Phát hiện đột biến mất đoạn gen gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker bằng kỹ thuật MLPA

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 1 PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN MẤT ĐOẠN GEN GÂY BỆNH LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE VÀ BECKER BẰNG KỸ THUẬT MLPA Nguyễn Khắc Hân Hoan*, Quách Thị Hoàng Oanh*, Phạm Ngọc Khôi**, Nguyễn Thị Phương Mai***, Ngô Diễm Ngọc***, Trần Vân Khánh**** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh DMD và BMD là bệnh di truyền thần kinh cơ do đột biến gen DMD. Hơn 65% trường hợp là đột biến mất hoặc lập đoạn gen. Kỹ thuật MLPA gần đây được cho là chẩn đoán mất đoạn gen rất hiệu quả. Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật MLPA trong phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD. Phương pháp: 18 mẫu DNA của bệnh nhân nam đã chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD và đã phát hiện đột biến mất đoạn gen bằng multiplex PCR. Được khảo sát 79 exon trên gen DMD bằng kit Salsa MLPA P034A2 và P035A2, điện di mao quản bằng CEQ 8000 và phân tích tự động bằng phần mềm Gene Marker. Kết quả: MLPA cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến,khảo sát được hết 79 exon của gen DMD, kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lặp lại cao. Mọi exon của gen DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ. Bộ 3 multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon và có những exon không được phát hiện. Kết luận: Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR. Từ khóa: Bệnh loạn dưỡng cơ, Duchenne, Becker, bệnh di truyền, đột biến gen, exon, kỹ thuật PCR, kỹ thuật MLPA. ABSTRACT MLPA IN DETECTION OF DELETION MUTATIONS CAUSING DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY Nguyen Khac Han Hoan, Quach Thi Hoang Oanh, Pham Ngoc Khoi, Nguyen Thi Phuong Mai, Ngo Diem Ngoc, Tran Van Khanh* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 4 - 2010: 53 - 60 Background: DMD and BMD are genetic disorders caused by DMD mutations. More than 65% of cases are deletion or duplication mutation. Recently, MLPA is described as an effective method to dectect these mutations. Objective: Evaluate the effectiveness of MLPA in detecting DMD gene deletion mutations. Method: 15 DNA samples of male affected with DMD/BMD detected with deletion mutations by multiplex PCR are tested for 79 exons with Salsa MLPA P034A2 và P035A2 kit, capillary electrophoresed with CEQ 8000 and automated analysis with Gene Marker software. Results: MLPA allows to detect the size of DNA fragment lost, the technique is easy, visual, rapid and reproducible. All 79 deleted exons are present in electropherograms. Set of 3 multiplex PCR only detects 25 exons and some exons cannot be found by this set. Conclusion: MLPA helps to rapid detection all deletions of DMD gene and is prominent to multiplex PCR. * Khoa Di truyền y học – Bệnh viện Từ Dũ, ** Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Nông Lâm TPHCM, *** Khoa Di truyền Tế bào và Phân tử – Bệnh viện Nhi Trung Ương, **** Đại học Y Hà nội Tác giả liên lạc: BS Quách Thị Hoàng Oanh, ĐT: 084-913833666, Email: oanhqch@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 2 Key word: Muscular dystrophy, Duchenne, Becker, genetic disorder, mutation, exon, PCR, MLPA. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) và bệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là bệnh di truyền thần kinh cơ phổ biến nhất, với xuất độ khoảng 1/3.500 trẻ trai sinh sống(7). Bệnh do đột biến gen dystrophin (gen DMD) gây ra. Đây là gen lớn nhất ở người nằm dài 2400kb ở vị trí Xp21.2, gồm 79 exon mã hóa 14 kb mRNA(1,8,15). Thông tin chi tiết về gen được phổ biến tại www.dmd.nl. Bệnh nhân DMD thường bị nhược cơ xuất hiện sớm từ 2 – 3 tuổi, tiến triển nhanh, mất khả năng đi lại và chết ở lứa tuổi 20 do vì tổn thương cơ tim và rối loạn hô hấp. Bệnh nhân BMD biểu hiện bệnh nhẹ hơn, tiến triển chậm và có cuộc sống kéo dài. Tuy nhiên chất lượng cuộc sống thường kém(7). Hơn 65% trường hợp bệnh DMD và BMD là do đột biến mất đoạn gen hoặc lập đoạn gen dystrophin gây ra(2,10,17). Các loại đột biến khác gồm có mất vài nucleotid, đột biến điểm và chuyển đoạn. Hầu hết các đột biến mất đoạn tập trung chủ yếu ở hai vùng nóng (hot spot) ở đầu 5’ (exon 3-20) và vùng trung tâm (exon 44- 55)(3,4,7). Tuy nhiên không có sự tương quan giữa kích thước của đoạn gen bị mất với mức độ biểu hiện bệnh. Phát hiện đột biến gen gây bệnh có ý nghĩa rất lớn nếu áp dụng vào giai đoạn trước sinh. Trước đây kỹ thuật thường được sử dụng là Southern blot. Tuy nhiên đây là kỹ thuật đòi hỏi tốn rất nhiều công và thời gian. Để thể phát hiện 79 exon phải lai các hỗn hợp probe 7 – 8 lần. Về sau kỹ thuật multiplex PCR được Chamberlain phát triển thành phương tiện chẩn đoán nhanh hơn(2). Kỹ thuật realtime PCR gần đây cũng được phát triển, tuy nhiên còn nhiều hạn chế(11). Tại Việt Nam, phát hiện các đột biến mất đoạn thường được dựa vào kỹ thuật đơn PCR(12,13) hoặc kỹ thuật multiplex PCR(14). Gần đây, kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời với khả năng khuếch đại cùng lúc đến 45 vị trí DNA đích khác nhau trong một phản ứng(18,19). Mỗi probe MLPA gồm 2 đoạn oligonucleotide lai với trình tự DNA đích tại vị trí liền kề với nhau, dài 22-43 nucleotide và một PCR primer xuôi hoặc ngược giống nhau ở tất cả các probe. Để phân biệt sản phẩm khuyếch đại, các probe còn chứa một đoạn DNA gắn chèn không tham gia vào lai có kích thước thay đổi (19–364 nt). Sau khi lai qua đêm với trình tự DNA đích, 2 đoạn oligonucleotide của mỗi probe sẽ nối ghép (ligation) với nhau. Sản phẩm nối có cả primer xuôi và ngược và được khuếch đại bằng PCR. Số lượng tương đối của mỗi sản phẩm PCR sẽ tỉ lệ với số bản sao của trình tự đích trong mẫu khảo sát. Kích thước khác nhau của các sản phẩm sẽ được nhận biết bằng hệ thống giải trình mao quản tự động và đỉnh của mỗi sản phẩm sẽ được định lượng(18,19). Kỹ thuật đã được ứng dụng vào chẩn đoán đột biến mất đoạn gây DMD/BMD rất hiệu quả(18). Tuy nhiên đến nay Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về kỹ thuật này. Vì thế, chúng tôi thực hiện thử nghiệm xác định đột biến mất đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh hiệu quả với kỹ thuật multiplex PCR. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá hiệu quả phát hiện đột biến mất đoạn gen DMD bằng kỹ thuật MLPA và so sánh với kỹ thuật multiplex PCR trên các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker tại Bệnh viện Từ Dũ. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm là 3ml máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA. Đối tượng là 15 bệnh nhân nam được chẩn đoán lâm sàng là bệnh DMD/BMD. Ly trích DNA từ mẫu bệnh phẩm: DNA được ly trích từ tế bào bạch cầu máu ngoại vi bằng phương pháp kết tủa và ly tâm qua cột lọc với bộ QiaAmp DNA blood mini kit (Qiagen). DNA sau khi cô lập được hòa tan trong dung dịch Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 3 Tris-HCl 10mM (pH 9,0). Các mẫu DNA đều được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy Biophotometter plus (Eppendorf) ở bước sóng 260/280nm và lưu trữ ở 4oC trước khi chẩn đoán và -300C sau khi phân tích. Kỹ thuật multiplex PCR phát hiện đột biến mất đoạn. Kỹ thuật multiplex PCR được thực hiện tại Bệnh viện Nhi Trung Ương. Ba bộ multiplex PCR A, B và C được sử dụng để phát hiện mất đoạn của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng hot spot của gen với trình tự mồi, điều kiện phản ứng và kích thước sản phẩm khuếch đại được thiết kế theo Chamberlain và cộng sự (bảng 1)(2). Sản phẩm PCR được điện di trên gel Nussieve agarose 3% trong dung dịch đệm TBE 1x bằng máy điện di Mupid Exu với điện thế 120V trong 30’, nhuộm với dung dịch ethidium bromide 0,5ug/ml trong 20’ và chụp hình bằng tia UV với máy Gel Doc XR (BioRad) (hình 1). Các phản ứng PCR luôn kèm theo đối chứng dương tính, âm tính (wild type) song song với mẫu cần chẩn đoán. Bảng 1: Kích thước (bp) của các 25 exon được khuếch đại trong 3 bộ multiplex PCR (2)). Multiplex A Multiplex B Mutiplex C Exon Kích thước Exon Kích thước Exon Kích thước 45 547 Pm 535 49 439 48 506 3 410 Pb 332 19 459 43 357 16 290 17 416 50 271 41 270 51 388 13 238 32 253 8 360 6 202 42 195 12 331 47 181 34 171 44 268 60 139 4 196 52 113 Hình 1: Kết quả phát hiện đột biến mất đoạn bằng 3 bộ multiplex A, B và C với thang 100bp. Wt và m là chứng wildtype và người nam bị đột biến. 29 là mẫu 08029 bị mất các exon: 3,4,6,8,12,13. 30 là mẫu 08030 bị mất các exon: 47, 48, 49, 50, 51, 52. 31 là mẫu 08031 bị mất các exon 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34. Kỹ thuật MLPA. Chúng tôi sử dụng bộ kit Salsa MLPA do MRC-Holland, Amsterdam, Hà Lan sản xuất có chứa 80 đoạn dò cho 79 exon đích và exon DP427c (5,6). 80 probe này đưa chia đều vào 2 hỗn hợp probe P034A2 và P035A2. Ngoài ra, mỗi kit còn chứa 5 đoạn dò kiểm chứng (bảng 2). Kỹ thuật MLPA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 50 – 200ng DNA của mẫu khảo sát pha loãng trong 5ul TE được biến tính ở 98°C x 5’, làm lạnh trên đá rồi trộn với 3ul hỗn hợp probe và MLPA buffer. Hỗn hợp DNA và probe này sau đó được ủ lai ở 95°C x 1’ và 60°C x 16 giờ hoặc qua đêm. Phản ứng nối ghép sau lai được thực hiện với 32ul hỗn hợp Ligase-65 và buffer ở 54°C x 15’ và bất hoạt ở 98°C x 5’. Bảng 2: Kích thước đoạn dò (bp) đặc hiệu các exon của kit Salsa MLPA P034 và P035. Kích thước ñoạn dò DMD exon Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation Kích thước ñoạn dò DMD exon Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation 482* Exon DP427c CAGTAATAGA-ATGCTTTCAG 218 Exon 43 ATTGCAAAGT-GCAACGCCTG 138* Exon 1 CCCCCTACAG-GACTCAGATC 250 Exon 44 ACAGTTTCTC-AGAAAGACAC 170* Exon 2 CAAAAGAAAA-CATTCACAAA 290 Exon 45 AGATGCCAGT-ATTCTACAGG 210 Exon 3 CTCTTCAGTG-ACCTACAGGA 322 Exon 46 CATTGCTAGT-ATCCCACTTG 242 Exon 4 CCCTGAACAA-TGTCAACAAG 362 Exon 47 TCAAACAATT-AAATGAAACT 282 Exon 5 AGATGGAAAT-CATAAACTGA 394 Exon 48 GTTAAATCAT-CTGCTGCTGT 314 Exon 6 CCAACAGTGA-AAAGATTCTC 434 Exon 49 AAGAGATTTT-GTCTAAAGGG 354 Exon 7 GGAATAGTGT-GGTTTGCCAG 466 Exon 50 TAAACCGTTT-ACTTCAAGAG 386 Exon 8 TTGAAGCCAT-CCAGGAAGTG 146 Exon 51 TCTGGCAGAT-TTCAACCGGG Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 4 Kích thước ñoạn dò DMD exon Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation Kích thước ñoạn dò DMD exon Trình tự 20 nucleotid quanh vị trí ligation 426 Exon 9 ACAGGGATAT-GAGAGAACTT 178* Exon 52 AGCCTCTTGA-TTGCTGGTCT 458 Exon 10 AGACAAGTCA-TTTGGCAGTT 218 Exon 53 GAGCAGGTCT-TAGGACAGGC 138 Exon 11 TTGACAGCCC-ATCAGGGCCG 250 Exon 54 GCAGACAAAT-GTAGATGTGG 170 Exon 12 AGCCTCTTGG-ACCTGATCTT 290 Exon 55 ACTCATAGAT-TACTGCAACA 210 Exon 13 GGTAGTTGAT-GAATCTAGTG 322 Exon 56 TCCTGTTACA-AAGACGTTTG 242 Exon 14 GGGCAAACAT-CTGTAGATGG 362 Exon 57 GAAAGATGAT-GAATTAAGCC 282 Exon 15 TGGCTTTCAG-AAAAAGAAGA 394 Exon 58 AGACTGTACG-AATATTTCTG 314 Exon 16 GCAATCCATG-GGCAAACTGT 434 Exon 59 GATGAGACCC-TTGAAAGACT 354 Exon 17 AACAGATCCT-GGTAAAGCAT 466 Exon 60 GCCTCTGAAA-GAGAACGTGA 386 Exon 18 AAGCTGTGTT-GCAGAGTCCT 162 Exon 61 GCAGCTGCAT-GAAGCCCAC 426 Exon 19 AAGCTGAGAA-GTTCAGAAAA 194 Exon 62 TCCCTGGGAG-AGAGCCATCT 458 Exon 20 GTGGATCGAA-TTCTGCCAGT 234* Exon 63 AAACAACTTG-CTGGGACCAT 154 Exon 21 AAGGACAAGG-ACCCATGTTC 266* Exon 64 CTGCAGTCTT-CGGAGTTTCA 186 Exon 22 AGGAGACCAT-GAGTGCCATC 306 Exon 65 GCTGCATGTG-ATGCCTTGGA 226 Exon 23 GGCCTATACT-ATCTCAGCAC 338 Exon 66 CTGTCTTTTA-AAACTGGCAT 258 Exon 24 GGCCTGCCCT-TGGGGATTCA 378* Exon 67 ACACTTGGCT-CAATGTTACT 298 Exon 25 CAGAAGATAA-AGAATGAAGC 410 Exon 68 GACTGGATGA-GACTGGAACC 330 Exon 26 GTAAGCCTCC-AGAAAGATCT 450 Exon 69 TTTTTTTCTG-GTCGAGTTGC 370 Exon 27 TGAGTCTGTA-AATAGTGTCA 482 Exon 70 CCCCGAATGG-GCTACCTGCC 402 Exon 28 GGCATGAGTT-ATTGTCATAC 162* Exon 71 TCTGATCAAC-TTCTGGCCAG 442 Exon 29 ACAGACCCTA-ACAGATGGCG 194 Exon 72 CCTCAGCTTT-CACACGATGA 474 Exon 30 AAGTTGCTTG-AACAGAGCAT 234* Exon 73 TATCATTTAG-ATAAGATCCA 154 Exon 31 GGAGGCTGCC-CAAAGAGTCC 266 Exon 74 CCAGATCTTG-ATTTCCTTAG 186 Exon 32 CTGCATTGGA-AACAAAGAGT 306 Exon 75 TGAGCTCATT-GCTGAGGCCA 226 Exon 33 TCTGAAGTGG-AAATGGTGAT 338 Exon 76 ACCTCTCTAC-AGAGGTCCGA 258 Exon 34 GAAAGGAAAT-GAATGTCTTG 378 Exon 77 CCAGGACACA-AGCACAGGGT 298 Exon 35 CCTGAAGAGT-ATCACAGAGG 410* Exon 78 TGGAAAGCCA-ATGAGAGAGG 330 Exon 36 ATCACAAAGT-GGATCATTCA 450 Exon 79 CCACATGGCA-GATGATTTGG 370* Exon 37 TGGCTGCAAA-TCGATGGTTG 64-70-76-82 Chứng ñịnh lượng DNA, xuất hiện DNA < 100 ng 402 Exon 38 CTGAAATTCA-GCAGGGGGTG 88-92-96 Chứng DNA, tín hiệu thấp khi biến tính không hoàn toàn 442 Exon 39 TGCAAAGAGG-AGACAACTTA 100 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể X 474 Exon 40 AAGGCTCTAG-AAATTTCTCA 105 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể Y 146 Exon 41 GGGCTTGTCT-GAGGATGGG 118 Chứng ñặc hiệu nhiễm sắc thể Y, chỉ có ở P034 178 Exon 42 CGATGATGGT-GATGACTGAA * là các probe đặc hiệu trình tự chuỗi DNA ngược hoặc có một phần trình tự intron. Chữ đứng là kit P034, chữ in nghiêng là kit P035. Cả 2 kit đều có đoạn dò chứng. 10µl sản phẩm nối ghép được trộn kỹ với 30µl PCR buffer và đặt vào máy luân nhiệt ở 60°C. Liền ngay sau đó 10ul hỗn hợp phản ứng có chứa dNTPs, Taq polymerase và primer (primer xuôi: 5’-Cy5- GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3’, primer ngược: 5’-GTGCCAGCAAGATCCAATC TAGA-3’). được thêm vào. PCR được thực hiện ở điều kiện luân nhiệt: (950C x 30” + 600C x 30” + 720C x 60”) x 35 chu kỳ + 720C x 20’ và giữ ở 40C trên máy Master Cycler ProS (Eppendorf). Các đoạn dò nếu không được ghép nối với nhau thì chỉ mang một primer cho nên không được khuếch đại. Sản phẩm sau khuếch đại được điện di phân tách đoạn trên hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) ở điều kiện: 2ul PCR + 0,5ul Beckman size standard 600 + 32ul sample loading solution; nhiệt độ mao quản 500C, biến tính 900C x 20’’; điện thế bơm mẫu vào 2kV x 30’’ và điện thế phân tách đoạn 4,8kV x 60’. Kích thước của mỗi Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 5 peak được xác định nhờ so sánh với thang kích thước và so sánh với mẫu chứng. Sau điện di, kết quả được xuất dưới dạng file.esd, rồi được phân tích tự động tìm đột biến bằng phần mềm Gene Marker version 1.85 (SoftGenetics). Kết quả phân tích được biểu thị dưới dạng biểu đồ sóng (electropherogram) và dưới dạng bảng. Các vị trí gen bị mất đoạn ở cá thể nam (1 nhiễm sắc thể X) sẽ không có đỉnh tín hiệu xuất hiện. Hình 3 minh họa kết quả chẩn đoán mẫu 08029. KẾT QUẢ Từ ngày 1/3/2009 đến 31/5/2009 chúng tôi đã thực hiện chẩn đoán cho 15 mẫu và tất cả đều được phát hiện là mất đoạn bằng cả hai kỹ thuật. Số exon được phát hiện bị mất trong các mẫu rất đa dạng. Sử dụng kỹ thuật bộ 3 multiplex PCR, có 2 mẫu không phát hiện được mất đoạn, và mẫu mất nhiều nhất là 25 exon. Các band đặc hiệu cho exon khảo sát đều rõ. Với kỹ thuật MLPA, số lượng exon bị đột biến mất đoạn cũng rất thay đổi, ít nhất là 1 exon, nhiều nhất toàn bộ 79 exon của gen DMD. Kết quả phát hiện đột biến được nêu trong bảng 3. Bảng 3: Số exon được phát hiện bị mất trong 15 mẫu khảo sát. Multiplex PCR Mã số MLPA Exon phát hiện ñược Exon không khảo sát 08024 8 – 12 8, 12 9, 10, 11 08026 3 – 7 3, 4, 6 5, 7 08029 2 – 13 3, 4, 6, 8, 12, 13 2, 5, 7, 9, 10, 11, 08030 46 – 52 47, 48, 49, 50, 51, 52 46, 08031 3 – 34 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 21, 33 07025 3 – 7 3, 4, 6 5, 7 06058 48 – 50 48, 49, 50 - 05020 45 – 52 45, 47, 48, 49, 50, 51,52 46 05060 3 – 29 32, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 07009 31 – 40 32, 34, 41, 42, 43 31, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40 07047 3 – 17 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17 5, 7, 9, 10, 11, 14, 15 10013 45-53 45, 47, 48, 49, 50,52 46, 51, 53 10016 52 52 - 10017 61-67 - 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 10021 1-79 3, 4, 6, 8, 12, 13, 16, 17, 19, 32, 34,41,42, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51,52, 60 Các exon còn lại Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 6 Hình 3: Kết quả phân tích trên phần mềm GeneMarker của mẫu 08029. Hình trên là kit P034, hình dưới là kit P035. Bệnh nhân bị mất đoạn từ exon 2 đến exon 13. BÀN LUẬN Cả hai phương pháp đều có khả năng phát hiện chính xác các exon bị mất đoạn của gen DMD và phù hợp với chẩn đoán trên bệnh cảnh lâm sàng. Trong 15 mẫu khảo sát, có 3 mẫu bị mất đoạn gen khá lớn, vượt ra ngoài vùng nóng đầu 5’; 1 mẫu mất đoạn không nằm trước vùng nóng trung tâm. Kết quả phù hợp với y văn cho rằng gen DMD là gen rất dài và dễ bị đứt gẫy trong quá trình phân chia tế bào(1,11,16). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 7 Kỹ thuật multiplex PCR biểu thị các exon bị mất đoạn bằng sự vắng mặt của band tương ứng trên gel agarose. Người đọc sẽ so band của mẫu khảo sát với band của chứng wild type để xác định sự hiện diện của đột biến. Tuy nhiên multiplex PCR là phương pháp định tính. Trường hợp cá thể nữ (46,XX) chỉ mang một gen DMD bị mất đoạn trong số các exon được khảo sát thì kỹ thuật này không phát hiện được. Do giới hạn về kỹ thuật multiplex, nên bộ 3 multiplex PCR chỉ khảo sát được 25 exon. Số exon khảo sát không liên tục, vì thế không thể kết luận được có sự hiện diện hay không của những exon nằm giữa 2 exon được phát hiện mất. 10 trong 15 mẫu khảo sát đều có các exon bị mất ngoài khả năng phát hiện của multiplex PCR. Multiplex PCR là kỹ thuật hiện nay được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên kỹ thuật này còn có nhược điểm khó tối ưu cho nhiều cặp primer vì các primer có điều kiện phản ứng rất khác nhau. Một thay đổi nhỏ về điều kiện cũng làm cho phản ứng bị thất bại. MLPA cho phép phát hiện bất thường về liều gen trong một giới hạn khá rộng. Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc định lượng so sánh các probe được khuếch đại bằng PCR với một cặp primer duy nhất. Vì thế MLPA loại bỏ được các giới hạn trong tối ưu multiplex PCR và kiểm tra được liều gen ở nhiều vị trí đích khác nhau một cách dễ dàng hơn. Với bộ kit Salsa MLPA P034A2 và P035A2, toàn bộ các exon của gen DMD được khảo sát trong cùng một lần thử nghiệm, trên 2 ống phản ứng khác nhau với cùng một điều kiện luân nhiệt. Kỹ thuật phân tích dễ dàng, trực quan, nhanh và có độ lập lại cao. Mọi exon của gen DMD bị mất đều được khẳng định trên biểu đồ. Thời gian thao tác thực hiện kỹ thuật ngắn. Tuy nhiên, kỹ thuật đòi hỏi phải lai đoạn dò ít nhất 16 giờ hoặc qua đêm. Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu đã nêu trước đây(10,11,18,19). MLPA còn cho phép xác định chính xác kích thước của đoạn DNA bị đột biến. Điều này rất hữu ích khi xác định biến đổi của khung dịch mã để suy đoán liên quan kiểu gen – kiểu hình. Các đột biến gây lệch khung dịch mã thường dẫn đến bệnh DMD. Nếu khung dịch mã không thay đổi thì bệnh nhân thường có kiểu hình bệnh BMD nhẹ hơn. Tuy nhiên MLPA có thể cho kết quả dương tính giả nếu chỉ có một probe bị thay đổi tín hiệu. Điều này có thể xảy ra nếu như tại vị trí lai và nối ghép của probe, DNA đích bị đột biến điểm hoặc bị một SNP. Đây là nhược điểm chính của MLPA. Vì thế cần làm PCR để xác định lại nếu kết quả MLPA cho thấy chỉ có 1 probe bị thay đổi tín hiệu. Ngoài ra, kỹ thuật MLPA còn có các đoạn dò đặc hiệu nhiễm sắc thể X và Y. Đây là ưu điểm lớn giúp xác định giới tính của mẫu khảo sát hữu ích cho việc tiên lượng kiểu hình của bệnh nhân và thai sau sinh(19,20). Ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh các trường hợp mất đoạn gen cho thai sẽ dễ dàng hơn và giúp giúp cho việc phòng bệnh chủ động bằng tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh trong tương lai giảm được gánh nặng cho xã hội. KẾT LUẬN Bệnh loạn dưỡng cơ Duchene và Becker là rối loạn thần kinh cơ đơn gen phổ biến nhất ở nam giới. Kỹ thuật MLPA giúp phát hiện nhanh chóng, toàn diện các đột biến mất đoạn gen DMD và ưu điểm vượt trội so với kỹ thuật multiplex PCR. Ứng dụng kỹ thuật MLPA vào chẩn đoán trước sinh hứa hẹn đạt hiệu quả cao. Cám ơn: Các đồng nghiệp tại Khoa Di truyền y học Bệnh viện Từ Dũ và Bệnh viện Nhi trung ương đã ủng hộ và giúp đỡ chúng tôi thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Beggs AH, Koenig M, Bobrow M, Bentley DR (1990). Detection of 98% of DMD/BMD gene deletion by polymerase chain reaction. Human Genetics, 86: 45–48. 2. Chamberlain JS, Gibbs RA, Raniel JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988). Deletion screening of the Duchenne muscular dytrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Research, 16: 11141–11156. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 8 3. Elhawary NA, Rabah MS, Nemat H (2004). Frameshift deletion mechanisms in Egyptian Duchenne and Becker muscular dystrophy families. Molecular and Cells, 18: 141– 149. 4. Forrest SM, Smith TJ, Cross GS et al. (1987). Effective strantergy for prenatal prediction of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Lancet, 2: 1294–1296. 5. Gatta V et al (2005). Identification of deletions and duplications of the DMD gene in affected males and carrier females by multiple ligation probe amplification (MLPA). Hum Genet. Jun;117(1):92-98. 6. Janssen B et al. (2005). MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics.; 6(1):29-35. 7. Kneppers ALJ, Ginjaar IB, Bakker E (2004). Duchenne and Becker muscular dystrophy. In: Rob Elles & Roger Mountford (eds). Molecular diagnosis of genetic diseases, 2nd edition, pp311-342. Humana Press, New Jersey. 8. Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C, Kunkel LM (1987). Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophiy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell. 50: 509–517. 9. Kunkel, L. M. et al (1991). Searching for dystrophin gene deletion in patients with atypical presentations. In: Lindsten J, Pettersson U (eds). Etiology of human disease at the DNA level, pp 51–60. Ravel, New York. 10. Lalic T et al. (2005). Deletion & duplication screening in the DMD gene using MLPA. Eur J Hum Genet.13(11):1231-4. 11. Lai KK et al. (2006). Detecting exon deletions and duplications of the DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Clin Biochem. 2006 Jan 11. 12. Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thanh Liêm, Vũ Chí Dũng, Nguyễn Thu Nhạn, Bùi Phương Thảo (2006). Đột biến mất đoạn gene Dystrophin của các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/ Becker Việt Nam. Tạp chí Nhi khoa, tập 14 - số đặc biệt: 202–208. 13. Nguyễn Thị Phượng, Vũ Chí Dũng (2002). Kết quả bước đầu phát hiện đột biến gien gây bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Tạp chí Nhi khoa, tập 10, số đặc biệt chào mừng 100 năm trường Đại học Y Hà Nội và hội nghị khoa học toàn quốc. 14. Nguyễn Thị Phương Mai, Vũ Chí Dũng, Hoàng Thị Thanh Mộc và cs (2007). Áp dụng kỹ thuật multiplex PCR thay thế PCR cổ điển trong phân tích gen dystrophin ở các bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne. Hội nghị nhi khoa Việt Úc, Bệnh viện Nhi Đồng 1 TPHCM, 111-111. 15. Prior TW, Bridgeman SJ (2005). Experience and Strategy for the Molecular testing of Duchenne Muscular Dytrophy. Journal of Molecular Diagnostics, 7:317-326. 16. Roberts RG, Bobrow M, Bentley DR (1992). Point mutations in the dystrophin gene. Proceding National Academy of Science of USA. 89: 2331–2335. 17. Roberts RG, Coffey AJ, Bobrow M, Bentley DR (1993). Exon structure of the human dystrophin gene. Genomics, 51: 919– 928. 18. Schwartz M and Duno M (2005). Multiplex ligation- dependent probe amplification is superior for detecting deletions/duplications in Duchenne muscular dystrophy. Clin Genet.; 67(2):189-91. 19. Schwartz M and Duno M (2004). Improved molecular diagnosis of dystrophin gene mutations using the multiplex ligation-dependent probe amplification method. Genet Test.; 8(4):361-7. 20. White SJ et al. (2006). Copy number variation in the genome; the human DMD gene as an example. Cytogenetic and Genome Research, 115: 240-6. Review. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 9 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Nhi Khoa Mở Rộng BV. Nhi Đồng 2 – Lần XIX - Năm 2010 10