nấm mốc Aspergillus flavus cho việc nghiờn cứu khả năng tạo aflatoxin: Cỏc mẫu ngụ đó được xỏc định là khụng cú aflatoxin (theo phương phỏp 3.2.5). Cõn 25g ngụ cho vào bỡnh tam giỏc, chộn với 3ml nước cất, lắc thật đều, khử trựng 1 atm trong 30 phỳt. Điều chế hỗn dịch của chỳng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sao cho nồng độ 109 bào tử là tốt nhất.Theo phương phỏp pha loóng hàng loạt ở mục (3.2.4). Số khuẩn lạc trờn ml được tớnh theo cụng thức: Trong đú: C là tổng số khuẩn lạc đếm được trờn mỗi hộp Petri giữ lại ở nồng độ cú khuẩn lạc từ 30 – 100. n1 là số đĩa giữ lại ứng với độ pha loóng đầu. n2 là số đĩa giữ lại ứng với độ pha loóng thứ 2. d là hệ số pha loóng ứng với độ pha loóng đầu. Lấy 1ml hỗn dịch trờn cấy vào mụi trường đó khử trựng, nuụi cấy cỏc chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus ở 28 – 300C trong 9 ngày, mỗi ngày đều lấy ra lắc. Chiết xuất aflatoxin B1 từ cỏc chủng Aspegillus flavus và Aspegillus parasiticus đó nuụi cấy (theo phương phỏp 3.2.5). Mỗi thớ nghiệm được nhắc lại 3 lần. 3.2.7. Thăm dũ khả năng giảm aflatoxin bằng cỏc chủng aflavus khụng tạo độc tố: Thớ nghiệm 1: Aspergillus flavus sinh độc tố với sản lượng 331ppb được nuụi hỗn hợp với từng chủng của 8 chủng Aspegillus flavus khụng tạo độc tố (số khuẩn lạc của 2 chủng là 7,1.106 khuẩn lạc), nuụi cấy trờn cơ chất ngụ đó xỏc định là khụng cú nấm mốc và khụng cú aflatoxin B1, nuụi 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ 28 – 300C, ẩm độ 19 – 20 %, cho aflavus sinh trưởng và phỏt triển. Sau đú đem chiết để kiểm tra khả năng ức chế của từng chủng Aspergillus flavus khụng sinh độc tố đối với chủng sinh độc tố. Thớ nghiệm 2: Aspergillus flavus khụng sinh độc tố aflatoxin B1(chủng cú hiệu quả giảm độc tố cao nhất trong cỏc chủng được thực hiện ở thớ nghiệm 1), trộn vào cơ chất ngụ đó xỏc định hàm lượng aflatoxin B1 là 3000ppb (theo phương phỏp 3.2.5), nuụi 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ 28 – 300C, ẩm độ 19 – 20%, cho Aspergillus flavus sinh trưởng và phỏt triển. sau đú đem chiết để kiểm tra khả năng giảm hàm lượng aflatoxin B1 trờn cơ chất ngụ đó xỏc hàm lượng aflatoxin B1 là 3000ppb. phần III: kết quả và thảo luận 4.1. Mức độ nhiễm nấm mốc trờn một số mẫu ngụ: kết quả về mức độ nhiễm mốc trờn một số mẫu ngụ được trỡnh bày ở bảng 1 và bảng 2. Kết quả bảng 1 cho thấy ngô sau thời gian thu hoạch đó bị nhiễm mốc bờn trong hạt ngụ ở mức độ cao. 20/21 mẫu (chiếm 95% số mẫu phõn tớch) đó cú tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% - 100%, mức nhiễm trung bỡnh là 69%. 15/21 mẫu (chiếm 64% số mẫu phõn tớch) đó cú tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 67% - 100%, mức nhiễm trung bỡnh 85%. Cỏc loài nấm mốc nhiễm trờn cỏc mẫu ngụ thuộc cỏc chi mucor, và Aspergillus, Fusarium, penicillium. A.flavus là loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đó nhiễm trong 16/21 mẫu (76% số mẫu phõn tớch) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 2% đến 90% mức độ nhiễm trung bình là 17%. Chi Fusarium là chi nấm có rất nhiều loài có khả năng tạo các độc tố như fumonisin, Zearalenone, các trichothecen như deoxynialenol, nivalenol, T2- toxin, zearanone đã nhiễm trên các mẫu ngô khoả sát là 9/21 mẫu (42% số mẫu) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 40%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 12%. Điều này cho thấy các Fusarium có thể có khả năng nhiễm trên các mẫu ngô ngay ở giai đoạn sau thu hoạch và bảo quản không lâu. Chi Penicillium cũng có khả năng tạo độc tố như ochratoxin A, patulin, citrinin, penitrem A đã nhiễm trong 12/21 mẫu (57% số mẫu phân tích), v ới tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 97%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 16%. So sánh mức độ nhiễm mốc giữa các mẫu ngô khảo sát ta thấy: các giống YT1, YT6, YT7, VT3, ĐL1, ĐL2, CS1 có tỷ lệ hạt nhiễm ốc cao, từ 70% đến 100%. Giống YT8 hoàn toàn không bị nhiễm mốc, các giống ĐL4, ĐL5 có tỷ lệ hạt nhiễm mốc thấp, từ 10% đến 27%. Kết quả trên cho thấy rằng những giống này có khả năng đề kháng nấm mốc. Sự nhiễm nấm mốc khác nhau giữa NN1 (tỷ lệ nhiễm 67%) và YT8 (không bị nhiễm) được thấy rõ qua ảnh 1 và 2. ảnh 1:Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô NN1 ảnh 2: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô YT8 B ảng 1: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô ở một số tỉnh Việt Nam STT Ngô nghiên cứu Địa điểm thu thập Tỷ lệ hạt nhiễm mốc (%) Mức độ nhiễm nấm mốc (%) Mucor Aspergillus Fusa rium Penici llium A. flavus A. Niger 01 YT1 Nghệ An 100 100 0 0 0 0 02 YT2 Nghệ An 100 33 13 0 37 97 03 YT3 Nghệ An 100 65 0 0 0 6 04 YT4 Nghệ An 70 30 2 19 0 0 05 YT5 Nghệ An 52 0 22 36 30 0 06 YT6 Nghệ An 90 67 5 0 40 3 07 YT7 Nghệ An 81 10 9 19 40 4 08 YT8 Nghệ An 0 0 0 0 0 0 09 YT9 Nghệ An 92 0 27 37 0 26 10 YT10 Nghệ An 43 0 17* 27 0 0 11 VT1 Nghệ An 67 10 25 25 9 0 12 VT2 Nghệ An 53 0 47 3 0 7 13 VT3 Nghệ An 87 0 20* 0 33 33 14 ĐL1 Nghệ An 100 100 0 0 0 0 15 ĐL2 Nghệ An 100 43 0 0 37 57 16 ĐL3 Nghệ An 70 30 20 25 0 0 17 ĐL4 Nghệ An 10 0 10 3 3 0 18 ĐL5 Nghệ An 27 0 13 13 0 6 19 CS1 Nghệ An 90 0 90 90 0 0 20 CS2 Nghệ An 82 19 20 20 10 30 21 CS3 Nghệ An 71 22 9 17 0 60 Ghi chú:* Asspergilus parasiticus YT: Yên Thành VT: Vĩnh Thành ĐL: Đô Lương CS: Cao Sơn Mức độ nhiễm mốc trên ngô tiêu thụ ở một số tỉnh được trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy 11 mẫu ngô đã bị nhiễm mốc bên trong hạt ngô ở mức độ cao. 10/11 mẫu (95% số mẫu) đã có tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% đến 100% mức nhiễm trung bình 50%. Các loài nấm mốc nhiễm trên các mẫu ngô thuộc các chi Mucor, Aspergillus, Fusarium, Penicilium, Aspergillus flavus là loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đã nhiễm trong 9/11 mẫu (81% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% đến 97%, mức nhiễm trung bình là 31%. A.niger đã nhiễm trên các mẫu ngô khảo sát trong 8/11 (71% số mẫu phân tích) với tỷ lệ nhiễm mốc từ 3% đến 70%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 17%. Chi Fusarium đã nhiễm trên các mẫu ngô khảo sát là 7/11 mẫu (61% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 70%, mức độ nhiễm trung bình 14%. Chi Penicillium đã nhiễm trên các mẫu ngô là 5/11 mẫu (41% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 7% đến 47%, mức độ nhiễm trung bình là 13%. Điều này cho thấy việc điều tra mức nhiễm các độc tố aflatoxin và fumonisin, các trichthecen và zearanone trên các mẫu ngô khảo sát là một việc là cần thiết. Bảng 2: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô tiêu thụ ở một số tỉnh STT Mẫu ngô nghiên cứu Địa điểm thu thập Tỷ lệ hạt nhiễm mốc (%) Mức độ nhiễm nấm mốc (%) Mucor Aspergillus Fusar ium Penici llium A. flavus A. Niger 01 CBH1 Đồng Nai 37 0 0 0 37 0 02 CBH2 Đồng Nai 87 33 30 13 20 27 03 CBH3 Đồng Nai 100 7 20 3 70 47 04 CBH4 Đồng Nai 0 0 0 0 0 0 05 CDC1 Nghệ An 100 0 40 63 0 0 06 CDC2 Nghệ An 43 0 37 10 3 43 07 CDC3 Nghệ An 100 33 20 50 67 0 08 GL Hà Nội 47 3 20 0 23 7 09 NN1 ĐH NNI 67 0 27 27 0 17 10 NN2 ĐH NNI 10 0 10 3 0 0 11 Ngô hỗn hợp * 100 0 97 17 3 0 Ghi chú:CBH: chợ Biên Hoà CDC: chợ Diễn Châu GL : Gia Lâm * :Nguồn Mộc Châu đang bán tại các cửa hàng Hà Nội Kết quả thu được từ bảng 1 và bảng 2 cho thấy: khảo sát về mức độ nhiễm nấm mốc bên trong một số mẫu ngô thu thập từ một số tỉnh phù hợp với kết quả của PGS.TS Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự, 2005, báo cáo kết quả định kì, dự án`DADIDA [21] 100% ngô bị nhiễm mốc với tỷ lệ 59%- 72%, tần suất nhiễm A.flavus 24%-35%. Kết quả Nguyễn Thuỳ Châu [1] công bố là 100% mẫu ngô ở dạng hạt đều bị nhiễm nấm mốc, mức độ nhiễm trung bình dao động trong khoảng 80% đến 100%, cũng như kết quả của Nguyễn Thị Thanh Trà 1998[17] công bố về ngô: 100% mẫu ngô bị nhiễm mốc, mức độ nhiễm mốc trung bình dao động 80% đến 87%. Theo Kawashima và cộng sự [39] A.flavus là loài nấm phổ biến trên ngô ở Thái Lan và không chỉ phát hiện được ở giai đoạn bảo quản mà ngay cả giai đoạn ngoài đồng. Donald và cộng sự [27] cũng đã phát hiện 211 chủng A.flavus phân lập từ các mẫu ngô ở giai đoạn thu hoạch, trong đó có 50% các loài tạo afflatoxin, Aspergillus parasiticus được phát hiện với tần suất ít hơn so với A. flavus. Một điều đáng chú ý về mức độ nhiễm nấm mốc trên mẫu ngô được khảo sát là A.niger cũng nhiễm với tỷ lệ khá cao. Những thông báo gần đây cho thấy loài này cũng có khả năng sinh ochrratoxin A. Vì vậy cần xác định ochratoxin A trên các mẫu ngô này. Mặc dù số mẫu phân lập còn ít nhưng có thể nói rằng A.flavus là loài chính nhiễm trên ngô ở các mẫu ngô thu thập được Hà Nội, Nghệ An và Mộc Châu. Ngoài ra các chi nấm bảo quản khác Mucor, Fusarium, Penicillium cũng nhiễm trên ngô nhưng với tỷ lệ thấp hơn. Bảng 3: Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc STT Mẫu lạc Địa điểm thu thập Tỷ lệ hạt nhiễm mốc (%) Mức độ nhiễm nấm mốc (%) Mucor Aspergillus Nấm mốc khác A. flavus A. Niger 01 TB1 Đồng Nai 52 30 0 6 16 02 TB2 Đồng Nai 100 26 13 9 54 03 TB3 Đồng Nai 34 14 2 15 0 04 TB4 Đồng Nai 26 8 6 0 12 05 TB5 Đồng Nai 8 0 0 8 0 06 CS Nghệ An 36 19 0 10 8 07 CDC1 Nghệ An 48 0 0 0 48 08 CDC2 Nghệ An 70 42 2 5 28 09 CDC3 Nghệ An 48 0 1 17 35 10 CBH1 Đồng Nai 36 0 13 30 0 11 CBH2 Đồng Nai 18 23 0 23 0 12 CBH3 Đồng Nai 2 0 0 1 1 13 CBH4 Đồng Nai 16 4 5 8 1 14 CBH5 Đồng Nai 16 15 0 3 7 15 CBH6 Đồng Nai 46 30 0 0 26 16 CBH7 Đồng Nai 10 0 0 5 5 17 CBH8 Đồng Nai 2 0 21 1 0 18 CBH9 Đồng Nai 16 0 8 10 0 19 CBH10 Đồng Nai 50 15 10 6 20 Ghi chú: TB :Trảng Bom CS : Cao sơn CDC: chợ Diễn Châu CBH: chợ Biên Hoà Kết quả bảng 3 cho thấy mức độ nhiễm mốc bên trong hạt lạc là khá cao. 100% số mẫu phân tích bị nhiễm mốc với tỷ lệ từ 2% - 100%. Trung bình là 34% các loài nấm nhiễm trên lạc thuộc các chi Mucor, Aspergillus, và 1 số mốc khác. A.flavus sinh độc tố aflatoxin nhiễm 10/19 mẫu với tỷ lệ nhiễm mốc từ 1 – 21% trung bình là 5%. Ngoài ra trên lạc còn xuất hiện loại nấm mốc khác với 13/19 mẫu bị nhiễm (chiếm 68%) tỷ lệ nhiễm mốc từ 1 – 54%, trung bình là 14%. Kết quả trên phù hợp với kết quả dự án DADIDA của Nguyễnc Thuỳ Châu công bố 100% lạc nhiễm mốc với tỷ lệ nhiễm trung bình 45%. ảnh 3: mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc So sánh mức độ nhiễm mốc trên ngô và lạc qua bảng 1, bảng 2 và 3 ta thấy tỷ lệ % nhiễm mốc trong tổng số mẫu lạc khoả sát cao hơn mẫu ngô, nhưng mức độ nhiễm trong hạt ngô cao hơn rất nhiều mức độ nhiễm trong hạt lạc. 4.2. Hàm lượng aflatoxin B1 của ngô ở một số tỉnh Bảng4: Hàm lượng aflatoxin B1 trên ngô ở một tỉnh STT Mẫu ngô nghiên cứu Địa điểm thu hoạch Hàm lượng Aflatoxin (ppb) 01 YT2 Nghệ An KPHĐ 02 YT8 Nghệ An KPHĐ 03 VT1 Nghệ An KPHĐ 04 ĐL4 Nghệ An KPHĐ 05 CS2 Nghệ An KPHĐ 06 CBH2 Đồng Nai 25 07 CDC1 Nghệ An 27 08 GL Hà Nội KPHĐ 09 NN1 ĐHNN I KPHĐ 10 NN2 ĐHNN I 24 11 Ngô hỗn hợp * 36 Ghi chú: * Nguồn Mộc Châu đang bán tại cửa hàng tai Hà Nội. KPHĐ: Không phát hiện được. Kết quả ở bảng 4 cho thấy, trên 11 mẫu ngô mức độ nhiễm aflatoxin là 4/11 mẫu (chiếm 36% số mẫu phân tích), có hàm lượng aflatoxin từ 25ppb đến 36ppb với hàm lượng trung bình 18ppb (nằm trong giới hạn cho phép sử dụng thức ăn cho gia súc < 50ppb và FAO<100ppb . 7/11 mẫu (57% số mẫu phân tích) không bị nhiễm afflatoxin B1. 4.3. Đặc điểm phân loại chủng A.flavus và A.parasiticus đã tuyển chọn: Trong 30 mẫu ngô khảo sát, chúng tôi phân lập được 22 mẫu chủng A.flavus và A.parasiticus có đặc điểm khuẩn lạc cấu trúc vi học của nấm A.flavus và A.parasiticus, theo khoá phân loại của Raper và Fennell [44], chúng tôi đã tuyển chọn được 11/22 chủng A. flalvus và A.parasiticus (bảng 6), đại diện cho 22 A.flavus và A.parasiticus đã phân loại ở (bảng 5). Sự khác nhau về cấu trúc vi học của nấm A.flavus CBH2 thấy rõ qua ảnh 4 và ảnh 6 và A.parasiticus VT10 qua ảnh 5 và 7. Bảng 5: Đặc điểm phân loại học của các loại A.flavus và A.parasiticus phân lập trên ngô STT Chủng A.flavus và A.parasiticus Thể bình Bào tử trần Bọng đỉnh giả Cuống sinh bào tử Hình dạng ĐK (mirrco met) Hình dạng ĐK (mirrco met) Hình dạng ĐK (mirrco met) 1 3 4 5 6 7 8 9 10 01 02 Chủng A.flavus CBH2 1-2 hàng Hình cầu có gai nhẹ 4-6 Hình cầu hay gầu cầu 25,5-36,5 Sần xùi 200-400 Chủng A.flavus BH3 1-2 hàng Hình cầu có gai nhẹ 4,5-5,5 Hình cầu hay gầu cầu 25-30 Sần xùi 200-400 03 04 05 Chủng A.flavus NNI 1-2 hàng Hình cầu có gai 2.5-4,5 Hình cầu 30-40 Sần xùi 380-720 Chủng A.flavus VT1 1-2 hàng Hình cầu có gai 3-4,5 Hình cầu 30-38 Sần xùi 400-700 Chủng A.flavus VT2 1-2 hàng Hình cầu có gai 2,5-3,8 Hình cầu 35-40 Sần xùi 400-680 06 Chủng A.flavus NN2 1-2 hàng Hình cầu có gai 3-4,8 Hình cầu 25-35 Sần xùi 400-600 07 08 09 Chủng A.flavus YT6 1-2 hàng Hình cầu hay gần cầu 3-4 Hình cầu hay chuỳ 356,5-40 Sần xùi 300-550 Chủng A. flavus YT7 1-2 hàng Hình cầu hay gần cầu 3-3,5 Hình cầu hay chuỳ 35-40 Sần xùi 300-500 Chủng A.flavus YT9 1-2 hàng Hình cầu hay gần cầu 3-3,5 Hình cầu hay chuỳ 35-45 Sần xùi 300-500 10 11 12 Chủng A.parasiticus VT3 1 hàng Hình cầu hay gần cầu 2,5-3 Hình câu, gần cầu hay chuy 36,5-50 Sần xùi 250-550 Chủng A. parasiticus YT10 1 hàng Hình cầu hay gần cầu 2,5-3,5 Hình câu, gần cầu hay chuy 35-50 Sần xùi 270-550 16 Chủng A.flavus GL 1-2 hàng Hình cầu 3,5-6 Hình cầu 40-50 Sần xùi 600-1000 17 18 Chủng A.flavus ĐL3 1-2 hàng Hình cầu hay gần cầu 3,75-7 Hình cầu hay gần cầu 36-60 Sần xùi 400-750 Chủng A. flavus ĐL5 1-2 hàng Hình cầu hay gần cầu 3-5,5 Hình cầu hay gần cầu 37-52 Sần xùi 450-700 19 20 21 Chủng A.flavus DC1 1-2 hàng Hình cầu 3-5 Hình cầu hay gần cầu 19-45 Sần xùi 300-450 Chủng A.flavus DC2 1-2 hàng Hình cầu 3-4,5 Hình cầu hay gần cầu 25-40 Sần xùi 300-400 Chủng A.flavus DC3 1-2 hàng Hình cầu 3,5-4,5 Hình cầu hay gần cầu 30-40 Sần xùi 320-400 22 23 24 Chủng A.flavus CS1 1-2 hàng Hình cầu 3-5,5 Hình cầu hay chuỳ 25-60 Sần xùi 300-450 Chủng A.flavus CS2 1-2 hàng Hình cầu 2,5-5 Hình cầu hay chuỳ 21-50 Sần xùi 250-450 Chủng A.flavus CS3 1-2 hàng Hình cầu 2,7-4,5 Hình cầu hay chuỳ 30-65 Sần xùi 300-420 25 26 Chủng A.flavus hỗn hợp (Mộc Châu) 1-2 hàng Hình cầu 2,5-4 Hình cầu, gần cầu hay chuỳ 30-65 Sần xùi 400-650 Chủng A.flavus CS3 1-2 hàng Hình cầu 2,5-4 Hình cầu, gần cầu hay chuỳ 30-60 Sần xùi 400-600 Từ 30 mẫu Ngô, chúng tôi đã phân lập được 22 mẫu phân lập có đặc điểm khuẩn lạc, cấu trúc vi học của loài A.flavus và loài A.parasiticus theo khoá phân loại của Raper và Fennell. ảnh 4: hình thái bào tử Aspergillus flavus CBH2 ảnh 5: Hình thái bào tử Aspergillus parasiticus YT10 ảnh 6: Hình thái nấm mốc Aspergillus flavus CBH2 ảnh 7: Hình thái nấm mốc Aspergillus parasiticus YT10 4.3.1. Chủng A.flavus CBH2 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8 đến 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 7 cm, hạch nấm màu đen, khuẩn lạc màu xanh vàng không chuyển màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc nhăn nheo, có màu hồng nhạt. Cuống sinh bào tử dài 200-400 àm, 1 hoặc 2 hàng thể bình. Bọng đỉnh giá hình cầu, gần cầu đường kính 25,5-36,5àm. 4,3,2, Chủng A.flavus NN1 (Đại học Nông nghiệp I) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 7,1cm. Hạch nấm màu đen, khuẩn lạc màu xanh vàng khong chuyển sàng màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc có màu hơi hồng, nhăn nheo. Cuống sinh bào tử sần xùi, dài 380-720àm, bọng đỉnh giá hình cầu có đường kính 40àm , Một hoặc hai thể bình, bào tử hình cầu, có gai, đường kính 2,5-4,5àm. 4.3.3. Chủng A.flavus NN2(Đại học Nông nghiệp 1) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,5 cm hạch nấm nhiều mầu đen, khuẩn lạc màu xanh nâu, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc màu hơi hồng, nếp nhăn ít. Cuống sinh bào tử 400-600àm, sần xùi, 1 hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu đường kính 25-35 àm, bào tử hình cầu có gai, đường kính 3-3,8àm . 4.3.4 Chủng A.flavus YT6 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,5 cm, hạch nấm nhiều, mầu đen, khuẩn lạc có màu xanh lá cây. Mặt trái khuẩn lạc không đổi màu. Cuống sinh bào tử sần xùi, dài 300-500àm, 1 hàng thể bình, bào tử không gai, đường kính 3-4àm, có bọng đỉnh giá hình cầu, gần cầu hoặc chuỳ, đường kính 36,5-50àm. 4.3.5 Chủng A.parasiticus VT3 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc5,6 cm, hạch nấm nhiều, màu đen, khuẩn lạc màu xanh lá cây hoặc vàng. Mặt trái khuẩn lạc không đổi màu. Cuống sinh bào từ nhẵn, dài 250-500àm, Một hàng thể bình duy nhất, bào tử không có gai, đường kính 2,5-3àm, bọng đỉnh giá hình cầu, hình chuỳ hoặc gần cầu, đường kính 36,5-50àm. 4.3.6. Chủng A .flavus YT5 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,9 cm, hạch nấm nhiều, khuẩn lạc màu vàng hơi nâu, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc có màu hồng chạy theo hình phóng xạ, nhăn nheo, cuống sinh bào tử sần xùi dài 350-500àm, 1 hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu đường kính 25-65 àm, bào tử có gai hình cầu đường kính 4-5,5àm. 4.3.7. Chủng A.flavus GL Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,4cm, hạch nấm ít, có màu đen, khuẩn lạc có màu xanh hơi vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc nhăn nheo, hơi hồng. Cuống sinh bào tử sù xì dài 600-1000àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hính cầu hoặc gần cầu đường kính 40-50àm, nhiều bào tử có gai, hình cầu, đường kính 3,5-6àm. 4.3.8. Chủng A.flavus ĐL3 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,8cm, hạch nấm màu đen, khuẩn lạc có màu xanh vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Cuống sinh bào tử dài 400-750àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu hoặc gần cầu, bào tử hình cầu hoặc gần cầu, đường kính 3,75-7àm. Mặt trái khuẩn lạc có nếp nhăn màu hồng nhạt chạy theo hình phóng xạ. 4.3.9. Chủng A.flavus CDC1 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 6,8cm, có hạch nấm, khuẩn lạc màu xanh vàng, không chuyển sàng màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc màu hồng chạy theo hình phóng xạ, nhăn nheo. Cuống sinh bào tử sần xùi, dài 300-450àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu hoặc gần cầu, đường kính 19-45 àm, bào tử có gai, hình cầu có đường kính 3-5àm. 4.3.10 Chủng A.flavus CS1 Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 5,8 cm, hạch nấm ít, màu đen , khuẩn lạc màu xanh hơi vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Mặt trái khuẩn lạc màu hồng nhăn nheo.Cuống sinh bào tử sần xùi dài 250-600mi mét, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình cầu hoặc gần cầu, đường kính 19-45 mi mét, bào tử có gai, hình cầu có đường kính 3-5,5 mi mét. 4.3.11. Chủng A.flavus hỗn hợp (Ngô hỗn hợp Mộc Châu) Khuẩn lạc trên môi trường Czapek, sau 8-10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 29-30oC, có đường kính khuẩn lạc 7 cm, hạch nấm màu đen, khuẩn lạc màu xanh hơi vàng, không chuyển sang màu nâu khi già. Cuống sinh bào tử sần xùi dài 400-650àm, một hoặc 2 hàng thể bình, bọng đỉnh giá hình chuỳ hoặc hình gần cầu, đường kính 30-65àm, bào tử có gai, hình cầu có đường kính 2,5-4àm. Mặt trái khuẩn lạc nhăn nheo không có màu hồng. Kết quả ở bảng 6 cho thấy, mặc dù chủng A.flavus và A.parasiticus khác nhau ở kích thước khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc và bọng đỉnh giá, nhưng đều phù hợp với những đặc điểm trong khoá phân loại nấm mốc A.flavus và A. parasiticus của Raper và Fennell. ảnh 8 và ảnh 9 cho thấy sự khác nhau về đặc điểm khuẩn lạc giữa chủng A.flavus CBH2 và chủng A.parasiticus VT3 Bảng 6: Một số đặc điểm phân loại A.flavus và A.parasiticus phân lập trên ngô đặc trưng nhất trong 22 mẫu đã phân lập ở bảng 5. STT Chủng A. flavus và A. paraciticus Thể bình Khuẩn lạc Bào tử trần Bọng đỉnh giá Cuống sinh bào tử ĐK(cm) Màu sắc Hình dạng ĐK(àm) Hình dạng ĐK(àm) Hình dạng ĐK(àm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 01 Chủng A. flavus BH2 1-2 hàng 7 Xanh vàng Hình cầu có gai nhẹ 4 – 6 Hình cầu có gai nhẹ 25,5 – 36,5 Sần xùi 200 – 400 02 Chủng A. flavus NN1 1-2 hàng 7,1 Xanh vàng Hình cầu có gai 2,5 – 4,5 Hình cầu có gai nhẹ 30 – 40 Xù sì 380 – 720 03 Chủng A. flavus NN2 1-2 hàng ,5 Xanh nâu Hình cầu có gai 4 – 4,8 Hình cầu có gai nhẹ 25 – 35 Xù sì 400 – 600 04 Chủng A. flavus YT6 1-2 hàng 6,5 Xanh vàng Hình cầu hay gần cầu 3 – 4 Hình cầu có gai nhẹ 36,5 – 40 Sần xùi 300 – 550 05 Chủng A. flavus VT3 1-2 hàng 5,6 Xanh lá cây Hình cầu hay gần cầu 2,5 – 3 Hình cầu có gai nhẹ 36,5 – 40 Xù sì 250 – 500 06 Chủng A. flavus YT5 1-2 hàng 6,9 Xanh hơi nâu Hình cầu 4 – 5,5 Hình cầu có gai nhẹ 25 – 65 Xù sì 350 – 500 07 Chủng A. flavus GL7 1-2 hàng 6,4 Xanh hơi vàng Hình cầu 3,5 – 6 Hình cầu có gai nhẹ 40 – 50 Xù sì 600 – 1000 08 Chủng A. flavus ĐL3 1-2 hàng 6,8 Xanh vàng Hình cầu hay gần cầu 3,7 – 7 Hình cầu có gai nhẹ 36 – 60 Xù sì 400 – 750 09 Chủng A. flavus DC1 1-2 hàng 6,8 Xanh vàng Hình cầu hay gần cầu 3 – 5 Hình cầu có gai nhẹ 19 – 45 Xù sì 300 – 450 10 Chủng A. flavus CS1 1-2 hàng 5,8 Xanh vàng Hình cầu hay chuỳ 3 – 5,5 Hình cầu có gai nhẹ 25 – 60 Xù sì 250 – 600 11 Chủng A. flavus ngô hỗn hợp 1-2 hàng 7 Xanh vàng Hình cầu hay chuỳ 2,5 – 4 Hình cầu có gai nhẹ 30 – 65 Xù sì 400 – 650 ảnh 8: Hình thái khuẩn lạc Aspergillus flavus CBH2 ảnh 9: Hình thái khuẩn lạc Aspergillus parasiticus YT10 4.4. Khả năng tạo độ tố aflatoxin của một số chủng A.flavus và A.paraciticus đã tuyển chọn Kết quả ở bảng 7 cho thấy, 2/11 chủng A.flavus và A.paraciticus (chiếm 18% số mẫu phân tích) có khả năng tạo aflatoxin với sản lượng trong khoảng 100-331ppb, trung bình là 216 ppb, 9/11 chủng A.flavus và A.paraciticus không có khả năng tạo aflatoxin (82% số mẫu phân tích) . So sánh kết quả này với kết quả của Nguyễn Hương Trà-1995 [16] chủng A.flavus và A.paraciticus mà Nguyễn Thị Hương Trà phân tích cũng như kết quả của Kawashima và cộng sự [39] phân lập từ ngô. Theo Kawashima và cộng sự(1990) thì khả năng tạo độc tố aflatoxin của các chủng A.flavus phân lập từ ngô Thái Lan dao động từ 2461 ng/g đến 32446 ng/g. Kết quả khác biệt trên cho phép kết luận: yếu tố sinh thái như nhiệt độ, độ ẩm, vùng đất... Đã đóng vai trò quan trọng trong việc xuất hiện các chủng A.flavus và A.paraciticus sinh độc tố và không sinh độc tố. Bảng 7: Khả năng tạo độc tố aflatoxin ở một số chủng A.flavus và A.paraciticus Số tt Tên chủng A.flavus và A.paraciticus Địa điểm thu hoạch Sản lượng aflatoxin B1(ppb) 1 Chủng A.flavus CBH2 Đồng Nai 100 2 Chủng A.flavus NN1 ĐH NNI KPHĐ 3 Chủng A.flavus YT6 Nghệ An KPHĐ 4 Chủng A.flavus NN2 ĐH NNI 331 5 Chủng A.flavus CS1 Nghệ An KPHĐ 6 Chủng A.flavusYT5 Nghệ An KPHĐ 7 Chủng A.flavus GL Hà Nội KPHĐ 8 Chủng A.flavus DC1 Nghệ An KPHĐ 9 Chủng A.flavus VT3 Nghệ An KPHĐ 10 Chủng A.flavus ĐL3 Nghệ An KPHĐ 11 Chủng A.flavus hỗn hợp Mộc Châu KPHĐ Ghi chú: KPHĐ : không phát hiện được. 4.5. Tác dụng giảm độc tố aflatoxin trên ngô bằng sử dụng một số loài nấm có tính chất đối kháng với aflavus có khả năng tạo aflatoxin : 4.5.1. Khả năng giảm sản lượng aflatoxin bằng các chủng A.flavus, A.paraciticus và Tricoderma không có khả năng tạo độc tố: Việc sử dụng các chủng nấm không có hại cho con người mà lại có khả năng giảm tạođộc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Biện pháp phòng trừ nấm mốc độc bằng các chủng đối kháng căn cứ vào những đặc điểm di truyền học (trao đổi chất, tự phân đôi nhân, đột biến, tiết enzym có tác dụng thuỷ phân ...). Các chủng nấm mốc có tác dụng đối kháng này cần đảm bảo tính an toàn thực phẩm không độc hại với con người. Do đó để giảm độc tố aflatoxin trên ngô, chúng tôi đã lấy các chủng A.flavus và A.paraciticus không tạo độc tố và chủng Tricoderma làm đối tượng thí nghiệm. Bảng 8 : Hiệu quả giảm độc tố aflatoxin trên ngô bằng các chủng A. flavus không có khả năng sinh độc tố: Số TT Công thức thí nghiệm Sản lượng aflatoxin (ppb) Hiệu quả giảm aflatoxin (%) Đối chứng A.flavus NN2 331 1 A.flavus GL + A.flavus NN2 5 98 2 A.flavus NN1+ A.flavus NN2 14 95 3 A.flavus YT6 + A.flavus NN2 59 82 4 A.flavus YT5 + A.flavus NN2 59 82 5 A.flavus CS1 + A.flavus NN2 59 82 6 A.flavus DC1 + A.flavus NN2 85 74 7 A.flavus hỗn hợp (Mộc Châu) + A.flavus NN2 89 73 8 A.flavus ĐL3 + A.flavus NN2 100 70 9 Chủng tricoderma +A.flavus NN2 237 28 10 A.flavus VT3 + A.flavus NN2 330 0 Kết quả ở bảng 8 cho thấy, việc nuôi cấy phối hợp các loài A.flavus không sinh độc tố với A.flavus sinh độc tố đã làm giảm sản lượng afalatoxin một cách đáng kể từ 331ppb xuống còn 5ppb đến100ppb tức là hiệu quả giảm sản lượng aflatoxin đạt 70-98%. Trong số các chủng khảo sát có hai chủng A. flavus không sinh độc tố phân lập từ ngô GLvà NN1 đã có tác dụng ức chế sự phát triển của các nấm sản sinh aflatoxin và quá trinh tạo aflatoxin của nấm A. flavus sinh độc tố, đạt hiệu quả giảm sản lượng aflatoxin cao nhất theo thứ tự là 98% và 95%. 4.5.2. ảnh hưởng của số lượng nấm không có khả năng sinh độc tố đến hàm lượng aflatoxin trong ngô : Bảng 9: Hiệu quả giảm độc tố aflatoxin trên cơ chất ngô bằng chủng A. flavus GL không có khả năng sinh tạo độc tố Số khuẩn lạc được dụng nuôi cấy (kl/ml) Hàm lượng aflatoxin B1 (ppb) Hiệu quả giảm độc tố(%) Trước xử lý Sau xử lý 7,2.106 3000 1410 53 3 x 7,2.106 3000 355 89 5 x 7,2.106 3000 254 92 Kết quả ở Bảng 9 cho thấy, hiệu quả giảm độc tố aflatoxin tăng tỉ lệ thuận với số bào tử A.flavus không sinh độc tố cho vào môi trường cơ chất chứa 3000 ppb aflatoxin. Điều này đã chứng tỏ luận điểm của Petter Cotty là đúng đắn, tác giả đã chứng minh rằng chủng không sinh độc tố aflatoxin đã có một loại enzym nào đó có khả năng phân huỷ aflatoxin do chủng A. flavus tạo ra trong môi trường nuôi cấy. Tất cả những vấn đề trên cần được làm sáng tỏ trong thời gian tới vì nó có ý nghĩa quan trọng trong việc kìm chế và khử độc tố aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Mặc dù hiệu quả khử aflatoxin B1 chưa đạt đến mức tuyệt đối, nhưng nó có tác dụng khử độc tố bằng cách sử dụng một số loài nấm có tính đối kháng với aflavus có khả năng tạo aflatoxin đã được chứng minh và có kết quả cụ thể. Phần V: kết luận và kiến nghị 5.1. Kết luận: 1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu ngô lấy ở Ngệ An, và thị trường Gia Lâm- Hà Nội.20/21 mẫu ngô ở Ngệ An bị nhiêm mốc (chiếm 95% số mẫu phân tích) có tỷ lệ nhiễm mốc từ 10% đến 100% trung bình là 69%. 10/11 mẫu ngô thu thập tại thị trường Ngệ An, Đồng Nai và thị trường Hà Nội nhiễm mốc (chiếm 95% số mẫu phân tích) có tỷ lệ nhiễm mốc từ 10% đến 100% mức nhiễm trung bình là 50%. Mức độ nhiễm nấm trên 19 mẫu lạc thu thập ở Nghệ An và Đồng Nai là 100% với tỷ lệ nhiễm mốc tư 2% đến 100%, mức nhiễm trung bình là 34%. 2. Các loài nấm chính nhiễm trên ngô là Aspergillus flavus, Aspergillus niger và penicillium. Trên lạc là các loại nâm Aspergillus flavus, mucor và số ít mốc khác. 3. 4/11 mẫu ngô (25% số mẫu phân tích) đẫ nhiễm aflatoxin với hàm lượng từ 25ppb đến 36 ppb. 4. Phân lập được 22 chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, đã sắp xếp thành 11 chủng có đặc điểm khuẩn lạc, cấu trúc vi học khác nhau. 5. 9/11 chủng Aspergillus flavus và Aspergillus phân lập không sinh độc tố, còn lại 2 chủng sinh độc với hàm lượng 100ppb và 331ppb. 6. Các chủng Aspergillus flavus không sinh độ tố aflatoxin có khả năng giảm sản lượng của chủng Aspergillus flavus sinh độc tố từ 331 xuống còn 5ppb dến 100ppb. Nấm không có khả năng sinh độc tố có khả năng giảm hàm lượng aflatoxin trong ngô đã nhiễm độc tố. 5.2. Đề nghị 1. Việc phát hiện một tỷ lệ cao ngô trước thu hoạch đã nhiễm mốc, đặc biệt là Aspergillus cho ta thấy công tác sơ chế ngô (tẽ hạt, làm khô, đóng gói) có ý nghĩa rất quan trọng. Vì theo kết quả nghiên cứu của nhiều nước, nếu ngô không kịp làm khô sau 3 đến 6 ngày độc tố nấm sẽ tăng lên nhanh chóng. Vì vậy cần giới thiệu cho bà con nông dân phương pháp sấy thuận lợi khi thu hoạch ngô, cũng như việc bảo quản ngô, lạc sau thu hoạch. 2. Việc sử dụng môt số loại nấm có tính đối kháng với có khả năng tạo độc tố cần được nghiên cứu thêm để có thể ứng dụng vào thực tiễn phòng trừ aflatoxin trên nông sản bằng phương pháp sinh học. Tài liệu tham khảo I/- Tiếng việt: 1. Nguyễn Thuỳ Châu, Lê Hữu Hiếu , Trương Thanh Bình, Cao Văn Hùng, Vũ Xuân Dũng và Lê Văn Trường(1997). Nghiên cứu mức độ nhiễm mốc sinh độc tố trên ngô - biện pháp phòng trừ. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994-1995, XB Nông Nghiệp. Bộ nông nghiệp và pháp triển nông thôn, trang 200-2003. 2.Nguyễn Thuỳ Châu(1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố Mycotoxin) ngô, gạo ở Việt Nam và biện pháp phòng trừ Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học. Bộ giáo dục và đào tạo , Trường Đại học khoa học tự nhiên tr 138. 3.Nguyễn Thuỳ Châu, Lê Doãn Diên, Nguyễn Hoà Bình, Nguyễn Mỹ Hà, Vũ Xuân Diên (1995). Mức độ nhiễm aflatoxin ở một số tỉnh ở Việt Nam. Sử dụng công nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản thu hoạch. XB Nông nghiệp. 4.Nguyễn Lân Dũng (1983). Một số sản phẩm của vi nấm. Độc tố của vi nấm- Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật 2: trang 82- 83. 5.Đậu Ngọc Hào (1995). Thức ăn nhiễm nấm gây chết vịt tại trung tâm vịt giống Đại Xuyên- tạp chí chăn nuôi số 2 (5)/1995 trang 47 –48. 6.Đậu Ngọc Hào, Nguyễn Thị Thuận(1994), nghiên cứu ứng dụng một vài biện pháp sinh học, hoá học phòng chống nấm mốc cho ngô và khô lạc sử dụng làm thức ăn cho gia súc-Tạp chí khoa học và kỹ thuật thú y, tập I, số 4. 7.Đậu Ngọc Hào(6/1993)kết quả nghiên cứu phương pháp sắc kí lớp mỏng xác định aflatoxin trong thức ăn gia súc gia cầm. Tạp chí nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, trang 228- 230. 8.Đậu Ngọc Hào(1993), Sử dụng các hợp chất Amin và NaHSO3 làm giảm hoạt tính aflatoxin B1 trong ngô hạt và khô dầu lạc bị nhiễm nấm mốc. Kết quả nghiên cứu khoa học khoa chăn nuôi thú y. 9.Đậu Ngọc Hào(1992), Thức ăn nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin của chúng đối với gà công nghiệp- Tạp chí nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, 9,trang345-348. 10.Đậu Ngọc Hào, Nguyễn Thị Thuận , Đào Tú Khánh- một số loài nấm mốc được phát hiện trong thức ăn gia cầm. Công trình nghiên cứu khoa học Viện thú y Quốc gia, 1990-1991. 11.Đậu Ngọc Hào(1986). Nghiên cứu phát hiện các đặc tính nấm mốc bằng phương pháp vi sinh vật học- Tạp chí khoa học và kỹ thuật thú y 6,9-14. 12.Đào Thị Hảo- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của aflatoxin và chất chống aflatoxin đối với chăn nuôi gà công nghiệp tại Trung tâm chăn nuôi gia cầm Thụy Phương- Viện chăn nuôi- Luận án thạc sĩ nông nghiệp-Viện khoa học và kỹ thuật nông nghiệp-1995. 13.Lê Hữu Hiếu, Nguyễn Thị Lâm, Nguyễn Thuỳ Châu(1995). Xác định thành phần giống nấm mốc sinh độc tố aflatoxin trong ngô hạt sau thu hoạch. Kết quả nghiên cứu đề tài khoa học cấp Nghành. Bộ nông nghiệp và pháp triển nông thôn- Viện công nghệ sau thu hoạch. 14.Đặng Hồng Miên(1982). Nấm mốc trên một số sản phẩm công nông nghiệp. Phương pháp khử và biện pháp phòng chống. 15.Bản dịch của Đặng Hồng Miên, NXB khoa học kỹ thuật: Moreau Claude (1980). 16.Nguyễn Thị Hương Trà(1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và khả năng tạo aflatoxin trên ngô ở một số tỉnh miền Bắc Việt nam- luận án tốt ngiệp cử nhân sinh học, Trường đại hoạc khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội. 17.Nguyễn Thị Thanh Trà(1998), khảo sát sự nhiễm nấm Aspergillus và aflatoxin trên một số giống ngô lai và ngô địa phương ở vùng Gia Lâm –Hà Nội và vùng phụ cận-Luận án tốt nghiệp chuyên ngành bảo quản chế biến, Trường Đại Nông nghiệp I -Hà nội. 18.Nguyễn Phùng Tiến(1983), Nấm môc trên một số sản phẩm thực phẩm- luận án Phó tiến Sỹ y học, Viện sinh học dịch tễ Hà Nội. 19.Tiêu chuẩn Việt nam 5617-1991. Phương pháp xác định aflatoxin ở ngũ cốc. 20.Nguyễn Thị Hồng Hà, nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô ở một số tỉnh và khả năng phòng chống 21.Nguyễn Thuỳ Châu và cộng sự, Kiểm soát aflatoxin trên ngô và lạc có sử dụng các biên pháp xử lý thích ứng. II/. Tiếng anh: 1.AOAC(1990), Official methods of analysis. Carnaghan, R.B.A Hartlay, R.D., and Okelly, J.Toxicity va fluorescence properties of the aflatoxin. Nature(lond), 200:1101. 2.Christensen Clyde, M.Kaufmann Henry(1969). Grain Storage, Mineapolis, University of Minesota Press. 3.Coker R.D Jewers k.Jones B.D .1988: The treatment of the aflatoxin contamination. Tropical Science 30:125-136.1985. 4.Coker R.D Jewers k.Jones B.D- the destruction of aflatoxin by ammonia:practical possibilities. Tropical Science 41:89-13. 5.Coker R.D Jewers k.Jones B.D(1998) , aflatoxin control and detoxinfication. Tropical Science 41:89-13. 6.Dian-Sheng Wang, Yoshitsugu Sugiura,Yoshio Veno, Pravitr buddhanont and Maitue Suttafit(1993), A linuted survey for the nature occurrence of fumonisin in Thailand, Thai j.Toxicolony 42-43. 7.Donald and Pieter (1994)- the contamination of A.flavus in maize in the preharvest stage. Symposium of toxic microogarnism in the US. 8.De long, H., Beerthus, R.K Vles, R.O., Barret, CB., and Ord, W.O.(1962), investigation of the factor in groundnut meal responsible for Turkey disease Biochem. Biophys. Acta, 65:548-551. 9.Doronina, O. and Makshimenko, k., (1984)-Analytical methods of detection, identification, aquatitive determination of aflatoxin in foodstuff and fodder, FAO/ UNEP / USSR International training course “Training activities on food contamination control and monitoring with special reference to mycotoxin” Moscow. Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS: Nguyễn Thuỳ Châu, trưởng phòng Vi sinh, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau Thu hoạch đã tận tình hướng dẫn , giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn tới tập thể các nghiên cứu viên đang làm việc tại phòng Vi sinh, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau Thu hoạch đã giúp đỡ và hướng dẫn nhiệt tình, hiệu quả trong suốt thời gian tôi thực tập và thoàn thành khoá luận Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo làm việc và giảng dạy tại khoa Công Nghệ Sinh Học, viện ĐH Mở Hà Nội đã dạy dỗ tôi trong 4 năm học tại trường. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Hà Nội: ngày 16 tháng 5 năm 2006 Sinh Viên Đào Thị Hương Mục lục

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docLVV692.doc
Tài liệu liên quan