Biến đổi hình thái noãn và kết quả thụ tinh trong ống nghiệm của noãn sau đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 30 BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI NOÃN VÀ KẾT QUẢ THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM CỦA NOÃN SAU ĐÔNG LẠNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY TINH HÓA Lê Thanh Huyền*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* và CS TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá biến đổi hình thái noãn và khả năng phát triển của noãn sau rã đông (tỷ lệ sống, khả năng thụ tinh, chất lượng phôi trước chuyển phôi, tỷ lệ có thai, tỷ lệ làm tổ) bằng phương pháp thuỷ tinh hoá. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 211 noãn trưởng thành được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đã rã đông (tương ứng với 34 chu kỳ có noãn đông lạnh và 34 chu kỳ rã đông - chuyển phôi) tại Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y. Kết quả: hình thái noãn về đường kính bào tương và độ dày màng trong suốt sau rã đông không thay đổi so với trước đông lạnh. Thoi vô sắc quan sát thấy ở 100% noãn rã đông sau 3 giờ nuôi cấy. Tỷ lệ noãn sống sau rã đông 89,09%, tỷ lệ thụ tinh 71,28%, tỷ lệ phôi tốt ngày 3 là 38,71%, tỷ lệ có thai lâm sàng 29,41%, tỷ lệ làm tổ 12,94%. Kết luận: đông lạnh thủy tinh hóa giúp bảo quản tốt noãn người, noãn sau rã đông có tiềm năng phát triển cao. * Từ khóa: Thụ tinh trong ống nghiệm; Đông lạnh thủy tinh hóa. Morphological Changes and Outcomes of IVF of Human Oocytes Cryopreserved by Vitrification Summary Objectives: To evaluate morphological changes and developmental competence of oocyte after vitrification (i.e. survival rate, fertilization ability, embryo quality, clinical pregnancy rate, implantation rate) by using vitrification method. Subjects and methods: 211 mature oocytes had vitrified and thawed in Military Morphological Institute of Vietnam Military Medical University. Results: Vitrified oocyte did not change in terms of morphology, repolymerization of the meiotic spindle occurs in 100% of the oocytes surviving cryopreservation after 3 hours. Observed survival rate was 89.09%, fertilization rate of vitrified oocyte was 71.28%, good quality embryo on day 3 was 38.71%, clinical pregnancy rate was 29.41% and implantation rate was 12.94%. Conclusion: Vitrification is an efficient method for human oocyte cryopreservation, vitrified - thawed oocytes have good quality and highly developmental competence. * Keywords: In vitro vitrification; Fertification. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, trữ lạnh được xem là kỹ thuật không thể thiếu trong điều trị vô sinh bằng tụ tinh trong ống nghiệm (TTTON). Trong khi trữ lạnh phôi giúp tăng tính an toàn và hiệu quả của một chu kỳ kích thích buồng trứng làm TTTON thì trữ lạnh giao tử có vai trò * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Thanh Huyền (lethanhhuyenk53@gmail.com) Ngày nhận bài: 26/04/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 21/06/2018 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 31 quan trọng trong vấn đề bảo tồn khả năng sinh sản của con người cũng như có nhiều tiềm năng ứng dụng rộng rãi khác. Trữ lạnh noãn được xem là giải pháp hữu hiệu để bảo tồn khả năng sinh sản cho phụ nữ độc thân hoặc phụ nữ mắc các bệnh lý ác tính, là cơ sở để thành lập ngân hàng noãn của người cho. Trong một số trường hợp đặc biệt, khi người chồng không lấy được tinh trùng hoặc mẫu tinh trùng không đạt tiêu chuẩn sau khi noãn đã được chọc hút, đông lạnh noãn là lựa chọn duy nhất để không bỏ noãn. Ngoài ra, trữ lạnh noãn còn giúp giảm tình trạng số lượng phôi dư thừa ngày càng gia tăng [2, 8]. Trên thế giới, trường hợp mang thai thành công đầu tiên từ noãn người trữ lạnh được Chen C và CS công bố năm 1986 [5], chỉ sau thành công của trữ lạnh phôi người một thời gian ngắn. Tuy nhiên, cho đến nay, so với đông lạnh phôi, hiệu quả của đông lạnh noãn vẫn còn gây nhiều tranh cãi. Việc trữ lạnh và rã đông noãn gặp nhiều khó khăn hơn so với tinh trùng và phôi. Đặc điểm cấu trúc khác biệt của noãn như kích thước tế bào và thể tích nước trong tế bào lớn, tốc độ khử nước chậm là những nguyên nhân chính khiến cho noãn rất dễ bị tổn thương trong quá trình làm lạnh và rã đông. Các tổn thương này sẽ ảnh hưởng đến khả năng sống, khả năng thụ tinh và năng lực phát triển của phôi được tạo thành. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu: Mô tả biến đổi hình thái cấu trúc noãn người sau đông lạnh và đánh giá kết quả TTTON của noãn sau rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. 211 noãn trưởng thành được đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa đã rã đông (tương ứng với 34 chu kỳ có noãn đông lạnh và 34 chu kỳ rã đông - chuyển phôi của bệnh nhân (BN)) tại Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y, thời gian từ tháng 8 - 2015 đến 12 - 2017. - Tiêu chuẩn lựa chọn: + Noãn được lấy vào thời điểm 34 - 36 giờ sau tiêm hCG. + Noãn ở giai đoạn MII có hình thái bình thường (theo Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi VINAGOFPA, 2012) [1]. - Tiêu chuẩn loại trừ: noãn ở các giai đoạn GV, MI và noãn bất thường. * Vật liệu, hóa chất: Sử dụng bộ môi trường đông lạnh và rã đông noãn/phôi (Hãng Kitazato, Nhật Bản). 2. Phương pháp nghiên cứu. * Đông lạnh và rã đông noãn: Áp dụng quy trình đông lạnh thủy tinh hóa theo phương pháp Cryotop của Masashige Kuwayama (2005): + Trước khi đông lạnh, tất cả noãn đều được xử lý bằng enzym hyaluronidase (Hyase, Vitrolife) để loại bỏ hết tế bào nang bao xung quanh. + Sau khi rã đông, nuôi cấy noãn trong môi trường IVF trong thời gian 3 giờ trước khi tiến hành kỹ thuật ICSI. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 32 * Xác định noãn sống: Sau khi rã đông, các noãn sống có màng trong suốt, màng tế bào còn nguyên vẹn, bào tương sáng màu, về hình thái không thấy có thay đổi so với trước khi đông lạnh. * Phân tích thoi vô sắc: Áp dụng theo phương pháp của Markus Montag (2006), sử dụng hệ thống Module polaraide - octax laser system của kính hiển vi Nikon TE2000: sau khi rã đông, tất cả noãn được theo dõi đánh giá xuất hiện thoi vô sắc trong bào tương noãn tại các thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ sau rã đông. * Phương pháp đánh giá hình thái phôi: Quan sát hình thái phôi bằng kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng đại 200 lần. Phôi ngày 3 (ngày chuyển phôi) được phân loại theo tiêu chuẩn Đồng thuận ALPHA (2011) và Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi VINAGOFPA (2012) [1], chia phôi thành 3 loại dựa vào đặc điểm số lượng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào và tỷ lệ mảnh vỡ bào tương so với thể tích toàn bộ phôi: - Phôi tốt: phôi có 7 - 8 phôi bào, kích thước phôi bào đồng đều (lệch nhau ≤ 20%), tỷ lệ mảnh vỡ bào tương < 10% thể tích phôi, không có phôi bào đa nhân. - Phôi trung bình: phôi có < 8 phôi bào, đa số phôi bào có kích thước đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương 10 - 25% thể tích của phôi, không có phôi bào đa nhân. - Phôi xấu: các phôi bào có kích thước không đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương > 25% thể tích phôi, có phôi bào đa nhân. * Xác định tỷ lệ có thai và tỷ lệ làm tổ ở các chu kỳ chuyển phôi từ noãn đông lạnh: BN sau khi chuyển phôi 14 ngày được hẹn đến Viện để thử lượng ß-hCG trong máu: + Có thai sinh hoá: sau chuyển phôi 14 ngày có nồng độ ß-hCG > 25 ng/ml. + Có thai lâm sàng: sau 4 - 5 tuần chuyển phôi, siêu âm thấy túi ối trong buồng tử cung. + Tỷ lệ làm tổ của phôi được tính bằng tổng số phôi làm tổ trên tổng số phôi chuyển vào tử cung. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Một số đặc điểm của các chu kỳ rã đông noãn (n = 34). Tuổi trung bình của BN 34,1 ± 5,9, nhiều nhất 47 tuổi, ít nhất 25 tuổi. Số năm vô sinh trung bình 5,9 ± 2,8, thời gian vô sinh ngắn nhất 2 năm, dài nhất 14 năm. Số noãn được rã đông trung bình tính trên mỗi BN là 6,2 ± 2,2, người có noãn được rã đông ít nhất là 4, trường hợp nhiều nhất là 14 noãn. Thời gian đông lạnh từ 3 - 15 tháng, trung bình 6,6 ± 3,5 tháng. 2. Tỷ lệ sống của noãn sau rã đông. Tổng số 211 noãn được rã đông, sau rã đông 188 noãn (89,09%) không thấy thay đổi hình thái so với trước khi đông lạnh; 23 noãn còn lại (10,91%) bị thoái hóa, bào tương có màu sẫm, có nhiều hạt thô, màng tế bào bị ly giải, không định rõ được ranh giới màng bào tương bên trong màng trong suốt. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 33 Ảnh 1: Noãn bào II của người trước khi đông lạnh. Ảnh 2: Noãn bào II của người sau khi rã đông còn sống. 3. So sánh thay đổi hình thái noãn trước và sau rã đông. Bảng 1: Thời điểm nghiên cứu Chỉ tiêu Trước đông (n = 188) Sau rã đông (n = 188) p Độ dày màng trong suốt trung bình (µm) 18,14 ± 3,06 18,20 ± 2,66 > 0,05 Đường kính noãn trung bình (µm) 116,58 ± 4,95 116,18 ± 5,36 > 0,05 Tất cả noãn đều được chụp ảnh trước khi đông lạnh và sau rã đông, sau đó đo độ dày màng trong suốt, đo đường kính bào tương noãn của 188 noãn sống sau rã đông. Kết quả cho thấy đường kính bào tương noãn và độ dày màng trong suốt của noãn trước đông lạnh và sau rã đông thay đổi không có ý nghĩa thống kê. Hình thái noãn hầu như không biến đổi sau khi đông lạnh. Trong số 211 noãn nghiên cứu, 182 noãn (86,2%) quan sát thấy thoi vô sắc trước đông lạnh; 29 noãn còn lại không quan sát thấy thoi vô sắc tại thời điểm đông lạnh. Sau rã đông, toàn bộ số noãn có thoi vô sắc (182 noãn), chỉ 6/29 noãn không có thoi vô sắc còn sống sau rã đông. 4. Sự xuất hiện thoi vô sắc của noãn còn sống sau rã đông (n = 188). Bảng 2: Nhóm nghiên cứu Thời gian Noãn nhìn thấy thoi vô sắc Noãn không nhìn thấy thoi vô sắc Sau rã đông 0 giờ 0/182 (0%) 188 Sau rã đông 1 giờ 45/182 (24.7%) 143 Sau rã đông 2 giờ 164/182 (90,1%) 24 Sau rã đông 3 giờ 182/182 (100%) 6 Tại thời điểm ngay sau rã đông, không quan sát thấy thoi vô sắc ở tất cả các noãn còn sống. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 34 5. So sánh vị trí thoi vô sắc của noãn trước đông lạnh và noãn sau rã đông. Bảng 3: Thời điểm nghiên cứu Góc giữa thể cực và thoi vô sắc Trước đông lạnh (n = 182) Sau rã đông (n = 182) 0 - 300 138/182 (75,8%) 130/182 (71,4%) 30 - 600 28/182 (15,3%) 33/182 (18,1%) 60 - 1200 12/182 (6,6%) 15/182 (8,2%) > 1200 4/182 (2,3%) 4/182 (2,3%) Phân tích vị trí giữa thể cực và thoi vô sắc của noãn sau rã đông so với trước đông lạnh cho thấy một tỷ lệ nhỏ noãn có thay đổi vị trí thể cực. Trước đông lạnh, 138 noãn có thoi vô sắc nằm ngay dưới và sát thể cực 1, 28 noãn có thoi vô sắc lệch so với thể cực 1 từ 30 - 600; 12 noãn có thoi vô sắc ở vị trí 60 - 1200 so với thể cực 1, 4 noãn có thoi vô sắc ở vị trí 120 - 1800. Tuy nhiên, sau rã đông, chỉ 130 noãn có thoi vô sắc ở vị trí 0 - 300. Tỷ lệ thoi ở vị trí 30 - 1200 tăng từ 21,9% lên 26,3%. 6. Kết quả thực hiện TTTON của noãn sau rã đông. Noãn thụ tinh bình thường: 134/188 (71,28%); noãn thụ tinh bất thường: 3/188 (1,6%); số phôi phân chia: 124/134 (92,5%); số phôi tốt ngày 3: 48/124 (38,71%); số phôi chuyển trung bình: 2,5, ít nhất 1 phôi, nhiều nhất 3 phôi; trong 34 kỳ chuyển phôi, 12 chu kỳ có thai sinh hóa 35,29%, 10 chu kỳ có thai lâm sàng (29,41%), trong đó 9 trường hợp một thai, 1 trường hợp hai thai và 1 trường hợp sảy thai (8,3%) ở tuần thứ 12; tỷ lệ làm tổ: 11/85 (12,94%). BÀN LUẬN Hiện nay, việc bảo quản lạnh noãn người chủ yếu thực hiện theo hai phương pháp đông lạnh hạ nhiệt độ chậm và thủy tinh hóa. Với phương pháp đông lạnh hạ nhiệt độ chậm, cố gắng giảm thiểu những tác động bất lợi đến tế bào bằng cách kiểm soát đặc tính lý sinh của quá trình đông lạnh như tốc độ làm lạnh và làm ấm, kết hợp với sử dụng chất bảo vệ đông lạnh thích hợp. Với quy trình đông lạnh hạ nhiệt độ chậm, tế bào bị khử nước thông qua quá trình cân bằng thẩm thấu khi hình thành đá ngoại bào. Trong khi đó, thủy tinh hóa được coi là “phương pháp đông lạnh không cân bằng”, phương pháp này sử dụng các chất bảo vệ đông lạnh có nồng độ rất cao, kết hợp với tốc độ làm lạnh cực nhanh khiến dung dịch có thể rắn hóa mà không trải qua hình thành tinh thể đá, giảm thiểu tổn thương đông lạnh cho tế bào. Một số báo cáo gần đây cho thấy tỷ lệ sống của noãn người đông lạnh ngày càng được nâng cao khi sử dụng phương pháp thủy tinh hóa. Bo và CS (2015) thủy tinh hóa 466 noãn người cho tỷ lệ sống sau rã đông đạt 86,69% [4]. Đặc biệt, Antinori M và CS (2007) công bố tỷ lệ sống lên đến 99,4% khi nghiên cứu trên 330 noãn đông lạnh bằng phương pháp T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 35 thủy tinh hóa [3]. Nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ noãn sống là 89,09%, tương đương nhiều nghiên cứu trên thế giới. Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình đông lạnh (đặc biệt là quá trình khử nước) đến hình thái noãn, chúng tôi tiến hành đo đường kính bào tương noãn và độ dày màng trong suốt các noãn còn sống sau rã đông, so sánh với trước khi đông lạnh. Kết quả cho thấy, sau rã đông, kích thước và hình dạng noãn khôi phục lại hoàn toàn so với trước đông lạnh (bảng 1). Tương tự kết quả của chúng tôi, Martínez-Burgos M (2011) [7] nghiên cứu trên 53 noãn được thủy tinh hóa nhận thấy, sau rã đông, tỷ lệ noãn khôi phục lại hoàn toàn thể tích ban đầu là 97,5%; trong khi ở nhóm noãn đông lạnh chậm, tỷ lệ khôi phục lại thể tích hoàn toàn 85,7%. Tác giả cho rằng, khả năng khôi phục lại thể tích nhanh hơn có thể là dấu hiệu cho thấy màng tế bào và bào tương noãn “khỏe mạnh” hơn. Thay đổi nhiệt độ trong quá trình trữ lạnh - rã đông có thể dẫn tới những thay đổi trong cấu trúc của thoi vô sắc noãn. Thoi vô sắc đóng vai trò quan trọng trong quá trình thụ tinh, bao gồm hoàn tất giảm phân, đẩy ra thể cực thứ hai, di chuyển tiền nhân và phân chia tiếp theo của hợp tử. Khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp, các phân tử tubulin sẽ giải trùng hợp, làm biến mất cấu trúc vi ống. Do đó, việc tái trùng hợp lại chính xác các vi ống sẽ đảm bảo cho quá trình thụ tinh diễn ra bình thường, giảm nguy cơ hình thành phôi lệch bội. Việc sử dụng kính hiển vi tăng cường ánh sáng phân cực, các nhà nghiên cứu có thể quan sát hình ảnh thoi vô sắc trong bào tương noãn. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu ở nhiệt độ 370C, hình ảnh thoi vô sắc quan sát thấy sau khoảng từ vài chục phút đến vài giờ sau rã đông [6]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, sau 3 giờ nuôi cấy, thoi vô sắc đã phục hồi ở 100% noãn sau rã đông (bảng 2). Việc xác định được thời điểm tái trùng hợp hoàn toàn của thoi vô sắc để lựa chọn thời gian thụ tinh thích hợp có vai trò quyết định trong nâng cao tỷ lệ thụ tinh của noãn sau rã đông cũng như hạn chế các phôi lệch bội sau này. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu cũng như các công bố khác trên thế giới, chúng tôi lựa chọn thời điểm 3 giờ sau rã đông để thực hiện kỹ thuật ICSI đối với noãn đông lạnh, kết quả: tỷ lệ thụ tinh là 71,28%; tỷ lệ thai lâm sàng đạt 29,41% và tỷ lệ phôi làm tổ đạt 12,94%. Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới. Antinori M (2007) [6] thực hiện ICSI trên 328 noãn đông lạnh và 726 noãn “tươi”, trong đó nhóm noãn thủy tinh hóa có tỷ lệ thụ tinh 93%, tỷ lệ thai lâm sàng 32,5%, tỷ lệ làm tổ 13,2%, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm noãn tươi không đông lạnh. Từ kết quả thụ tinh của noãn rã đông, đặc biệt kết quả trên lâm sàng cho phép nhận định rằng, tuy vẫn còn nhiều tranh cãi liên quan đến tác động của quy trình đông lạnh đến cấu trúc nội bào có thể ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển của noãn sau rã đông, nhưng với những nỗ lực cải tiến về thành phần chất bảo quản cũng như dụng cụ chứa mẫu, hiệu quả của quy trình đông lạnh thủy tinh hóa noãn đã được nâng cao rõ rệt. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 36 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 211 noãn đông lạnh rã đông và 34 chu kỳ rã đông noãn - chuyển phôi cho thấy: - Hình thái noãn về kích thước bào tương và độ dày màng trong suốt sau rã đông không thay đổi có ý nghĩa thống kê so với trước đông lạnh. - Thoi vô sắc noãn sau rã đông phục hồi hoàn toàn sau 3 giờ nuôi cấy. - Tỷ lệ noãn sống sau rã đông 89,09%, tỷ lệ phôi tốt ngày 3 là 38,71%, tỷ lệ thụ tinh 71,28%, tỷ lệ thai lâm sàng 29,41%, tỷ lệ làm tổ 12,94%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Viết Tiến, Nguyễn Thị Ngọc Phượng và CS. Đồng thuận đánh giá và phân loại noãn, phôi trong hỗ trợ sinh sản. Hội Phụ sản khoa và Sinh đẻ có kế hoạch Việt Nam (VINAGOFPA), Chi hội Y học sinh sản Việt Nam (VSRM). 2012. 2. Đặng Quang Vinh và CS. Trữ lạnh phôi và trứng trong hỗ trợ sinh sản. Vô sinh và hỗ trợ sinh sản. Hosrem. 2007. 3. Antinori M, Licata E, Dani G et al. Cryotop vitrification of human oocytes results in high survival rate and healthy deliveries. Reprod Biomed Online. 2007, 14 (1), pp.72-79. 4. Bo Xu, Xian-hong Tong et al. Cryotop vitrification affects oocyte quality and embryo developmental potential. EC Gynaecology. 2015, 1 (2), pp.46-52. 5. Chen C. Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet. 1986, 2, pp.884-886. 6. Ciotti P.M, Porcu E, Notarangelo L et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertil Steril. 2009, 91 (6), pp.2399-2407. 7. Martínez-Burgos M, Herrero L, Megías D et al. Vitrification versus slow freezing of oocytes: Effects on morphologic appearance, meiotic spindle configuration and DNA damage. Fertil Steril. 2011, 95 (1), pp.374-377. 8. Oktay K, Cil A.P, Bang H. Efficiency of oocyte cryopreservation: A meta-analysis. Fertil Steril. 2006, 86, pp.70-80.