Biệt hóa In Vitro các tế bào mầm từ mảnh mô tinh hoàn chuột

220 BIỆT HÓA IN VITRO CÁC TẾ BÀO MẦM TỪ MẢNH MÔ TINH HOÀN CHUỘT Phạm Văn Phúc*, Trương Định*, Huỳnh Thị Lệ Duyên*, Phan Kim Ngọc* TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định sự biệt hóa in vitro các tế bào mầm trong tinh hoàn thành các tế bào tinh trùng trưởng thành. Phương pháp: Các mẫu mô tinh hoàn chuột trưởng thành được thu nhận để phân lập các tế bào mầm. Các tế bào mầm và các tế bào đã biệt hóa như Sertoli được đồng nuôi cấy trong môi trường GAMETE-100 bổ sung với hormone FSH và testosteron. Các mẫu nuôi cấy được đánh giá sau 24 giờ và 48 giờ. Sự trưởng thành của tế bào mầm được đánh giá thông qua sự hình thành đuôi (tiêm mao). Kết quả: Các tế bào mầm tồn tại trong tinh hoàn có thể thu nhận và nuôi cấy in vitro. Các số liệu thu được cho thấy với nồng độ FSH là 50 IU/ml và testosteron là 1 µM/ml thì thích hợp cho việc nuôi cấy và biệt hóa các tế bào mầm thành tinh trùng. Kết luận: FSH có vai trò quan trọng lên sự trưởng thành của tế bào mầm, trong khi đó testosteron hầu như không có tác động đó. Tuy nhiên, việc kết hợp FSH và testosteron sẽ cho kết quả cao hơn khi chỉ sử dụng FSH hay testosteron. ABSTRACT IN VITRO GERM CELLS DIFFERENTIATION OF MOUSE TESTICULAR TISSUES Pham Van Phuc, Truong Dinh, Huynh Thi Le Duyen, Phan Kim Ngoc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 - No 4 - 2007: 219 - 223 Objective: To identify in vitro germ cells differentiation of mouse testicular tissues to mature sperms. Method: Testis tissues derived from mouse adult testis is used for isolation germ cells. Germ cells and some of different cells such as Sertoli are co-cultured in vitro in medium GAMETE-100, plus with FSH and Testosterone. After 24 and 48h of culture, progression of spermatogenesis and percentage of matured germ cells are evaluated. Maturation of germ cells are evaluated via appearance of tails (flagella). Result: Germ cells of testicular tissues can be is olated and cultured in vitro. Data showed that suitable FSH concentration is 50 IU/L and testosterone is 1 µM/L. Conclusion: FSH has an important role in maturation of germ cells. In contrast with FSH, testosterone does not almost stimulate germ cell's maturation. However, combination of FSH and testosterone can resulted in maturation of germ cells better than if using only FSH or testosterone. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong quá trình phát triển phôi, tế bào mầm hình thành và di cư vào cơ quan sinh dục. Khác với các cá thể cái, toàn bộ tế bào mầm đều đi vào quá trình giảm phân và ngừng ở prophase II; trong khi đó các tế bào mầm của cá thể đực lại nguyên phân và đến tuổi dậy thì bắt đầu giảm phân. Do đó, trong cơ thể trưởng thành, ở tinh hoàn vẫn tồn tại một lượng lớn tế bào mầm sinh tinh(2). Trong một số trường hợp vô sinh ở người, sự ngừng phân chia của các tế bào mầm trong cơ thể đực không được kích hoạt thích hợp cho tiếp tục giảm phân bình thường; hậu quả là không có tinh trùng trưởng thành hình thành. Các nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào mầm trong cơ thể trưởng thành của cá thể đực có thể tiếp tục quá trình giảm phân tạo tinh trùng trưởng thành in * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP. HCM 221 vitro. Trong môi trường nuôi cấy, FSH và testosteron được chứng minh là có vai trò trong sự trưởng thành của tế bào mầm sinh tinh in vitro(4,5). Với kĩ thuật này, người ta đang hi vọng vào một phương pháp điều trị vô sinh mới kết hợp với kĩ thuật ICSI (vi tiêm tinh trùng vào bào tương trứng). Theo phương pháp này: đầu tiên các mảnh sinh thiết tinh hoàn được thu nhận, sau đó chúng được nuôi cấy biệt hóa invitro thành các tinh trùng trưởng thành và cuối cùng sử dụng kĩ thuật ICSI để vi tiêm nó vào trứng(3). Ngoài ý nghĩa điều trị vô sinh, việc nuôi cấy biệt hóa in vitro các tế bào mầm tinh hoàn thành tinh trùng trưởng thành còn ý nghĩa lớn trong bảo tồn giống, bảo tồn nguồn gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các mảnh biểu mô tinh hoàn của chuột trưởng thành để thu nhận tế bào cho nuôi cấy. Đây xem như là một mô hình cho các nghiên cứu xa hơn. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Thu nhận tinh hoàn Chuột đực trưởng thành bị giết chết bằng kéo dãn khớp cổ. Giải phẫu, kéo tuột lớp da đến hết hai tinh hoàn. Thu nhận hai tinh hoàn, cho vào dung dịch PBSA Thu nhận tế bào đơn Các mảnh mô tinh hoàn được đặt vào trong môi trường GAMETE-100 (Vitrolife). Tiến hành ép các mảnh mô bằng hai miếng lame sạch. Các mảnh mô này được phân tách một phần bởi lực cơ học. Sau đó, chuyển toàn bộ các mảnh mô sau khi ép vào dung dịch collagenase IV (1000 U/ml, Sigma), ủ ở 370C, trong 15-30 phút. Huyền phù tế bào thu nhận được li tâm ở 2500 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn. Tái huyền phù cặn trong môi trường GAMETE-100 đã được làm ấm ở 300C. Nuôi cấy và biệt hóa Nhiều công trình nghiên cứu in vitro và khảo sát in vivo cho thấy, việc trưởng thành của tinh trùng (hay sự biệt hóa từ các tế bào mầm sinh dục) được kiểm soát bởi hai hormone là FSH (Puregon, Organon) và testosteron (Puregon, Organon). Vì nồng độ FSH trong tác động lên sự biệt hóa chưa được xác định rõ ràng, nên trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát tác động của hormone FSH lên sự trưởng thành với 4 nồng độ khác nhau: 10 IU/L, 25 IU/L, 50 IU/L, 100 IU/L. Trong khi đó, nồng độ của testosteron đã được xác định trong trong tinh hoàn là 1 µM/L(5). Nghiệm thức 1: Xác định nồng độ FSH tối ưu. Nghiệm thức này được tiến hành 5 lô, mỗi lô lặp lại 3 lần. Trong đó, lô 1 là lô đối chứng, tế bào được nuôi trong môi trường không bổ sung hormone. Các lô 2,3,4,5 tế bào được nuôi trong môi trường có bổ sung với hormone FSH với nồng độ lần lượt là 10 IU/L, 25 IU/L, 50 IU/L, 100 IU/L tương ứng với các lô. Hình 1. (a) Các mảnh biểu mô tinh hoàn, (b) Nhóm tế bào thu nhận sau khi phân cắt với enzyme (X20). 1 mm (a) (b) 222 Nghiệm thức 2: Xác định tác động của FSH và testosteron lên sự trưởng thành tinh trùng. Trong nghiệm thức này, chúng tôi tiến hành 4 lô, với lô 1 là lô đối chứng (không bồ sung hormone vào môi trường nuôi cấy), lô 2: môi trường nuôi có bổ sung với hormone FSH (50 IU/L, là nồng độ được xác định tối ưu trong nghiệm thức 1), lô 3: môi trường nuôi có bổ sung hormone testosteron (1 µmol/L) và lô 4: môi trường nuôi có bổ sung hai hormone FSH (50 IU/L) và testosteron (1 µmol/L). Các lô thí nghiệm trên được lặp lại 3 lần. Các lô thí nghiệm của các nghiệm thức trên được nuôi ở 300C, 5% CO2. Tác động của FSH lên sự trưởng thành của tinh trùng trong nghiệm thức 1 được đánh giá sau 24 giờ nuôi cấy. Ở nghiệm thức 2, tiến hành đánh giá sự trưởng thành của tinh trùng sau 24 và 48 giờ. Sự trưởng thành của tinh trùng được đánh giá gián tiếp thông qua sự xuất hiện đuôi. Điều này dựa trên sinh lí bình thường là khi tinh trùng trưởng thành sẽ giảm phân để đạt được bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n) và có xuất hiện đuôi dài. Do vậy, những tinh trùng xuất hiện đuôi sẽ được đánh giá là trưởng thành. Tỉ lệ tinh trùng trưởng thành sau khi nuôi trong các môi trường, các mốc thời gian được ghi nhận bằng cách đếm liên tục trên đĩa nuôi số lượng tế bào xuất hiện đuôi trong 100 tế bào đếm được. Kết quả ở hai nghiệm thức được xử lí bằng phần mềm tính xác xuất thống kê Statraphic 7.0. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tác động của FSH lên sự trưởng thành của tế bào mầm Sau 24 giờ nuôi cấy, số lượng tinh trùng bắt đầu xuất hiện đuôi trong lô đối chứng chiếm 7,33%. Ở lô thí nghiệm có bổ sung 10 IU/L FSH, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành là 10,33%. Tuy nhiên, sự sai khác giữa hai số liệu này không có ý nghĩa thống kê, nghĩa là ở nồng độ 10 IU/L hiệu quả tác động của FSH không rõ ràng hay không có tác động lên sự biệt hóa thành tinh trùng. Bắt đầu từ nồng độ FSH là 25 IU/L, hiệu quả tác động của nó ngày càng rõ rệt với vai trò làm biệt hóa tế bào tiền thân tinh trùng thành các tế bào tinh trùng. Ở nồng độ FSH 25 IU/L, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành là 20,67%, khác biệt có ý nghĩa thống kê với tỉ lệ phầm trăm tinh trùng trưởng thành ở nồng độ FSH là 10 IU/L. Nồng độ FSH mà tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành đạt cao nhất là 50 IU/L. Ở nồng độ FSH cao hơn 100 IU/L, tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành có giảm nhưng sự sai khác này không có ý nghĩa thống kê. 223 . Hình 2. (a) Biểu đồ tác động của FSH lên sự trưởng thành tinh trùng ở các nồng độ khác nhau. (b) Tác động của FSH và testoteron lên sự trưởng thành của tế bào mầm sinh tinh. Như vậy, nồng độ FSH tối thiểu có thể gây tác động lên sự biệt hóa là 25 IU/L. Nồng độ FSH tối ưu là 50 IU/L. Bởi vì ở nồng độ 100 IU/L tỉ lệ tinh trùng trưởng thành tương đối cao nhưng do sử dụng nồng độ FSH cao gấp hai nên không được lựa chọn. Thật vậy, nồng độ FSH cao được chứng minh trên người là có thể gây chết và sự trưởng thành không bình thường của tinh trùng. Hình 3. Một số dạng tinh trùng sau khi nuôi cấy. (a) Tinh trùng với đuôi mới hình thành ngắn, thân chưa định hình, phần đầu chưa rõ rệt, (b) Tinh trùng dị dạng với hai đuôi mọc về hai phía, phần thân và 224 phần đầu chưa hình thành, (c) Tinh trùng với đuôi tương đối dài, đầu tròn nhưng thiếu phần thân. (d) Tinh trùng trưởng thành với đuôi dài, phần thân và đầu định hình khá rõ rệt. Sự tác động của FSH và testosteron Sau 24 giờ, tỉ lệ tinh trùng trưởng thành ở lô đối chứng là 11% (tương đương với tỉ lệ này ở nghiệm thức 1). Ở lô bổ sung Testosteron, tỉ lệ này là 10,67%. Sự sai khác giữa hai lô này không có ý nghĩa thống kê, nghĩa là hầu như testosteron không tác động lên sự trưởng thành, biệt hóa của tinh trùng. Ở lô bổ sung FSH với nồng độ 50 IU/L thì tỉ lệ phần trăm tinh trùng trưởng thành là 34,33% (kết quả này cũng tương tự ở nghiệm thức 1). So với lô đối chứng và lô bổ sung testosteron thì cho thấy, ở nồng độ 50 IU/L, FSH đã có tác động tốt lên sự biệt hóa, trưởng thành của các tế bào gốc tiền thân tinh trùng. Ở lô FSH kết hợp với testosteron, tỉ lệ tinh trùng trưởng thành là 46,33%. Tỉ lệ này cao hơn hẳn so với các lô khác. Như vậy, tuy testosterone không có vai trò trong sự biệt hóa thành tinh trùng nhưng khi kết hợp với FSH làm gia tăng tỉ lệ tinh trùng trưởng thành. Vai trò cụ thể của testosterone chưa được xác định rõ ràng trong nghiên cứu này, nhưng một số nghiên cứu khác trên người cho thấy testosteron không có vai trò trong sự biệt hóa thành tinh trùng nhưng testosteron có vai trò duy trì các tế bào Sertoli (những tế bào đồng nuôi cấy) sẽ giúp Sertoli hỗ trợ các tế bào tiền thân biệt hóa thành tế bào tinh trùng trưởng thành(1). Thật vậy, trong nuôi cấy tiến hành trong các thí nghiệm, các mảnh biểu mô tinh hoàn chứa cả các tế bào Leydig, tế bào Sertoli và tế bào mầm sinh dục đều được tiến hành nuôi chung (đồng nuôi cấy). Việc nuôi cấy này được đánh giá cao vì những tế bào hỗ trợ tế bào mầm trong tinh hoàn có vai trò quan trọng trong sự biệt hóa thành tinh trùng. KẾT LUẬN Các tế bào mầm tồn tại trong tinh hoàn chuột có thể thu nhận và nuôi cấy in vitro. Dưới các tác nhân testosteron và FSH các tế bào mầm sinh dục từ tinh hoàn có thể biệt hóa thành tinh trùng. FSH có vai trò quan trọng trong sự kích thích biệt hóa tế bào gốc tiền thân tinh trùng thành các tế bào tinh trùng. Nồng độ FSH thích hợp nhất cho nuôi cấy là 50 IU/L. Hormone testosteron không có tác động trực tiếp lên sự biệt hóa nhưng kết hợp với FSH tăng cường sự biệt hóa. Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ là bước đầu cho thấy khả năng trưởng thành của tế bào mầm sinh tinh in vitro dưới tác dụng của FSH và testosteron. Việc dựa vào hình thái xuất hiện đuôi chưa hoàn toàn chính xác để kết luận tinh trùng trưởng thành. Hơn nữa, việc hư hại trong bộ nhiễm sắc thể khi trưởng thành in vitro chưa được đánh giá. Do vậy, việc tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về vấn đề này đang là vấn đề cần thiết. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Griswold MD (1993). Action of FSH on mammalian Sertoli cells. In: Russel LD, Griswold MD, eds. The Sertoli cell. Clearwater, FL: Cache River Press; 493–508. 2. Makoto C. Nagano (2005). Germ Line Stem Cells, Stem cells in endocrinology. Humana Press, Totowa New Jersey. 3. Tanaka A, Tanaka I, Nagayoshi M, Awata S, Mawatari Y, Kusunoki H. (1997). Comparative study of embryonic development of human oocytes injected with fresh round spermatids and injected with in vitro cultured round spermatids with flagella. In: Gomel V, Leung PCK, eds. In vitro fertilization and assisted reproduction. Bologna, Italy: Monduzzi Editore; 705–710. 4. Tesarik, J. Guido, M., Mendoza, C. et al. Human spermatogenesis in vitro: respects of follicle-stimulating hormone and tesotsteronr on meosis, spermiogenesis, and Sertoli cell apoptosis. J. Clin, Endocrinol. Meta., 83, 2772-2781. 225 5. Tesarik, J., Greco, E., Rienzi L. et al (1998). Differentiation of spermatogenic cells during in vitro culture of testicular biopsy samples from patients with obstructive azoospermia: effect of recombinant follicle stimulating hormone. Hum. Reprod., 13, 2772-2781.