Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

1. Lý do chọn đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích 22 triệu ha [12]. Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa các vitamin nhóm B và một lượng hydratcacbon nhất định. Hạt lạc là nguyên liệu chính để sản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomát . và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Các phụ phẩm của lạc (khô dầu, thân, lá) dùng làm thức ăn cho gia súc hay phân bón đều tốt và rẻ tiền. Trồng lạc có tác dụng cải tạo đất và phù hợp với cơ cấu chuyển đổi kinh tế nông nghiệp hiện nay [11], [12]. Ở Việt Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây nông nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện canh tác còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn và ứng dụng khoa học tiên tiến vào sản xuất đã góp phần tăng năng suất lạc một cách đáng kể [15]. Năm 2005, năng suất bình quân đạt 18 tạ/ha, sản lượng đạt 485,610 nghìn tấn, so với 1995 năng suất mới chỉ là 13 tạ/ha. Tuy nhiên, sản xuất lạc ở nước ta vẫn còn nhiều yếu tố hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng lạc là khô hạn [16]. Để hạn chế ảnh hưởng của hạn tới năng suất cây trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tưới tiêu hợp lý cần sử dụng các giống có khả năng chịu hạn cao, đặc biệt ở những vùng đất không chủ động nước. Vì vậy, nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống lạc là rất cần thiết. Kỹ thuật chọn dòng biến dị soma cho phép thu được những dòng tế bào có khả năng chống chịu cao với các điều kiện bất lợi của môi trường [30], [43]. Đây là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng đã được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới và tạo ra những giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao trong một thời gian rút ngắn so với các phương pháp truyền thống [30], [51]. Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non và ở mức độ mô sẹo. - Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK 3. Nội dung nghiên cứu - Phân tích một số chỉ tiêu hoá sinh trong hạt tiềm sinh của các giống L08, L23, L24, LTB LCB, LBK - Xác định ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của một số enzym và chất tan tương ứng ở giai đoạn hạt nảy mầm. - Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây hạn nhân tạo. - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lạc ở mức độ mô sẹo thông qua xử lý bằng thổi khô. - Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc L08, L23, L24, LTB LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro: Xác định ngưỡng chọn lọc, tái sinh cây, tạo cây hoàn chỉnh, trồng ngoài đồng ruộng. - Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá ADN genome một số dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc. Trang MỞ ĐẦU 1 Chương 1. Tổng quan tài liệu 3 1.1. Giá trị kinh tế, đặc điểm nông sinh học và tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam . 3 1.2.Tính chịu hạn ở thực vật 5 1.3. Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá khả năng 9 chịu hạn và chọn dòng biến dị soma 1.4. Kỹ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật 11 Chương 2. Vật liệu và phương pháp 13 2.1. Vật liệu 13 2.2 Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1. Phương pháp hóa sinh . 14 2.3.2. Phương pháp sinh lý . 17 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy in vitro 18 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu trên đồng ruộng . 20 2.3.5. Phương pháp sinh học phân tử . 20 Chương 3. Kết quả và thảo luận 22 3.1. Hàm lượng protein và lipit của các giống lạc nghiên cứu 22 3.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB, L08 23 3.2.1. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn 23 hạt nảy mầm 3.2.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây hạn nhân tạo . 32 3.2.3. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn mô sẹo 39 3.2.4. Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu dựa trên sự phản ứng ở giai đoạn mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non . 43 3.3. Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc bằng kỹ thuật 45 nuôi cấy in vitro 3.3.1 Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu hạn bằng kỹ thuật thổi khô, tái sinh cây và 45 tạo cây hoàn chỉnh . . 3.3.2. Phân tích mức độ biến động di truyền một số đặc điểm nông học quần thể R0 45 . . 3.3.3. Nhận xét về chọn dòng tế bào chịu mất nước và đặc điểm nông học quần thể 50 R0 . . 3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN genome của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô 51 sẹo chịu mất nước . 3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 51 3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 52 3.4.3. Nhận xét về sự đa hình ADN của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo 58 chịu mất nước KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ . 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 .

pdf75 trang | Chia sẻ: maiphuongtl | Ngày: 11/06/2013 | Lượt xem: 1320 | Lượt tải: 3download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Đánh giá khả năng chịu hạn và tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn từ các giống lạc L08, L23, L24, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
mô sẹo các giống sau xử lý ở các ngưỡng thời gian khác nhau đều có khả năng tái sinh cao dao động từ 40,64% đến 100%. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, khả năng tái sinh của cây phụ thuộc vào nguồn gốc mô sẹo và mô sẹo dạng phôi có nguồn gốc từ đỉnh sinh trưởng mầm nên dễ tái sinh thành cây hơn [43]. Bảng 3.16. Khả năng tái sinh của mô sẹo sống sót sau xử lý thổi khô (%) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Giống Thời gian thổi khô (h) 0 3 6 9 L24 90,92 0,03 100 0,00 95,80 0,02 84,12 0,06 L23 89,14 0,04 91,18 0,06 73,56 0,01 71,42 0,12 L08 77,01 0,03 85,00 0,01 50,51 0,01 40,64 0,06 LTB 80,00 0,09 88,33 0,05 71,67 0,15 51,69 0,21 LCB 100 0,00 100 0,00 90,00 0,03 81,68 0,07 LBK 91,67 0,05 93,33 0,04 84,21 0,05 70,00 0,11 Thời gian xử lý càng cao thì tỷ lệ tái sinh càng giảm. Giống L24 có tỷ lệ tái sinh cao nhất, ở ngưỡng 3h tỷ lệ tái sinh đạt 100%, ở 9h thổi khô đạt 84,12%, còn giống L08 có tỷ lệ tái sinh thấp nhất ở 3h đạt 85,00%, nhưng đến ngưỡng 9h khả năng tái sinh chỉ còn 40,64%. Như vậy, khả năng tái sinh không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen mà còn chịu ảnh hưởng của thời gian xử lý thổi khô mô sẹo. Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy, mô của tất cả 6 giống lạc nghiên cứu qua xử lý mất nước ở ngưỡng 3 giờ thổi khô, khi sống sót thường có khả năng tái sinh cây cao hơn so với đối chứng (không bị xử lý) từ 1,01 đến 1,10 lần. Trong đó giống lạc L24, LCB có khả năng tái sinh cao so với các giống còn lại. Theo Lê Trần Bình và Cs (1995) nguyên nhân là do quá trình xử lý đã giết chết những tế bào mẫn cảm, chọn ra những tế bào có sức sống và khả năng tái sinh cao [1]. 3.2.3.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, L23, L08, LTB, LCB, LBK ở mức độ mô sẹo (1) Mô sẹo của 6 giống lạc đều bị mất nước nhanh khi thời gian xử lý thổi khô kéo dài. Khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của các giống nghiên cứu có sự khác nhau rõ rệt, cao nhất là giống L24, thấp nhất là giống L08. (2) Những mô sẹo sống sót đều có khả năng tái sinh cây. Khả năng tái sinh của mô sẹo sống sót sau khi xử lý ở ngưỡng 3 giờ cao hơn so với các ngưỡng còn lại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 (3) Khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo của các giống lạc có sự khác nhau, thứ tự từ cao xuống thấp như sau: L24 > LCB > L23 > LBK > LTB > L08. 3.2.4. Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu dựa trên sự phản ứng ở giai đoạn mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non Dựa trên những phân tích về khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non, bằng chương trình NTSYS pc2.02i chúng tôi đã xác định được hệ số khác nhau giữa các cặp giống lạc và thiết lập mối quan hệ giữa các giống dựa trên cơ sở của sự biểu hiện các tính trạng của các giống lạc đối với hạn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.17 và hình 3.10 Bảng 3.17. Hệ số khác nhau về sự biểu hiện các tính trạng của các giống lạc đối với hạn (%) L24 L23 L08 LTB LCB LBK L24 0,00 L23 1,58 0,00 L08 8,97 4,35 0,00 LTB 6,43 2,84 1,46 0,00 LCB 9,56 9,32 5,79 3,58 0,00 LBK 3,46 1,57 3,09 1,07 1,25 0,00 Bảng 3.17cho thấy hệ số khác nhau giữa các giống lạc nghiên cứu dao động từ 1,07 đến 9,56. Cặp giống có hệ số khác nhau cao nhất là L24 - LCB (9,56), thấp nhất là LTB - LBK (1,07). Từ sự phân tích hệ số khác nhau căn cứ vào sự biểu hiện của 72 tính trạng sơ đồ hình 3.10 cho thấy, 6 giống lạc chia thành 2 nhóm chính. Nhóm chính thứ nhất gồm 3 giống L24, L23, LCB , nhóm chính thứ hai gồm 3 giống còn lại L08, LBK, LTB. Kết hợp các kết quả phân tích ở giai đoạn mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non với sự phân nhóm dựa trên hệ số khác nhau về sự phản ứng của các giống lạc biểu hiện ở 72 tính trạng đã xác định được giống L24 có khả năng chịu hạn cao nhất trong các giống nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Hình 3.10. Sơ đồ mô tả quan hệ giữa các giống lạc dựa trên sự biểu hiện kiểu hình của 72 tính trạng 3.3. TẠO VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU CHO CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở CÁC GIỐNG LẠC BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO 3.3.1. Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu hạn bằng kỹ thuật thổi khô, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh Sau khi đánh giá khả năng chịu hạn của các giống, chúng tôi đặt ra vấn đề cần nghiên cứu chọn dòng chịu hạn của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK là những giống có khả năng chịu hạn kém. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống L23, L08, LTB, LCB, LBK ở mức độ mô sẹo, chúng tôi đã xác định được ngưỡng chọn dòng tế bào chịu hạn đối với giống L23, LCB, LBK là 9h thổi khô và giống L08, LTB là 6h thổi khô. Tuy nhiên để khẳng định được chắc chắn đó là các ngưỡng xử lý có hiệu quả đối với các giống cần phải tiếp tục theo dõi ở ngoài đồng ruộng, đánh giá các dòng cây thu được ở các thế hệ R0, R1, R2 ...bằng các phương pháp sinh lý, sinh hóa và các đặc điểm nông sinh học. Từ việc xác định ngưỡng chọn dòng ở trên, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc hàng loạt dòng tế bào chịu hạn của 5 giống L23, L08, LTB, LCB, LBK bằng kỹ thuật thổi khô luồng khí vô trùng của box cấy. Các khối mô sau thổi khô ở các ngưỡng chọn dòng được chuyển lên môi trường tái sinh cây để tiếp tục theo dõi khả năng sống sót và tái sinh cây. Kết quả thu được 159 dòng mô chịu mất nước và tái sinh được 315 dòng cây xanh phục vụ cho cho các nghiên cứu tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 3.3.2. Phân tích mức độ biến động di truyền một số đặc điểm nông học quần thể R0 Cây tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước của 5 giống nghiên cứu là L23, L08, LTB, LCB và LBK được chuyển vào môi trường tạo rễ, khi rễ dài từ 3cm - 4cm cấy chuyển trồng ngoài đồng ruộng trong vụ xuân 2008. Tiến hành chăm sóc dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và đối chứng trong điều kiện như nhau. Kết quả nghiên cứu ngoài đồng ruộng cho thấy, có sự sai khác về các đặc điểm nông học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc. Sự sai khác về các đặc điểm như chiều cao cây, số cành/cây, số quả/cây, thời gian sinh trưởng, kích thước quả, kích thước lá, số rễ và chiều dài rễ...ở quần thể R0 của các giống lạc L23, L08, LTB, LCB và LBK có xu hướng biến thiên gần như nhau. Vì vậy chúng tôi chọn kết quả của giống lạc LCB làm đại diện để trình bày trong bảng 3.18 Bảng 3.18. Mức độ biến động di truyền quần thể R0 của giống lạc LCB STT Chỉ tiêu theo dõi LCB đối chứng Quần thể R0 X ± mx Cv (%) X ± mx Cv (%) 1 Chiều cao cây (cm) 49,44±2,65 3,37 48,96±1,88 22,11 2 Số cành/cây 8,56±0,44 5,58 2,03±0,27 76,38 3 Số quả chắc/cây 22,33±1,74 6,68 2,63±0,45 80,12 4 Chiều dài quả (mm) 33,92±1,53 7,83 28,30±3,36 20,59 5 Chiều rộng quả (mm) 14,83±0,17 2,06 16,57±1,52 15,86 6 Số lượng rễ 13,22±0,68 5,48 1,39±0,21 56,51 7 Chiều dài rễ (cm) 16,33±1,96 3,60 3,57±0,57 85,20 Chiều cao cây Chiều cao của cây lạc là kết quả của sự kết hợp giữa quá trình sinh trưởng sinh dưỡng và sinh trưởng sinh thực [38]. Tính trạng chiều cao cây chủ yếu do đặc tính di truyền quyết định. Trong 5 giống nghiên cứu, quần thể R0 giống LTB và L08 có chiều cao cây giảm so với giống gốc, từ 8,32% - 17,49%. Còn 2 giống LCB, L23 chiều cao cây không có sự sai lệch so với đối chứng, chiều cao cây của quần thể R0 có nguồn gốc từ giống LCB đạt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 48,96cm, đối chứng đạt 49,44cm. Riêng quần thể R0 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống LBK có chiều cao cây lớn hơn giống gốc, gấp 1,45 lần (tăng 44,91% so với đối chứng). Số cành/ cây Số cành/cây liên quan trực tiếp đến số quả, thường các giống lạc chỉ có hai cấp cành với tổng số từ 6 - 10 cành. Số cành/cây phụ thuộc khá lớn vào điều kiện ngoại cảnh [12]. Kết quả theo dõi thí nghiệm cho thấy, ở cả 5 quần thể R0 có nguồn gốc từ mô sẹo xử lý thổi khô đều có số cành/cây giảm, giảm từ 55,53% - 78,13% so với giống gốc. Cụ thể giảm nhiều nhất là các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống L23 (giảm 78,13%), tiếp đến là giống LCB (giảm 76,28%). Số cành/cây là một trong các chỉ tiêu biến đổi mạnh nhất ở thế hệ R0 (Cv%=76,38% so với đối chứng Cv%=5,58%). Số lượng cành/cây của thí nghiệm giảm, điều này chứng tỏ rằng trong quá trình tạo mô sẹo, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh, các dòng cây có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước đã chịu các tác động cơ học, ảnh hưởng tới các mầm nách ở các đốt trên thân, làm cho các đốt ngắn lại hoặc trùm lên nhau, đặc biệt là các đốt thứ nhất và thứ hai, đây là các đốt có vai trò quan trọng trong sự phân cành và tạo quả lạc [38]. Số quả/cây, kích thƣớc quả Quần thể R0 của 5 giống nghiên cứu đều có số quả/cây giảm rất lớn so với giống gốc, giảm >80%. Số quả chắc/cây có mối tương quan thuận và chặt chẽ với năng suất, chỉ tiêu này phụ thuộc vào kiểu gen của từng giống và sự tác động của điều kiện ngoại cảnh. Trong 7 chỉ tiêu theo dõi thì số quả/cây của các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo được xử lý thổi khô biến đổi mạnh nhất (Cv%=80,12%, ĐC Cv%=6,68). Số quả/cây của các dòng thí nghiệm biến thiên từ 0-6 (quả), đối chứng biến thiên từ 20-28 (quả). Xuất hiện các biến dị về hình dạng quả như: eo thắt, mỏ quả, đường vân trên vỏ quả...Các đặc điểm về mỏ quả, độ thắt, kích thước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 trọng lượng quả và số hạt là những chỉ tiêu để phân loại các giống lạc [38]. Kích thước quả (chiều dài và chiều rộng quả) đều giảm so với đối chứng, nhưng giảm không nhiều. Chiều dài giảm từ 4,57% - 26,79%, chiều rộng giảm từ 7,56% - 33,52%. Các dòng lạc có nguồn từ mô sẹo chịu mất nước của giống LCB có chiều dài quả giảm 16,56% so với giống gốc, nhưng lại có chiều rộng quả tăng 11,73% so với đối chứng. Nhìn chung ở cả 5 quần thể R0 kích thước quả không có sự biến động lớn so với đối chứng (Cv% thí nghiệm dao động từ 5,15% - 21,20%, đối chứng dao động từ (1,64%-7,51%). Số lƣợng rễ và chiều dài rễ Số lượng rễ và chiều dài rễ của các dòng lạc thí nghiệm đều giảm rất nhiều so với giống gốc (số lượng rễ giảm 89,49%, chiều dài rễ giảm 78,14%). Quan sát quần thể R0 của cả 5 giống nghiên cứu đều nhận thấy rằng, rễ được tạo thành trong nuôi cấy in vitro khi cấy chuyển ra đồng ruộng đa số là bị đứt, để hình thành rễ mới. Tuy nhiên, số lượng rễ mới được hình thành ở mỗi dòng lại rất ít. Theo chúng tôi, kết quả thu được này là phù hợp vì rễ lạc phát triển mạnh từ lúc cây bắt đầu mọc cho đến khi có 5 lá, sau đó giảm dần, đến khi ra hoa và hình thành quả, hạt tốc độ phát triển của rễ giảm tối đa [38]. Những biến đổi về các đặc điểm nông học ở quần thể R0 đã chứng tỏ, mô sẹo sống sót sau khi xử lý thổi khô ở các ngưỡng chọn dòng đều có sự biến đổi lớn về các đặc tính sinh lý dẫn tới sự biến động về các tính trạng hình thái. Đây là cơ sở cho công tác tạo nguồn vật liệu khởi đầu và chọn ra được các dòng chịu hạn bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Sự sai khác về các đặc điểm nông sinh học giữa các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước so với giống gốc mà chúng tôi thu được phù hợp với những nghiên cứu trước đây trên nhiều đối tượng như lúa, lạc, thuốc lá [31], [33], [40], [43]... Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Qua phân tích và chọn lọc ở quần thể R0 của 5 giống nghiên cứu là L23, L08, LTB, LCB và LBK chúng tôi có một số nhận xét sau: - Mô chọn lọc từ giống lạc L08 thu được biến dị về thời gian sinh trưởng (ra hoa muộn hơn 15 ngày so với các giống L23, L08, LTB, LCB ), chiều cao cây thấp. - Mô chọn lọc từ giống lạc LCB thu được biến dị về chiều rộng quả, thời gian sinh trưởng (ra hoa sớm hơn). - Mô chọn lọc từ giống lạc LTB thu được biến dị về kích thước quả (chiều dài và chiều rộng quả đều lớn hơn so với đối chứng). Chiều dài đạt 29,08mm tăng 19,18%, chiều rộng đạt 12,9mm tăng 11,97% so với giống gốc. - Mô chọn lọc từ giống lạc LBK thu được biến dị về chiều cao cây, chiều cao cây tăng gấp 1,45 lần so với đối chứng. + Dòng 15(D15), dòng 32(D32) quả có eo thắt đặc biệt. + Dòng 4 (D4), dòng 12 (D12) quả có 3 hạt. A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 C D Hình 3.11. Một số hình ảnh về biến dị quả của các dòng chọn lọc từ giống LBK A. Quả đối chứng B. Biến dị eo thắt quả C. Biến dị quả 3 hạt D. Biến dị mỏ quả A: Giống gốc LCB B: Các dòng thuộc quần thể R0 khi ra hoa C: Quần thể R0 khi tạo quả D: Quả lạc đối chứng E: Quả lạc thuộc các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo mất nước A D B E C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Hình 3.12. Một số hình ảnh các dòng tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống LCB ngoài đồng ruộng 3.3.3. Nhận xét về chọn dòng tế bào chịu mất nƣớc và đặc điểm nông học quần thể R0 (1) Ngưỡng chọn lọc các dòng mô chịu hạn ở 5 giống lạc nghiên cứu L23, LCB, LBK là 9h thổi khô và giống L08, LTB là 6h thổi khô. (2) Đã tiến hành sàng lọc được 159 dòng mô có khả năng chịu hạn và 315 dòng cây xanh của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. (3) Quần thể R0 có mức độ biến động di truyền lớn về các đặc điểm nông học (chiều cao cây, số cành/cây, số quả chắc/cây, kích thước quả, số lượng và chiều dài rễ, thời gian sinh trưởng...). Đây là đặc điểm thuận lợi cho việc chọn ra các cá thể đầu dòng theo yêu cầu tạo giống. Tuy nhiên, để khẳng định được khả năng di truyền, tính chịu hạn của các dòng và những biến dị có lợi xuất hiện ở quần thể R0 thì cần phải tiếp tục theo dõi, đánh giá bằng các phương pháp sinh lý, hóa sinh ở các thế hệ tiếp theo. 3.4. ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÒNG LẠC CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC Trong những năm gần đây, các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã và đang được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong các nghiên cứu như: Phân tích và đánh giá bộ genome của thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [10], [47] , sử dụng các chỉ thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống cây trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống, đánh giá một cách hữu hiệu tính đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [33], [47]... Sự ra đời và phát triển các kỹ thuật sinh học phân tử Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 hiện đại là những công cụ đắc lực ngày càng được áp dụng rộng rãi và hiệu quả trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng. Các dòng lạc tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước được trồng ở vụ xuân 2008, chúng tôi đã chọn được 5 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của giống lạc địa phương Cao Bằng (LCB). Đây là những dòng có một số đặc điểm nông học sai khác so với giống gốc để phân tích đặc điểm genome bằng kỹ thuật RAPD, làm cơ sở cho các nghiên cứu chọn lọc tiếp theo. 3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số Kết quả tách chiết ADN từ lá lạc của các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước được trình bày ở bảng 3.19. Bảng 3.19 cho thấy tỷ lệ OD260/OD280 dao động từ 1,83-1,92 và OD260/OD230 dao động từ 1,80-1,87. Khoảng biến động này đều nằm trong giới hạn cho phép (1,8 - 2,0). Điều này khẳng rằng định các mẫu ADN tách chiết được đều sạch. Bảng 3.19. Độ sạch và hàm lượng ADN của các mẫu lạc nghiên cứu Tên mẫu OD260 OD260/OD230 OD260/OD280 Hàm lƣợng ADN (ng/ l) LCB 0,02640 1,82 1,86 264,0 D2 0,02475 1,83 1,92 247,5 D18 0,02578 1,80 1,83 257,8 D21 0,02514 1,80 1,90 251,4 D67 0,02637 1,87 1,87 263,7 D121 0,02352 1,81 1,85 235,2 Ngoài phương pháp đo quang phổ hấp thụ, chúng tôi còn sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di trên cho thấy, các mẫu ADN tách chiết từ lá lạc cho một băng duy nhất, sắc nét, có phân tử lượng cao, ở gần giếng và không có sự đứt gãy của các phân tử ADN. 3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 ADN tổng số của 5 dòng chọn lọc và giống gốc được phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên. Đánh giá tính đa hình thông qua giá trị PIC (Polymorphism information content), giá trị PIC càng lớn thì tính đa hình của mồi đó càng cao, tính khoảng cách di truyền thông qua hệ số tương đồng và biểu đồ hình cây. 3.4.2.1. Số phân đoạn, tần số xuất hiện và đa hình về phân đoạn ADN đƣợc nhân bản Sản phẩm RAPD với các mồi khác nhau được điện di trên gel agarose 1,8% để phân tích tính đa hình ADN của 6 mẫu cây nghiên cứu. Bảng 3.20 cho thấy, số lượng các phân đoạn ADN nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 29-62 phân đoạn. Kích thước các phân đoạn ADN được nhân bản trong khoảng từ 250-2000bp. Tổng số phân đoạn ADN nhân bản được của 10 đoạn mồi RAPD khi phân tích 6 mẫu lạc là 404. Trong số 10 mồi phân tích, số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lạc với mồi DTN15 là nhiều nhất (62 phân đoạn ADN) và ít nhất là mồi DTN19 (29 phân đoạn). Tổng số phân đoạn được nhân bản của các mẫu lạc dao động từ 61-71 phân đoạn. Trong đó, hai dòng D21 và D67 cùng nhân được 71 phân đoạn ADN Bảng 3.20. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của 6 mẫu lạc khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên Mồi LCB D2 D18 D21 D67 D121 Tổng số phân đoạn ARA42 6 6 6 6 6 6 36 CUM43 5 5 5 5 5 5 30 DTN05 5 5 6 6 6 6 34 DTN13 7 7 7 7 7 7 42 DTN15 9 9 11 11 11 11 62 DTN19 7 5 2 5 5 5 29 OPE10 5 5 8 8 8 8 42 OPM46 6 6 6 6 6 6 36 OSP31 7 7 9 9 9 8 49 UPH04 6 6 8 8 8 8 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Tổng số 63 61 68 71 71 70 404 Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các dòng với nhau và với giống gốc trong cùng 1 mồi. Kết quả ở bảng 3.21 cho biết, tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc khi phân tích 10 mồi ngẫu nhiên là 74 phân đoạn. Trong đó số phân đoạn đa hình là 16 (chiếm 21,62%) và không đa hình là 58 (78,38%). Trong số 10 mồi nghiên cứu có 4 mồi không cho tính đa hình. Mồi DTN19 cho tính đa hình cao nhất (75%), 4 mồi ARA42, CUM 43, DTN13 và OPM46 không cho tính đa hình (0%). Kết quả này cũng phù hợp khi phân tích hàm lượng thông tin đa hình (giá trị PIC). Cụ thể: giá trị PIC của mồi ARA42, CUM 43, DTN13 và OPM46 là 0 (không đa hình) và giá trị PIC của mồi DTN19 là 0,55 (đa hình cao nhất). Tuy nhiên, giá trị PIC không chỉ liên quan tới tỷ lệ phân đoạn ADN đa hình mà còn cho biết số lượng cá thể cùng xuất hiện phân đoạn đa hình lớn hay nhỏ. Hầu hết các mồi đều cho tính đa hình không cao (PIC < 0,5). Mặc dù vậy, với 10 mồi ngẫu nhiên này cũng đã thể hiện được tính đa hình của 6 mẫu nghiên cứu. Bảng 3.21. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên Mồi Số phân đoạn ADN Số phân đoạn đa hình Số phân đoạn đơn hình % phân đoạn đa hình Giá trị PIC ARA42 6 0 6 0,00 0,00 CUM43 5 0 5 0,00 0,00 DTN05 6 1 5 1,67 0,09 DTN13 7 0 7 0,00 0,00 DTN15 11 2 9 18,18 0,10 DTN19 8 6 2 75,00 0,55 OPE10 8 3 5 37,50 0,21 OPM46 6 0 6 0,00 0,00 USP31 9 2 7 22,22 0,15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 UPH04 8 2 6 25,00 0,14 Tổng số 74 16 58 21,62 1,24 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR-RAPD trên gel agarose 1,8% của 4 mồi DTN15, DTN19, USP31 và UPH04 được thể hiện ở hình 3.13, hình 3.14. Mồi DTN15: Trong phạm vi vùng phân tích thu được nhiều nhất 11 phân đoạn ADN với kích thước nằm trong khoảng 250-9000bp. Ở kích thước khoảng 1500bp và 9000bp ở mẫu đối chứng (LCB) và dòng D2 đều không xuất hiện phân đoạn ADN. Trong 6 mẫu lạc nghiên cứu thu được tổng số 62 phân đoạn ADN, dao động giữa các mẫu từ 9-11 phân đoạn. Mồi DTN19: Mồi DTN19 cho tổng số phân đoạn ADN của 6 mẫu lạc thu được là 29. Kích thước các phân đoạn ADN thu được dao động trong khoảng 250bp -1500bp. Trong đó, có tới 6 phân đoạn ADN được nhân bản thể hiện tính đa hình. Điển hình ở kích thước khoảng 1200bp và 1500bp ở hai mẫu D18 và D21 không xuất hiện phân đoạn ADN được nhân bản. Trong khi đó, ở kích thước khoảng 300bp, hai mẫu LCB và D2 có phân đoạn ADN được nhân lên trong khi đó các mẫu còn lại không xuất hiện. Hình 3.13: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi DTN15 và DTN19 M-Marker 1kb; 1.LCB; 2. D2; 3. D18; 4. D21; 5. D67; 6. D121 (←: xuất hiện; →: không xuất hiện) M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Mồi USP31: Trên phạm vi vùng phân tích thu được 49 phân đoạn ADN với kích thước dao động trong khoảng 300bp-1500bp. Ba dòng D18, D21và D67 cho số phân đoạn lớn nhất (9 phân đoạn), ở kích thước khoảng 1500bp, giống LCB, D2, D121 không xuất hiện phân đoạn ADN và ở kích thước khoảng 1000bp, hai mẫu LCB và D2 cũng không xuất hiện phân đoạn ADN. Các phân đoạn còn lại đều xuất hiện ở tất cả các mẫu. Mồi UPH04: Tổng số có 8 phân đoạn ADN xuất hiện, trong đó có 2 phân đoạn cho tính đa hình. Kích thước các phân đoạn được nhân bản dao động từ 300bp-1800bp. Các dòng D18, D21, D67 và D121 xuất hiện các phân đoạn ADN với kích thước 1500bp và 1800bp. Hình 3.14: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi USP31và UPH04 M-Marker 1kb; 1.LCB; 2. D2; 3. D18; 4. D21; 5. D67; 6. D121 (←: xuất hiện; →: không xuất hiện) Sự xuất hiện hay biến mất các phân đoạn ADN chứng tỏ các dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước đã có sự thay đổi ở mức độ gen. 3.4.2.2. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc so với giống gốc ở mức độ phân tử Các số liệu số phân tích PCR-RAPD được xử lý và phân tích trong chương trình NTSYSpc version 2.0 nhằm tìm ra khoảng cách di truyền giữa các mẫu lạc nghiên cứu thông qua hệ số tương đồng di truyền và biểu đồ hình cây. M 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Để kiểm tra phương pháp phân nhóm, chúng tôi đã tiến hành xác định giá trị tương quan kiểu hình theo ba phương pháp tính hệ số di truyền (phương pháp của Jaccard, của Nei & Li, của Sokal) với bốn kiểu phân nhóm (WPGMA, UPGMA, liên kết hoàn toàn và liên kết đơn lẻ). Biểu đồ hình cây được thiết lập dựa trên giá trị tương quan cao nhất với các giá trị khi r 0,9: tương quan rất chặt, r = 0,8 - 0,9: tương quan chặt, r = 0,7 - 0,8: tương quan tương đối chặt, r 0,7: tương quan không chặt. Bảng 3.22. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương đồng Phương pháp Kiểu phân nhóm UPGMA WPGMA Liên kết hoàn toàn Liên kết đơn lẻ SM 0,98848 0,98844 0,98801 0,98828 Dice 0,98689 0,98686 0,98646 0,98669 Jaccard 0,98860 0,98856 0,98809 0,98838 Bảng 3.22 cho thấy, với ba cách tính hệ số di truyền giống nhau và bốn kiểu phân nhóm đều phản ánh mối tương quan kiểu hình của 6 mẫu lạc là rất chặt (hệ số r đạt từ 0.98646 tới 0.98860). Trong đó giá trị tương quan kiểu hình (r) lớn nhất 0.98860 khi tính theo hệ số di truyền Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Vì vậy, sơ đồ hình cây được thiết lập theo hệ số di tryền giống nhau Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA. Kết quả bảng 3.23 cho thấy, hệ số sai khác di truyền của 5 dòng tạo được so với giống gốc từ 0,0318 - 0,2055. Dòng D2 có độ sai khác thấp nhất so với giống gốc (0,0318), dòng D18 có sự sai khác lớn nhất so với giống gốc (0,2055). Như vậy, cả 5 dòng cây mới tạo được đã thể hiện mức độ sai khác về sự tương đồng so với giống gốc tuy không lớn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 So sánh hệ số sai khác di truyền giữa các dòng cho thấy, sự khác biệt lớn nhất tìm thấy ở dòng D2 và D121, hai dòng D21 và D67 không có sự sai khác. Như vậy, trong 6 mẫu lạc nghiên cứu đã có sự phân tách giữa các dòng mới tạo được và giống gốc đồng thời giữa các dòng mới tạo được cũng có sự khác biệt nhất định. Bảng 3.23. Hệ số sai khác di truyền của các dòng và giống gốc Giống LCB D2 D18 D21 D67 D121 LCB 0,0000 D2 0,0318 0,0000 D18 0,2055 0,1831 0,0000 D21 0,1644 0,1918 0,0423 0,0000 D67 0,1644 0,1918 0,0423 0,0000 0,0000 D121 0,1781 0,2056 0,0564 0,0417 0,0417 0,0000 Hình 3.15 cho thấy mức độ sai khác giữa các dòng và giống gốc. Các dòng và giống có hệ số tương đồng di truyền gần nhau được xếp vào một nhóm, sự liên hệ giữa các nhóm cũng được thể hiện. - Nhánh 1: Bao gồm giống gốc LCB và dòng D2, có sự sai khác so với 4 dòng còn lại là 19% (1- 0,81). - Nhánh 2: Bao gồm 4 dòng D18, D21, D67 và D121, được chia thành 2 nhóm phụ: nhóm phụ 1 chỉ có dòng D18, nhóm phụ 2 gồm các dòng D21, D67, D121. Trong đó hai dòng D21 và D67 không có sự khác biệt về mặt di truyền khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên, hai dòng này có sự tương đồng với dòng D121 là 0,9583 và dòng D18 là 0,9577. Tuy nhiên để có thể kết luận hai dòng mới trên có giống nhau hoàn toàn hay không thì nên sử dụng nhiều mồi để phân tích tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Hình 3.15. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn lọc và giống gốc A. LCB gốc; A-1. D2; A-2. D18; A-3. D21; A-4. D67; A-5. D121 Như vậy, mặc dù chỉ sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích nhưng cũng chỉ ra sự đa dạng di truyền của cả 5 dòng lạc so với giống gốc . Sự đa hình các sản phẩm của RAPD là kết quả của sự thay đổi các điểm gắn của primer (ví dụ: đột biến điểm) hoặc do sự thay đổi nhiễm sắc thể trong các vùng được nhân bản sẽ gây ra sự thay đổi về kích thước hay ngăn cản sự nhân bản của ADN mẫu. Do đó các đa hình thường được nhận ra do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus [48]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy RAPD là một phương pháp hiệu quả trong việc phân tích nguồn gốc các loài, xác định các đặc tính của cây có nguồn gốc từ nuôi cấy mô tế bào [10], [47]. 3.4.3. Nhận xét về sự đa hình ADN của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc (1) Phân tích tính đa hình của 6 mẫu lạc với 10 mồi ngẫu nhiên thì có 6/10 cho tính đa hình. Trong đó mồi DTN19 cho tính đa hình cao nhất với giá trị PIC=0,55; các mồi còn lại giá trị PIC<0,5. (2) Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc LCB từ 0,0318 - 0,2055. So sánh hệ số sai khác di truyền giữa các dòng cho thấy, sự khác biệt lớn nhất tìm thấy ở dòng D2 và D121. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 (3) Biểu đồ hình cây và hệ số tương đồng di truyền của 6 mẫu lạc nghiên cứu được xếp thành 2 nhánh chính: - Nhánh 1: gồm giống gốc LCB và dòng D2. - Nhánh 2: gồm 2 nhóm phụ (nhóm phụ 1: dòng D18; nhóm phụ 2: Dòng D21, D67, D121). Những kết quả này chứng tỏ các dòng tạo ra từ mô sẹo chịu mất nước của giống lạc địa phương Cao Bằng đã có những thay đổi ở mức phân tử trong bộ gen. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1. Khả năng chịu hạn của 6 giống lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non 3 lá và ở mức độ mô sẹo được sắp xếp theo thứ tự sau: L24> LCB> L23 > LBK> LTB >L08. 2. Ngưỡng chọn dòng chịu hạn của các giống lạc phụ thuộc vào khả năng chịu mất nước của mô sẹo từng giống. Đối với các giống LBK, LCB, L23 là 9 thổi khô và giống LTB, L08 là 6h thổi khô. Đã tiến hành sàng lọc được 159 dòng mô và 315 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn. 3. Quần thể R0 có mức độ biến động cao ở nhiều tính trạng nông học, cho phép lựa chọn được những dòng có tính trạng mong muốn. 4. Sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của một số dòng R1 có nguồn gốc từ giống LCB cho thấy: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 (a) Có 6/10 cho tính đa hình (b) Hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc LCB từ 0,0318 - 0,2055. Điều đó khẳng định các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước có sự thay đổi trong ADN genome. 2. Đề nghị Tiếp tục theo dõi, phân tích các dòng của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB, L08 ở các thế hệ tiếp theo về các đặc điểm nông học, hóa sinh, khả năng chịu hạn... để chọn ra các dòng triển vọng có khả năng chịu hạn cao. CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Thu Giang, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2008), "Đặc điểm phản ứng của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Số 2(46), tr. 97- 104. 2. Nguyễn Thu Giang, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2008), " Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội. 2. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, Hồ Hữu Nhị (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường (1998), Thực hành hóa sinh học, Nxb Giáo dục, tr. 3 - 27. 4. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1999), Hóa sinh học, NXB Giáo dục, tr.14 - 77. 5. Nguyễn Khoa Chi (1987), Cây đậu phộng, Nxb Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 4 - 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 6. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), " Mối tương quan giữa hàm lượng proline và tính chống chịu ở cây lúa", Tạp chí Công nghệ sinh học 1 (1), tr. 85 - 95. 7. Nguyễn Lân Dũng (1979), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3, Nxb Hà Nội, tr. 116 - 120. 8. Ngô Thế Dân, Nguyễn Xuân Hồng, Đỗ Thị Dung, Nguyễn Thị Chinh, Trần Đình Long, Nguyễn Thị Đào, Phạm Văn Toản, Gowda C. L. (2000), Kỹ thuật đạt năng suất lạc cao ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 2 - 138. 9. Lê Song Dự, Nguyễn Thế Côn (1979), Giáo trình cây lạc, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 7 - 44. 10. Lê Xuân Đắc, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (1999). "Sử dụng kỹ thuật RAPD để đánh giá tính đa hình ADN của một số dòng chọn lọc từ mô sẹo của giống lúa C71". Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 1341-1347. 11. Trần Văn Điền (1990), Giáo trình cây lạc, Trường Đại học Nông nghiệp , Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 6 - 81. 12. Nguyễn Danh Đông, Ngô Ngọc Đăng, Nguyễn Thế Côn, Dương Văn Nghĩa, Lê Quang Hanh, Ngô Đức Dương (1984), Cây lạc, Nxb Hà Nội, tr. 3 - 239. 13. Trần Kim Đồng, Nguyễn Quang Phổ, Lê Thị Hoa (1991), Giáo trình sinh lý cây trồng, Nxb Giáo dục. 14. Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền (2007), "Sự biến đổi hàm lượng amino acid proline ở rễ và lá đậu xanh dưới tác động của tress muối NaCl", Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc, Nxb KH&KT, tr. 482-485. 15. Nguyễn Xuân Hồng, Đỗ Thị Dung, Nguyễn Thị Chính, Vũ Thị Đào, Phạm Toàn Thắng, Trần Đình Long (2000), Kỹ thuật đạt năng suất lạc cao, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 16. Trần Văn Lài (1991), Yếu tố sinh học hạn chế sản xuất lạc ở Việt Nam, tiến bộ kỹ thuật về trồng lạc và đậu đỗ ở Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 17. Ngô Thị Liêm, Chu Hoàng Mậu (2006), "Đặc điểm phản ứng các giống lạc trong điều kiện hạn sinh lý", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (84), tr 82-87. 18. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, tr. 18 - 36. 19. Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2005), "Protein dự trữ và protease hạt cây trồng", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(4), tr. 37 -45. 20. Trần Thị Phương Liên, Lê Thị Muội (2004), Nghiên cứu thành phần đường tan trong chọn giống ở đậu tương, Báo cáo khoa học - Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học & Kỹ thuật, tr. 473 -475. 21. Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002), Kỹ thuật di truyền và ứng dụng, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội. 22. Nguyễn Hoàng Lộc, H. T. T Ngọc, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1992), "Nghiên cứu khả năng chịu mất nước ở mô sẹo thuốc lá nuôi cấy in vi tro", Tạp chí sinh học, (14), tr. 31- 37. 23. Nguyễn Văn Mã, Cao Bá Cường, Nguyễn Thị Thanh Hải (2005), Một số chỉ tiêu sinh lý của giống lạc chịu hạn, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học & Kỹ thuật, tr. 504 - 507. 24. Chu Hoàng Mậu, Ngô Thị Liêm, Nguyễn Thị Tâm (2006), "Đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống lạc bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro", Hội nghị Khoa học và Công nghệ Toàn quốc 2006, Nxb KH&KT, tr. 202 -209. 25. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Vân Anh (2005), "Khảo sát chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương ở vùng núi phía Bắc", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (17), tr. 19 -23. 26. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội, tr. 86 - 127 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 27. Nguyễn Thị Thu Ngà, Nguyễn Thị Tâm (2007), "Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến một số chỉ tiêu sinh hóa ở giai đoạn nảy mầm của một số giống lạc", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (6), tr. 34 - 39. 28. Nguyễn Thị Thu Ngà, Nguyễn Thị Tâm (2007), "Đánh giá khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo và giai đoạn cây non của các giống lạc", Báo cáo khoa học tại hội nghị toàn quốc 2007 - Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT, tr. 805 - 808 29. Phạm Thị Thanh Nhàn, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2007), "Một số đặc trưng chịu hạn của một số giống ngô nếp (Zea may L.) địa phương ở giai đoạn mô và cây non", Báo cáo khoa học tại hội nghị toàn quốc 2007 - Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb KH&KT, tr. 784 - 787. 30. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Văn Tĩnh, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), "Kết quả chọn tạo và triển khai sản xuất hai giống lúa mới DR1 và DR2 bằng công nghệ tế bào thực vật", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, (36), tr. 1- 9. 31. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 32. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hóa sinh hạt và tính đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên, tr. 48 - 67. 32. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật", Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội. 34. Bùi Văn Thắng, Trần Văn Dương, Đinh Thị Phòng, Nguyễn Văn Thắng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), "Đánh giá tính đa dạng của một số dòng lạc trong tập đoàn chống chịu bệnh gỉ sắt bằng kỹ thuật RAPD", Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học Toàn Quốc, Nxb KH&KT, Hà Nội, tr. 805-809. 35. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Mạnh Quỳnh (2006), "Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến một số chỉ tiêu hóa sinh ở hạt nảy mầm của một số giống lúa", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, 12(2), tr. 29 - 33. 36. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm (2006), "Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở một số giống lúa bằng công nghệ tế bào thực vật", Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, (17), tr. 29 - 32. 37. Bùi Thị Thu Thủy, Nguyễn Thị Tâm (2006), "Đánh giá sự đa hình ADN của một số dòng lúa có nguồn gốc từ mô sẹo thổi khô giống U17", Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Đại học Thái Nguyên, 39, tr. 65 - 71 38. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006), Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây lạc, Nxb Lao Động, Hà Nội, tr. 2 - 86. 39. Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lý thống kê kết quả nghiên cứu thực nghiệm trong nông, lâm, ngư nghiệp trên máy vi tính, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 40. Nguyễn Tường Vân, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1994), Chọn dòng chịu muối ở lúa bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật, Kỷ yếu viện CNSH, Nxb KH&KT, Hà Nội, tr. 19 - 27. 41. Nguyễn Văn Vinh, Lê Duy Thành, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1995), "Nghiên cứu khả năng chịu nhôm và acid của các giống lúa DDC3,CM10, Pokaly, Cườm, Chiêm Bầu, C202, NN8, OM861-20, OM296 và Tép lai", Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, (4), tr. 23 - 26. 42. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (1997), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội, tr. 125 - 224. Tiếng nƣớc ngoài 43. Adkind S. W., Kunanuvatchaidach R., Godwin I. D., 1995. Somaclonal variation in rice- drought tolerant and other agronomic characters. Australia journal of Botany, 4 (2), tr.201-209. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 44. Bates L.S., (1973), Rapid determination of free protein for water-stress studies, Plant and Soil, 39, pp.205-207. 45. Delauney A., Verma DPS., (1993), Proline biosynthesis and osmoregulation in plan, Plant J, 4, pp. 215 – 223. 46. Doyle J.J and J.L. Doyle, 1987. Phytochemistry Bulletin, pp. 11-15. 47. Dinh Thi Phong, Le Thi Muoi, Le Tran Binh (2001), RAPD variability in rice (Oryza sativa L.) plants derived from desisccation-tolerance calli, Euphytica 00, pp.1-7. 48. Foolad M. R., Siva A., and Rodriguer L. R, (1995). Application of polymerase chain reaction (PCR) to plant genome analysis. In: Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Fundamental methods. Springer Verlag, Berlin, Heideberg, p. 281-298. 49. Hu ACA., Delauney AJ., Verma DPS. (1992), A bifunctional enzyme (P5CS) catalyses the first two steps in proline biosynthesis in plants, Proc Natl Acad Sci USA, 83, pp. 1203 – 1207. 50. Raina SN V, Kojima T, Ogihara Y, Singh KP, Devarumath RM (2001), "RAPD and ISSR figerprints as useful genetic markers for analysis of genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species" Genome, 44(5), 763- 772. 51. Zheng K L., Zhou Z. M., Wang G. L., Lou Y. K., Xiong Z. M., (1989). Somatic cell culture of rice cultivars with difference grain types: Somaclonal variation in some grain quality characters. Plant cell, tissue and organ culture 18: 201 - 208. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Tác giả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 Nguyễn Thu Giang LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Chu Hoàng Mậu - Đại học Thái Nguyên, Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa, sự giúp đỡ của Ths. Nguyễn Thị Thu Ngà, KTV Đào Thu Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào), CN Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền học) và CN Nguyễn Thị Hồng Liên đã giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Tôi xin cảm ơn Trung tâm thực nghiệm đậu đỗ - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các tỉnh Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Bình đã cung cấp các giống lạc có chất lượng cao làm vật liệu nghiên cứu cho đề tài luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Y khoa Thái Nguyên, Bộ Môn Hóa Sinh - Khoa Khoa học cơ bản, gia đình, bạn bè cùng đồng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Trang MỞ ĐẦU........................................................................................................................................ 1 Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu.................................................................................. 3 1.1. Giá trị kinh tế, đặc điểm nông sinh học và tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam................................................................................................................................................. 3 1.2.Tính chịu hạn ở thực vật.......................................................................................................... 5 1.3. Một số thành tựu nuôi cấy mô và tế bào thực vật vào việc đánh giá khả năng chịu hạn và chọn dòng biến dị soma…………………………...................................... 9 1.4. Kỹ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật…………………….......... 11 Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp........................................................................................ 13 2.1. Vật liệu.................................................................................................... .............. 13 2.2.. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu……………………………………… 13 2.3. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………...... 14 2.3.1. Phương pháp hóa sinh………………………………………............................. 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 2.3.2. Phương pháp sinh lý………………………………………............................... 17 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy in vitro………………………………………................ 18 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu trên đồng ruộng …………………………………... 20 2.3.5. Phương pháp sinh học phân tử ………………………………………………. 20 Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận……………………………………….................... 22 3.1. Hàm lượng protein và lipit của các giống lạc nghiên cứu ……………................ 22 3.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB, L08 …………… 23 3.2.1. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn hạt nảy mầm………………………………………………………………………….. 23 3.2.2. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây hạn nhân tạo..................................................................................... 32 3.2.3. Khả năng chịu hạn của các giống lạc L24, LCB, L23, LBK, LTB,L08 ở giai đoạn mô sẹo............................................ 39 3.2.4. Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu dựa trên sự phản ứng ở giai đoạn mô sẹo, giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non…………………………………………………. 43 3.3. Tạo vật liệu khởi đầu cho chọn dòng chịu hạn ở các giống lạc bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro..................................................................... ................................... 45 3.3.1 Kết quả sàng lọc dòng tế bào chịu hạn bằng kỹ thuật thổi khô, tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh............................................................................................... ......... 45 3.3.2. Phân tích mức độ biến động di truyền một số đặc điểm nông học quần thể R0 ............................................................................................................................. ......... 45 3.3.3. Nhận xét về chọn dòng tế bào chịu mất nước và đặc điểm nông học quần thể R0 ............................................................................................................................. ... 50 3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN genome của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước......................................................................................................... 51 3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số 51 3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 52 3.4.3. Nhận xét về sự đa hình ADN của một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................................................... 60 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ............................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Trang Bảng 2.1. Trình tự các nucleotit của 10 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu......... 21 Bảng 3.1. Hàm lượng protein, lipit của các giống lạc nghiên cứu ......................... 22 Bảng 3.2. Hoạt độ của - amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý bởi sorbitol 5%................................................................................................ 24 Bảng 3.3. Hàm lượng đường tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm.... 26 Bảng 3.4. Tương quan giữa hoạt độ của - amylase và hàm lượng đường ở giai đoạn hạt nảy mầm................................................................................................ 27 Bảng 3.5. Hoạt độ của protease trong các giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 5%.............................................................................................................. 28 Bảng 3.6. Hàm lượng protein tan của các giống nghiên cứu ở giai đoạn nảy mầm... 30 Bảng 3.7. Tương quan giữa hoạt độ của enzyme protease và hàm lượng protein ở giai đoạn hạt nảy mầm.............................................................................. 31 Bảng 3.8. Khối lượng tươi, khô của rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn ......................... 32 Bảng 3.9. Khối lượng tươi, khô của thân lá cây non 3 lá sau khi xử lý hạn ................. 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Bảng 3.10. Tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối của 6 giống lạc ……………………..……………………………………………. 35 Bảng 3.11. Biến độ ều kiện hạn nhân tạo ................................................................................................ 36 Bảng 3.12. Biến độ ều kiện hạn nhân tạo ............................................................................................................... 37 Bảng 3.13. Tương quan giữa hàm lượng proline và chỉ số chịu hạn............................ 38 Bảng 3.14. Độ mất nước của mô sẹo phôi lạc (%)...................................................... 40 Bảng 3.15. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau xử lý mất nước (%)……………………… 41 Bảng 3.16. Khả năng tái sinh của mô sẹo sống sót sau xử lý thổi khô (%)................. 42 Bảng 3.17 Hệ số khác nhau về sự biểu hiện kiểu hình của các giống lạc…………... 44 Bảng 3.18. Mức độ biến động di truyền quần thể R0 giống lạc LCB ................................. 46 Bảng 3.19. Độ sạch và hàm lượng ADN của các mẫu lạc nghiên cứu ............................. 52 Bảng 3.20. Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản của các mẫu lạc khi phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên................................................................................ 53 Bảng 3.21. Phân tích đa hình về phân đoạn ADN được nhân bản với 10 mồi ngẫu nhiên....................................................................... ................................... 54 Bảng 3.22. Giá trị tương quan kiểu hình (r) theo 3 cách tính về hệ số tương đồng..... 56 Bảng 3.23. Hệ số sai khác di truyền của các dòng và giống gốc.................................. 57 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Định tính hoạt độ - amylase của giống L24 và LTB ở giai đoạn hạt nảy mầm 1, 3, 5, 7 ngày ....................................................................... 25 Hình 3.2. Biến động hàm lượng đường tan của các giống ở giai đoạn nảy mầm ........................................................................................................ 26 Hình 3.3. Định tính hoạt độ protease của giống L24 và LTB ở giai đoạn hạt nảy mầm................................................................................................. 29 Hình 3.4 Biến động hàm lượng protein của các giống lạc ở giai đoạn nảy mầm….. 30 Hình 3.5. Đồ thị hình rada thể hiện khả năng chịu hạn của các giống lạc ở giai đoạn cây non.............................................................................. 35 Hình 3.6. Hàm lượng proline ở thân và lá trong điều kiện hạn nhân tạo.......... 36 Hình 3.7. Hàm lượng proline ở rễ của các giống lạc nghiên cứu trong điều kiện hạn nhân tạo............................................................................. 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Hình 3.8. Độ mất nước của mô sẹo phôi lạc khi xử lý thổi khô (%)............... 40 Hình 3.9. Tỷ lệ sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô (%)…………… 42 Hình 3.10 Sơ đồ mô tả quan hệ giữa các giống lạc dựa trên sự biểu hiện kiểu hình của 72 tính trạng........................................................................ 44 Hình 3.11. Một số hình ảnh về biến dị quả của các dòng chọn lọc từ giống LBK .................................................................................................... 49 Hình 3.12. Một số hình ảnh các dòng tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước giống LCB ngoài đồng ruộng.............................................. 50 Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi DTN15 và DTN19............................................................................ 55 Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc với mồi USP31và UPH04…………………………………………………. 55 Hình 3.15 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các dòng chọn lọc và giống gốc................................................................................ 58 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid ABA Axit abscisic ADN Axit deoxyribonucleic ASTT Áp suất thẩm thấu bp Base paire (Cặp bazo) BAP 6 – Benzyl Amino Purin Cs Cộng sự ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ ĐVMS Đơn vị mô sẹo HSPL Hệ số pha loãng kb Kilobase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 LEA Late Embryogenesis Abundant Protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi) MS Murashige – Skoog NAA Naphthyl Acetic Acid PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphism Information Content PP Pellagra Preventive (Vitamin PP) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Đa hình các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên) TAE Tris acetate EDTA TGXL Thời gian xử lý

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfLV08_SPSH_NTG.pdf
Tài liệu liên quan