Bước đầu sử dụng kỹ thuật real time PCR so sánh với kỹ thuật nested - PCR trong phát hiện và chẩn đoán loài plasmodium SPP

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 36 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME PCR SO SÁNH VỚI KỸ THUẬT NESTED - PCR TRONG PHÁT HIỆN VÀ CHẨN ĐOÁN LOÀI PLASMODIUM SPP Phạm Nguyễn Thúy Vy*, Trịnh Ngọc Hải*, Hoàng Thị Mai Anh*, Nguyễn Thị Vân Anh*, Võ Thế Ngọc Bích*, Nguyễn Thị Minh Châu* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Phát hiện Plasmodium spp bằng PCR đã tăng độ nhạy và phân biệt các loài, đặc biệt các ca nhiễm phối hợp chính xác hơn so với kính hiển vi hoặc miễn dịch. Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp PCR được công bố hiện nay đều đọc kết quả trên gel agrose đòi hỏi kỹ thuật phức tạp chưa tối ưu trong điều trị lâm sàng. Gần đây đã áp dụng kỹ thuật Real Time PCR, có độ nhạy cao hơn và thời gian làm việc hiệu quả hơn dùng để chẩn đoán và phân biệt loài ký sinh trùng sốt rét. Mục tiêu: Bước đầu sử dụng so sánh với kỹ thuật Real Time PCR so sánh với Nested PCR trong phát hiện và chẩn đoán loài Plsamodium spp. Đối tượng và Phương pháp: Sử dụng kỹ thuật Giem sa trong sàng lọc bệnh nhân nhiễm KSTSR ở 2 xã Đak Ơ và xã Bù Gia Mập, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước, sau đó dùng Real time PCR so sánh với Neted PCR trong phát hiện loài. Kết quả: Trong 400 mẫu sàng lọc bằng kỹ thuật Giem sa chỉ phát hiện được 2 chủng P.falciparum và P.vivax, Nested PCR và Real time PCR phát hiện thêm có chủng P.malariae. Đối với mẫu kỹ thuật Nested PCR phát hiện là nhiễm phối hợp P. falciparum và P.malariae thì kỹ thuật Real time PCR phát hiện thêm nhiễm phối hợp với cả P. vivax. Mẫu được xác định là âm tính với kỹ thuật Giemsa thì Nested PCR phát hiện là P.vivax và Real time PCR lại phát hiện thêm nhiễm P.fal. Kết luận: Kỹ thuật Real time PCR có độ nhạy cao hơn Nested PCR tuy nhiên độ đặc hiệu chưa xác định được. Từ khóa: Real time PCR, Plasmodium spp, Nested PCR. ABSTRACT INITIAL USING REAL TIME PCR COMPARISON WITH NESTED PCR DETECTION AND DIAGNOSIS PLASMODIUM SPP Pham Nguyen Thuy Vy, Trinh Ngoc Hai, Hoang Thi Mai Anh, Nguyen Thi Van Anh, Vo Ngoc Bich, Nguyen Thi Minh Chau * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 1 - 2013: 36 - 41 Background: Detection of Plasmodium spp by PCR has increased the sensitivity and distinguishes species, particularly the exact coordinate infections more than microscopy or immune. However, most published PCR methods are now reading the results on gel arose requires technical complexity is not optimal in clinical treatment. The need for a more sensitive test and the time to work more effectively led to the development of Real Time PCR. Objective: Initial using Real Time PCR compared to Nested PCR technique in detecting and diagnostic species Plasmodium spp. Materials and methods: Giemsa method used in screening patients infected with malaria parasites in two * Viện Sốt rét - KST - CT TP. HCM Tác giả liên lạc: ThS. Phạm Nguyễn Thúy Vy, ĐT: 0983092900, Email: thuyvypn@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 37 communes Dak Ơ and Bu Gia Map, Bu Gia Map district, Binh Phuoc province, then using Real time PCR detection compared with Nested PCR in species. Results: In 400 samples screened by Giemsa technique only detect two strains of P. falciparum and P.vivax, Nested PCR and Real time PCR detected more strain P.malariae. For Nested PCR samples found to be contaminated coordinate P. falciparum and P.malariae, Real time PCR detection technique is to coordinate P. falciparum, P.malariae and P. vivax. Samples were defined as negative for Giemsa technique, Nested PCR detection P.vivax and Real Time PCR to detect is a combination P. falciparum and infection P.vivax. Conclusions: Real time PCR technique is more sensitive nested PCR but specificity cannot be determined. Key words: Real time PCR, Plasmodium spp, Nested PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Khoa học công nghệ phát triển, phát hiện ký sinh trùng (KST) Plasmodium bằng kỹ thuật sinh học phân tử đã tăng độ nhạy và phân biệt các loài, phát hiện các ca nhiễm phối hợp chính xác hơn so với chẩn đoán bệnh sốt rét bằng kính hiển vi hoặc miễn dịch (4,6). Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp PCR được công bố hiện nay đều dựa vào kỹ thuật điện di trên gel agrose, điều nay đòi hỏi kỹ thuật phức tạp chưa tối ưu trong điều trị lâm sàng. Sự cần thiết cho một xét nghiệm có độ nhạy cao hơn và thời gian làm việc hiệu quả hơn đã dẫn đến sự phát triển kỹ thuật Real Time PCR(1,2,3,5). Xét nghiệm Real Time PCR có khả năng phát hiện mật độ KST thấp, xác định đựơc ca nhiễm phối hợp, và có thể ứng dụng cho sự khác biệt chính xác của các loài thông qua phân tích đường cong nóng chảy (Melting curve). Ưu điểm của Real Time PCR là chỉ một bước xử lý duy nhất, trong khi Nested PCR đòi hỏi phải có ít nhất hai bứớc xử lý. Real Time PCR được thực hiện trong một hệ thống khép kín, làm giảm tiềm năng nhiễm chéo và xử lý hóa chất độc hại và điện di gel agarose. Hơn nữa, kết quả thu được nhanh hơn Nested PCR và kỹ thuật này cho phép đồng thời phát hiện và định lượng được KST. Hiện nay, áp dụng kỹ thuật này vẫn đang còn hạn chế vì chi phí cao và đòi hỏi kỹ thuật, tuy nhiên, những phương pháp này có ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu lâm sàng liên quan đến việc phân tích các mẫu máu thu được từ thực địa, các kiểu di truyền trong quần thể KST, thử nghiệm và giám sát hiệu quả trong kháng thuốc sốt rét. Nghiên cứu này của chúng tôi nhằm: Mục tiêu Bước đầu sử dụng kỹ thuật Real Time PCR so sánh với kỹ thuật Nested PCR trong phát hiện và chẩn đoán loài Plsamodium spp. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Địa điểm tiến hành Nghiên cứu được thực hiện tại thực địa tại xã Bù Gia Mập và xã Đak Ơ huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình Phước. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Cách chọn mẫu Các mẫu máu được thu thập tại thực địa,những bệnh nhân từ 5-60 tuổi được xét nghiệm có nhiễm Plasmodium spp được lấy máu tại đầu ngón tay nhỏ trên giấy Whatmann, để khô tự nhiên, bỏ vào bì nylon, ghi tên bệnh nhân và mã số, sau đó đem về Viện. Cỡ mẫu Tính theo công thức N: số mẫu cần điều tra Z = 1.96, với x = 0.05, độ tin cậy 95% p: là tỷ lệ nhiễm KSTSR ước tính khoảng là 15%. q = 1-p tỷ lệ người không nhiễm KSTSR là 0.85 (85%). d=0.05 là sai số mong muốn ở mức 5% Z2 p (1-q) N= ----------------- d2 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 38 Áp dụng công thức cần 400 mẫu đối với 2 xã, cần tối thiểu 10 mẫu dương tính với KSTSR Xác định chủng Plasmodium bằng phưong pháp nhuộm Giem sa Áp dụng quy trình xét nghiệm của Viện Sốt rét - KST -CT Trung Ương. Xác định chủng Plasmodium bằng phương pháp Nested PCR Áp dụng quy trình khuếch đại theo quy trình của Viện sốt rét - KST - CT Trung ương. Bảng 1: Trình tự nucleotide của các mồi được sử dụng trong nghiên cứu. Xác định chủng Plasmodium bằng phương pháp Real time PCR Các cặp primer được đưa vào lựa chọn nghiên cứu (dựa vào trình tự các cặp mồi trong Gen Bank). Trên cơ sở trình tự primer đã được lựa chọn, sử dụng primer này để tìm kiếm ở ngân hàng gen NCBI đoạn ADN chứng dương. Mẫu dò cho 4 loài như sau: P. falciparum: Falcprobe: 5′-FAM- AGCAATCTAA AAGTCACCTC GAAAGATGAC T-TAMRA-3′, P. vivax: Vivprobe: 5′-VIC-AGCAATCTAA GAATAAACTC CGAAGAGAAA ATTCT- TAMRA-3′, P. malariae: Malaprobe: 5′FAM- CTATCTAAAA GAAACACTCAT - TAMRA-3′, P. ovale:Ovaprobe: 5′VIC- CGAAAGGAATTTTCTTATT- TAMRA-3′, Dựa vào biểu đồ chảy (melt curve chart) để phân tích kết quả. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa Tại Xã Đak Ơ, thu thập được 200 mẫu máu nghi ngờ nhiễm KSTSR, được xác định bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa, xác định được 20 mẫu nhiễm P.falciparum (10 %) và 14 mẫu nhiễm P. vivax (7%), không mẫu nào được xét nghiệm nhiễm phối hợp, 166 mẫu được xác định âm tính (83%). Tại xã Bù Gia Mập, thu thập được 200 mẫu máu nghi ngờ nhiễm KSTSR, được xác định bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa, có 24 mẫu nhiễm P.falciparum (12%) và 13 mẫu nhiễm P. vivax (6,5%), 2 mẫu nhiễm phối hợp cả P.falciparum và P.vivax (1%), 161 mẫu âm tính (80,5%). 400 mẫu thu thập được thì cơ cấu phân bố loài KSTSR được biểu hiện như bảng 1 Bảng 2. Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa chung cho cả 2 xã. Tên chủng P.falciparum P.vivax Nhiễm phối hợp Mẫu âm Số lượng 44 27 2 327 Tỷ lệ % 11 % 6,75 % 0,5 % 81,75% Tỷ lệ P.falciparum chiếm ưu thế, nhiễm phối hợp chỉ chiếm 0,5%. Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng kỹ thuật Nested- PCR Bảng 2. Kết quả xác định chủng bằng phương pháp Nested –PCR. Tên chủng P. falciparum P. vivax Nhiễm phối hợp Mẫu âm Số lượng 48 25 6 321 Tỷ lệ % 12% 6,25% 1,5% 80,25% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 39 Hình 1. Hình ảnh kết quả nhiễm phối hợp P. falciparum, P. vivax, P. malariae và nhiễm đơn P. Vivax. Giếng 1: Thang chuẩn. Giếng 2: Kết quả dương tính của P. Falciparum. Giếng 3, 7: Kết quả dương tính của P.vivax. Giếng 4: Kết quả dương tính của P. Malariae. Nhận xét: Dựa vào biểu đồ cơ cấu KSTSR thành phần loài, ta thấy tỷ lệ nhiễm phối hợp và nhiễm P.falciparum được phát hiện bằng kỹ thuật Nested PCR nhiều hơn kỹ thuật Giemsa. Kết quả xác định chủng Plasmodium bằng kỹ thuật Real time PCR Bảng 3. Kết quả xác định chủng bằng phương pháp Real time PCR. Tên chủng P. falciparum P. vivax Nhiễm phối hợp Mẫu âm Số lượng 47 24 8 321 Tỷ lệ % 11,75% 6% 2% 80,25% Hình 2. Kết quả mẫu phát hiện P.fal, P.vivax bằng Real time PCR. Nhận xét: Kỹ thuật Real time PCR và Nested PCR có sự tương đồng trong xác định thành phần cơ cấu loài của 2 phương pháp này. Điều này cho thấy thiết kế mồi ở hai kỹ thuật này là đã khuếch đại được đoạn gen bảo tồn trong chẩn đoán các loài Plasmodium. Dựa vào đường cong nóng chảy và biểu đồ của đường chuẩn có nhận biết được số lượng KSTSR nhiễm trong máu bệnh nhân (tính theo nồng độ mẫu chuẩn). So sánh kết quả xác định chủng 205bp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 40 Plasmodium bằng kỹ thuật Giemsa, Nested PCR và Real time PCR Bảng 4. Kết quả so sánh xác định chủng bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa, Nested -PCR và Real time PCR. Thành phần loài Giem sa Tỷ lệ (%) Nested PCR Tỷ lệ (%) Real time PCR Tỷ lệ (%) P.falciparum 44 11 48 12 47 11,75 P.vivax 27 6,75 25 6,25 24 6 Nhiễm phối hợp 2 0,5 6 1,5 8 2 Âm tính 327 81,75 321 80,25 321 80,25 Tổng số mẫu 400 400 400 Nhận xét: Tổng số mẫu thực hiện so sánh là 400. Tỷ lệ dương tính của kỹ thuật Nested PCR và Real Time PCR cao hơn hẳn so với nhuộm giêmsa. Bảng 5. Kết quả so sánh các loài cụ thể kỹ thuật Giemsa, Nested -PCR và Real Time PCR. Loài Giem sa Nested PCR Real time PCR P. falciparum P. falciparum (44) P. falciparum (42) P. falciparum (42) P. falciparum + P.malariae + P. vivax(1) P. falciparum + P.malariae+ P. vivax(1) P. falciparum + P. vivax (1) P. falciparum + P. vivax (1) P.vivax P. vivax (27) P. vivax(24) P. vivax(24) P. falciparum + P. vivax (2) P. falciparum + P. vivax (2) P. Falciparum(1) P. Falciparum(1) Nhiễm phối hợp P.fal +P.vivax (2) P. falciparum + P. vivax (1) P. falciparum + P. vivax (1) P. falciparum + P.malariae (1) P. falciparum + P. vivax+ P.malariae (1) Negative Âm tính (327) P. falciparum (5) P. falciparum (4) P. vivax (1) P. falciparum + P. vivax (2) Âm tính(321) Âm tính (321) Nhận xét: Đối với các mẫu được xác định là dương tính ở kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ thuật Nested PCR và Real Time PCR cho các kết quả cao hơn trong xác định từng loài KST SR. Sử dụng kỹ thuật Nested PCR làm chuẩn thì kỹ thuật Real time phát hiện ra 79 mẫu (độ nhạy là 100%) và không phát hiện Plasmodium trong 321 mẫu được xác định là âm tính. BÀN LUẬN Kết quả của chúng tôi trong bảng 3.5: 44 mẫu xác định là P.falciparum ở kỹ thuật nhuộm Giem sa thì ở kỹ thuật Nested PCR và Real time PCR xác định là 42 mẫu P.falciparum, 1 mẫu nhiễm phối hợp 3 loài P. falciparum, P.malariae và P. vivax và 1 mẫu nhiễm phối hợp 2 loài P. falciparum và P. vivax. Với 42 mẫu xác định là P.vivax ở kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ thuật Nested PCR và Real time PCR xác định là 24 mẫu nhiễm P.vivax, 2 mẫu nhiễm P. falciparum và P. vivax và 1 mẫu nhiễm P.falciparum. Trong 2 mẫu nhiễm phối hợp P. falciparum và P.vivax được xác định bằng kỹ thuật nhuộm Giemsa thì ở kỹ thuật Nested PCR phát hiện 1 mẫu nhiễm P. falciparum và P.vivax, 1 mẫu nhiễm phối hợp P. falciparum và P.malariae. Và ở kỹ thuật Real time PCR phát hiện 1 mẫu nhiễm phối hợp P. falciparum và P.vivax, 1 mẫu nhiễm phối hợp P. falciparum, P.vivax và. P.malariae. Với các mẫu được xác định là âm tính ở kỹ thuật nhuộm Giemsa thì kỹ thuật Nested PCR phát hiện thêm 5 mẫu nhiễm P. falciparum và 1 mẫu nhiễm P.vivax, kỹ thuật Real time PCR phát hiện thêm 4 mẫu nhiễm P. falciparum và 2 mẫu nhiễm phối hợp P. falciparum và P.vivax. Như vậy so với kỹ thuật Nested PCR, kỹ thuật Real Time PCR cho ra kết quả với độ chính xác cao hơn, thời gian phân tích ngắn hơn và còn định lượng được nồng độ KSTSR trong mẫu. Hiện nay kết quả nghiên cứu về kỹ thuật Real Time PCR để xác định loài ký sinh trùng sốt rét đang còn rất hạn chế ở Việt Nam. Hầu hết các báo cáo kết quả đều của các tác giả nước ngoài. Kết quả bước đầu của chúng tôi cho thấy kỹ thuật Real Time PCR có độ nhậy cao hơn so với Nested PCR, đây sẽ là tiền đề cho các nghiên Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 41 cứu tiếp theo của Viện trong tương lai. KẾT LUẬN Xác định loài KST sốt rét Kỹ thuật Giem sa đã phát hiện được 44 mẫu nhiễm P. falciparum, 27 mẫu nhiễm P. vivax, 2 mẫu nhiễm P. falciparum và P.vivax, 327 mẫu nhiễm âm tính. Kỹ thuật Nested PCR đã phát hiện được 48 mẫu nhiễm P. falciparum, 25 mẫu nhiễm P. vivax, 6 mẫu nhiễm P. falciparum và P.vivax, 321 mẫu nhiễm âm tính. Kỹ thuật Real Time PCR đã phát hiện được 47 mẫu nhiễm P. falciparum, 24 mẫu nhiễm P. vivax, 8 mẫu nhiễm P. falciparum và P.vivax, 321 mẫu nhiễm âm tính. So sánh 3 kỹ thuật phát hiện KSTSR Kỹ thuật Giem sa chỉ phát hiện được 2 chủng P.falciparum và P.vivax, trong khi đó kỹ thuật Nested PCR và Real Time PCR phát hiện được thêm có chủng P.malariae. Đối với mẫu kỹ thuật Nested PCR phát hiện là nhiễm phối hợp P. falciparum và P.malariae thì kỹ thuật Real Time PCR phát hiện thêm là nhiễm P. vivax. Với mẫu được xác định là âm tính với kỹ thuật Giemsa thì ở kỹ thuật Nested PCR phát hiện là P.vivax và kỹ thuật Real Time PCR lại phát hiện thêm là nhiễm P. falciparum. ĐỀ NGHỊ Cần thực hiện thêm kỹ thuật giải trình tự những mẫu đươc xác định là dương tính để có thêm cơ sở để khẳng định loài. Tiếp tục nghiên cứu phân tích thêm số mẫu trong năm tới. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brown, AE, Kain KC, Pipithkul J, and Webster HK.(1992) “Demonstration by the polymerase chain reaction of mixed Plasmodium falciparum and P. vivax infections undetected by conventional microscopy”. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 86:609- 612. 2. De Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, and Picot S (2003), “Simultaneous identification of the four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in human blood by real-time polymerase chain reaction” Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 97:387-390. 3. Hermsen CC, Telgt DS, Linders EH, van de Locht LA, Eling WM, Mensink EJ, and Sauerwein RW (2001),” Detection of Plasmodium falciparum malaria parasites in vivo by real-time quantitative PCR.”, Mol. Biochem. Parasitol. 118:247-251 4. Lê Đức Đào, Bùi Quang Phúc, Nguyễn Văn Tuấn và cs (2003), “So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu giữa 3 kỹ thuật giemsa, paracheck, PCR phát hiện KSTSR tại xã Daksong, tỉnh Gia Lai 6/2002”, Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 3 - 2003, tr. 55 - 63. 5. Lee MA, Tan CH, AW LT, Tang, Singh M, Lee SH, Chia HP, and Yap EP (2002), “Real- CS time fluorescence-based PCR for detection of malaria parasites”. J. Clin. Microbiol. 40:4343-4345. 6. Mangold KA, Manson RU (2005), “Real-Time PCR for Detection and Identification of Plasmodium spp.”, J Clin Microbiol. 2005 May; 43(5): 2435–2440