Bước đầu ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy trong chẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tố kịch phát về đêm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 481 BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TIỂU HUYẾT SẮC TỐ KỊCH PHÁT VỀ ĐÊM Trần Thị Thiên Kim*, Nguyễn Thụy Loan Chi**, Nguyễn Phương Liên***, Nguyễn Hồng Điệp***, Nguyễn Thị Kim Yến*** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá vai trò của kỹ thuật tế bào dòng chảy trong chẩn đoán và tầm soát bệnh tiểu huyết sắc tố kịch phát về đêm (PNH). Phương pháp nghiên cứu: Phân tích hàng loạt ca. Sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang và phân tích bằng hệ thống máy FACS Canto II trên phần mềm Diva. Tiến hành nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi ngờ có bệnh tiểu huyết sắc tố về đêm và suy tủy tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học. Kết quả: Có 16 bệnh nhân được phân tích dấu ấn miễn dịch bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy. Tuổi trung vị 22, tỉ lệ nam nữ là 1:1. Có 4 bệnh nhân giảm 2 dòng tế bào trong đó có 2 bệnh nhân được chẩn đoán suy tủy. Anti CD59 tỏ ra nhạy hơn anti CD55 trong việc tầm soát dòng tế bào bị đột biến. Tỉ lệ thiếu CD14 là 50% và CD16 là 42% các trường hợp được khảo sát. Trường hợp thiếu một CD trên một dòng tế bào là 44%, các trường hợp này cần theo dõi thêm. Bệnh nhân suy tủy không có dấu hiệu tán huyết nội mạch và chỉ có một ca phát hiện thiếu hụt một CD trên một dòng tế bào.Trong số bệnh nhân thiếu máu tán huyết được xác định chắc chắn là PNH thiếu hụt 2 CD trên 2 dòng tế bào có 62,5% tiểu Hb và 75% test Hamdacie dương tính. Kết luận: Kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) có thể thực hiện tầm soát dễ dàng và chính xác bệnh PNH. Cần lựa chọn đối tượng bệnh nhân thích hợp để tránh bỏ sót bệnh. Trường hợp chỉ thiếu hụt một CD trên một dòng tế bào cần theo dõi thêm vì chưa thể khẳng định là PNH. Từ khoá: Kỹ thuật tế bào dòng chảy, bệnh PNH, protein gắn neo GPI, tiểu hemoglobin, Hamdacie test. Viết tắt: Bệnh PNH: bệnh tiểu huyết sắc tố kịch phát về đêm; neo GPI: protein glycophosphatidylinositol gắn ở màng tế bào; tiểu Hb: tiểu huyết sắc tố. ABSTRACT INITIAL APPLICATION OF FLOW CYTOMETRY IN THE DIAGNOSIS OF PAROXYMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA. Tran Thi Thien Kim, Nguyen Thuy Loan Chi, Nguyen Phuong Lien, Nguyen Hong Diep, Nguyen Thi Kim Yen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 481 - 487 Objective: Accessing the role of the Flow cytometry in the diagnosis and screening for the Paroxymal nocturnal hemoglobinuria. Method: Case series. We used many fluorescence monoclonal antibodies and analysed the blood samples of patients who were suspected of having PNH or aplastic anemia on FACS Canto II with Diva software at Blood Transfusion and Hematology Hospital. Results: There are 16 patients were analysed immunophenotypes by flow cytometry. The median age is 22; * Khoa Phòng khám, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM ** Bộ môn Sinh Hóa, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch TP.HCM *** Bộ phận Dấu ấn miễn dịch, Khoa Miễn Dịch, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM Tác giả liên lạc: BS. Trần Thị Thiên Kim ĐT: 0934189633 Email: thienkim6583@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 482 male and female ratio is 1:1. There are four patients who had cytopenia in two lineages in which two were diagnosed aplastic anemia. Anti CD59 proved more sensitive in screening the mutant clones than CD55. The rate of deficiency CD14 is 50% and CD16 is 42% of the survey cases. Cases lacking of one CD on one lineage account for 44%, these cases should be monitored longer. Bone marrow failure patients had no sign of intravascular hemolysis and only one case (50%) was found lacking of one CD on one lineage. Among patients who had a certain diagnosis of PNH (having two CD on two lineages) the symptoms hemoblobinuria make up 62.5% and Hamdacie test posive make up 75%. Conclusion: Technique for indentyfying immunophenotypes by Flow cytometry can easily and correctly screen PNH disease. Nessesary to select approriate patients to avoid missing diagnosis. Cases lacking only one CD on one lineage should be monitored more, it could not confirm PNH in these cases. Keywords: flowcytometry, paroxymal nocturnal hemoglobinuria, protein linked to GPI anchors, hemoglobinuria, Hadacie test. PNH: paroxymal nocturnal hemoglobinuria, GPI: glycophosphatditylinositol. ĐẶT VẤN ĐỀ Tiểu huyết sắc tố kịch phát về đêm (PNH) là một bệnh lý hiếm gặp liên quan đến rối loạn mắc phải của tế bào gốc tạo máu. Nguyên nhân là do sự đột biến thể xô-ma trên gen PIG-A liên kết với NST-X, dẫn đến sự thiếu hụt một phần hoặc hoàn toàn những protein thường liên kết với màng tế bào bởi neo GPI (GPI-AP) như CD55 và CD59. Mặc dù PNH hiếm gặp nhưng việc tầm soát và chẩn đoán chính xác bệnh là rất quan trọng, vì PNH là một bệnh mãn tính kéo dài trong nhiều năm và có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng cuộc sống và biến chứng của bệnh có thể ảnh hưởng đến sự sống còn của bệnh nhân(1). Trong vòng 20 năm qua, trên thế giới người ta đã ứng dụng kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) để tầm soát, chẩn đoán và theo dõi bệnh PNH vì đây là một xét nghiệm có tính đặc hiệu, nhạy và nhanh chóng. PNH là một bệnh lý rối loạn tạo dòng của tế bào gốc tạo máu. Hậu quả là tất cả các dòng tế bào máu đều bị ảnh hưởng. Vì vậy để tránh bỏ sót cần phải khảo sát sự thiếu hụt các protein gắn GPI trên các dòng tế bào máu. Hiện nay dòng hồng cầu, bạch cầu hạt và bạch cầu đơn nhân được chọn lựa để khảo sát các protein bề mặt này(2). Tại bộ phận Dấu ấn miễn dịch (thuộc Khoa Miễn dịch – Bệnh viện Truyền máu huyết học TP. Hồ Chí Minh), từ tháng 03 năm 2011 đến nay đã bắt dầu áp dụng kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) trên 16 bệnh nhân để tầm soát và chẩn đoán chính xác bệnh PNH. Chúng tôi tổng kết dưới đây một số kết quả thu được từ việc tiến hành phương pháp chẩn đoán này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kế nghiên cứu Phân tích hàng loạt ca. Dân số nghiên cứu Những bệnh nhân thiếu máu tán huyết và suy tủy tại bệnh viện TMHH TP. HCM. Tiêu chuẩn chọn bệnh Bệnh nhân nghi ngờ PNH cần tầm soát bằng flow cytometry theo khuyến cáo của Nhóm vì quyền lợi của bệnh nhân PNH quốc tế (I-PIG)(7): - Tiền sử tiểu huyết sắc tố từng đợt. - Có bằng chứng tán huyết nội mạch Coombs’test âm tính không do hồng cầu hình cầu (phải có mức LDH tăng cao). - Bệnh nhân suy tủy (tầm soát mỗi năm ngay cả khi không có tán huyết nội mạch). - Bệnh nhân chẩn đoán loạn sinh tủy với thể thiếu máu khó chữa (RA) hoặc thể giảm 3 dòng khó chữa (RCMD). - Bệnh nhân có tắc mạch vị trí đặc biệt (thường có bằng chứng tán huyết nội mạch): hội Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 483 chứng Budd-Chiari, tắc tĩnh mạch trong ổ bụng, tĩnh mạch não. Tiêu chuẩn loại trừ Những bệnh nhân không nằm trong tiêu chuẩn chọn bệnh. Kỹ thuật Đối với dòng hồng cầu Pha loãng mẫu máu ngoại vi (được giữ trong ống chống đông EDTA Vaccutainer®) với PBS theo tỉ lệ 1:150 và trộn đều, sau đó đem nhuộm với CD55-APC và CD59-PE khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối, sau đó ly tâm và rửa với PBS 2 lần rồi tạo dịch huyền phù để phân tích. Đối với dòng bạch cầu hạt và dòng mono Sử dụng mẫu máu ngoại vi (được giữ trong ống chống đông EDTA Vaccutainer®) đem nhuộm với các kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang (bao gồm: CD14-FITC/ CD45-Per.CP/ CD55-APC và CD16-FITC/ CD59-PE/ CD45- Per.CP) khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối. Sau đó, loại bỏ hồng cầu bằng dung dịch ammonium chloride và rửa rồi tạo dịch huyền phù để phân tích. Cuối cùng các mẫu đã được xử lý sẽ được thu thập qua hệ thống máy FACS Canto II và được phân tích trên phần mềm FACSDiva verson 2.1 của hãng Becton Dickinson (Mỹ). Phân tích số liệu Sử dụng phần mềm Stata để phân tích thống kê. KẾT QUẢ Bảng 1: Đặc điểm của bệnh nhân Đặc điểm nền Số lượng bệnh nhân (n) 16 Nam (%) 8 (50) Nữ (%) 8 (50) Tuổi lúc chẩn đoán (trung vị) (năm) 22 (19,5 – 40) RBC (x 1012/l) 2,35 ± 0,6 (1,35 – 3,16) Hb (g/dl) 6,67 ± 1,77 (3,7 – 9,3) PLT (x 109/l) 173,8 ± 83 (14 – 308) Đặc điểm nền WBC (x 109/l) 5,06 ± 2,39 (2,76 – 10,56) Bilirubin toàn phần (umol/L) 39,6 (19 – 85,6) Bilirubin trực tiếp (umol/L) 7,96 (5,45 – 10,1) HC hypochronic: (n = 12) +/ ++/ +++ 3/ 1/ 8 Ferritine (ng/ml) 333 (28 – 1142) LDH (U/L) 618 (290 – 1184) Haptoglobin (mg/dL) 0,6 (0,1 – 10,2) ANA: (n = 13) Dương (%) 13 (100) Âm (%) 0 (0) Chẩn đoán: (n = 16) Thiếu máu tán huyết (%) 14 (87,5) Suy tủy (%) 2 (12,5) Bảng 2: Kết quả phân tích Dấu ấn miễn dịch (DAMD) Tỉ lệ dương tính với các CD Dòng hồng cầu Dòng mono Dòng bạch cầu hạt n (%) CD 55 CD 59 CD 55 CD 59 CD 14 CD 55 CD 59 CD 16 <10% 0 (0) 0 (0) 3 (19) 0 (0) 5 (36) 6 (38) 1 (6) 5 (42) 10% - <50% 2 (15) 1 (8) 5 (31)8 (50) 1 (7) 2 (12)7 (44) 0 (0) 50% - <90% 4 (31)5 (38) 1 (6) 7 (44) 1 (7) 0 (0) 4 (25) 0 (0) 90% 7 (54)7 (54)7 (44) 1 (6) 7 (50) 8 (50)4 (25)7 (58) Tổng cộng 13 13 16 16 14 16 16 12 Ghi chú:  90%: bình thường,  50% - <90%: giảm ít,  10% - < 50%: giảm nhiều, < 10%: mất. Dựa vào tỉ lệ dương tính với các CD trên các dòng tế bào máu (hồng cầu, mono và myelo) chúng tôi chia bệnh nhân thành các nhóm theo kết quả Dấu ấn miễn dịch như sau: - Nhóm I: Chưa ghi nhận sự thiếu hụt các CD trên các dòng tế bào máu. - Nhóm II: Ghi nhận sự thiếu hụt đối với 1 loại CD hoặc đối với 1 dòng tế bào máu. - Nhóm III: Ghi nhận sự thiếu hụt từ 2 CD trở lên đối với 2 dòng tế bào máu trở lên. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 484 Bảng 3: Đặc điểm của các bệnh nhân thiếu máu tán huyết và suy tủy Thiếu máu tán huyết n = 14 (%) Suy tủy n = 2 (%) Thiếu máu 14 (100) 2 (100) Giảm tiểu cầu 2 (14) 2 (100) Tiểu Hb 5 (36) 0 (0) Xuất huyết 1 (7) 1 (50) Vàng da niêm 8 (57) 1 (50) Coombs’ test: Âm 13 (93) 2 (100) Dương 1 (7) 0 (0) Hamdacie test: Âm 8 (57) 2 (100) Dương 6 (43) 0 (0) Kết quả DAMD: Nhóm I 0 (0) 1 (50) Nhóm II 6 (43) 1 (50) Nhóm III 8 (57) 0 (0) * Không ghi nhận ca tắc mạch và ca nhiễm trùng nào. Bảng 4: So sánh các đặc điểm của bệnh nhân thiếu máu tán huyết (14 ca) Kết quả DAMD Hamdacie âm Hamdacie dương n = 14 (%) tiểu Hb không tiểu Hb tiểu Hb không tiểu Hb Nhóm I 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) Nhóm II 0 (0) 6 (43) 0 (0) 0 (0) Nhóm III 1 (7) 1 (7) 4 (29) 2 (14) Ngoài ra, chúng tôi ghi nhận được một trường hợp có xét nghiệm Coombs dương, Hamdacie âm và kết quả phân tích Dấu ấn miễn dịch thuộc nhóm II. BÀN LUẬN Trong nghiên cứu của chúng tôi có tổng cộng 16 bệnh nhân, hầu hết trẻ tuổi tập trung ở thập niên thứ 2, thứ 3 của cuộc đời (tuổi trung vị 22). Theo y văn của thế giới bệnh có thể gặp ở tất cả mọi lứa tuổi tập trung ở lứa tuổi 30-40(7). Một nghiên cứu trên 2 dân số Mỹ và Nhật cho thấy lứa tuổi của bệnh nhân Mỹ trẻ hơn châu Á (tuổi trung bình 30 so với 42)(6). Một nghiên cứu khác của Trung Quốc cho thấy tuổi trung bình khởi phát PNH là 34(10). Như vậy so sánh với những số liệu này bệnh nhân của chúng tôi trẻ hơn. Có thể do mẫu khảo sát quá ít (chỉ có 16 bệnh nhân) nên không phản ánh đúng tính chất dịch tễ của bệnh. Ngoài ra có thể do điều kiện môi trường khác biệt mà lứa tuổi của bệnh nhân chúng tôi trẻ hơn. Về phân bố giới tính, tỉ lệ là 1:1 tương đương với các nghiên cứu khác(6,7,10). Đa số những bệnh nhân này thiếu máu mức độ nặng Hb trung bình 6,67g/dl (3,7-9,3g/dl) trong khi dòng tiểu cầu (trung bình 173,8 ± 83) và bạch cầu (trung bình 5,06 ± 2,39) vẫn còn tương đối bình thường. Điều này là do chỉ có 2 ca trong số 16 ca có chẩn đoán ban đầu là suy tủy trong khi 14 ca còn lại được chẩn đoán thiếu máu tán huyết. Các ca PNH điển hình với thiếu máu tán huyết thường có mức tiểu cầu và bạch cầu bình thường(7). Một nghiên cứu ở Mỹ và Nhật cho thấy trị số Hb trung bình là 8,2 ± 0,2 ở người Nhật và 9,2 ± 0,2 g/dl ở người Mỹ(6). Sự khác biệt này có thể là do điều kiện về kinh tế và chăm sóc sức khỏe ban đầu, người Việt Nam thường có sự chịu đựng lâu hơn trước khi đến cơ sở y tế vì vậy mức độ khởi phát bệnh trầm trọng hơn. Những bệnh nhân này có dấu hiệu tán huyết rõ ràng: tăng Bilirubin chủ yếu thành phần gián tiếp, Haptoglobin giảm (trung bình 0,6 mg/dL), LDH tăng (618 U/L). Phết máu ngoại biên chủ yếu hồng cầu nhược sắc không thấy hồng cầu hình cầu. Những đặc điểm này là do 87,5% dân số nghiên cứu có thiếu máu tán huyết. Mặc dù Ferritin trung bình là 333 ng/ml nhưng số ca giảm Ferritin cũng đáng kể (33%). Theo y văn khoảng 25% bệnh nhân PNH có tiểu huyết sắc tố(7). Như vậy 33% ca giảm Ferritin này có thể gián tiếp gợi ý có tiểu huyết sắc tố vì làm mất dần sắt qua đường niệu. Xét nghiệm Coombs’test âm tính (>90%) và ANA âm tính (100%) loại trừ những nguyên nhân miễn dịch. Kết quả này phù hợp với y văn trên thế giới về các đặc điểm cận lâm sàng của các bệnh nhân theo dõi PNH(1,7). Ngoài ra cần lưu ý là biến chứng tắc mạch rất thường gặp trên bệnh nhân PNH không gặp trong dân số nghiên cứu của chúng tôi. Có lẽ là do mẫu quá ít và thời gian theo dõi ngắn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 485 Phân tích kết quả dấu ấn miễn dịch Sự phát hiện thiếu hụt CD55 (46% dòng hồng cầu, 56% dòng mono, 50% dòng bạch cầu hạt) ít hơn so với CD59 (46% dòng hồng cầu, 94% dòng mono, 75% dòng bạch cầu hạt). Điều này cho thấy sử dụng anti CD59 nhạy hơn anti CD55 trong việc phát hiện các dòng tế bào bất thường PNH. Điều này tương tự với một nghiên cứu của tác giả Hall và Rosse năm 1996(4). Tuy nhiên cũng theo nghiên cứu này, người ta chứng minh rằng tỉ lệ CD59 gắn trên bề mặt tế bào máu sẽ bị giảm theo thời gian do protein này dễ bị enzyme phân hủy và dễ tách rời màng tế bào. Như vậy sẽ có một tỉ lệ dương giả khi sử dụng đơn thuần CD59 chẩn đoán. Sự thiếu hụt CD55 và CD59 nhiều hơn ở dòng bạch cầu hạt và nhiều nhất ở dòng đơn nhân. Một số nghiên cứu cũng cho thấy tỉ lệ phát hiện sự thiếu hụt CD55/CD59 ở dòng hồng cầu là thấp nhất(6,8). Điều này có thể do quá trình truyền hồng cầu lắng và tán huyết làm ảnh hưởng đến dòng hồng cầu có đột biến gen PIG-A trong máu. Có 50% tế bào dòng đơn nhân thiếu hụt CD14, 42% bạch cầu dòng hạt thiếu hụt CD16. Như vậy khảo sát CD14 ở dòng đơn nhân và CD16 ở dòng bạch cầu hạt giúp việc tầm soát bệnh PNH tốt hơn, tránh bỏ sót. Vai trò của CD16 cũng được khẳng định trong một số nghiên cứu khác(6,8). Ở 3 dòng tế bào máu khi khảo sát các dấu ấn bề mặt, tỉ lệ thiếu hụt CD từ 10% - 90% dao động từ khoảng 0% (CD16/ dòng bạch cầu hạt) đến cao nhất là 94% (CD59/ dòng đơn nhân) chứng minh mô hình đột biến thể khảm (những clone tế bào có đột biến bên cạnh những clone tế bào bình thường) của bệnh lý PNH(7). Trong 16 ca khảo sát chúng tôi phát hiện 7 ca (44%) có thiếu hụt 1CD trên 1 dòng tế bào. Những ca này cần được theo dõi thêm và kết hợp thêm triệu chứng lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng khác vì ngoài bệnh lý PNH còn có một bệnh lý di truyền gây giảm tế bào CD59 trên dòng hồng cầu(9). Mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng và kết quả phân tích dấu ấn miễn dịch *Trên hai bệnh nhân suy tủy Trong số hai bệnh nhân suy tủy được khảo sát có một trường hợp vàng da, không có trường hợp nào có tiểu Hb, Coombs’test dương, test Ham-Dacie dương. Điều này có nghĩa là chưa có bệnh nhân nào có dấu hiệu bệnh PNH điển hình có tán huyết nội mạch. Bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy, chúng tôi ghi nhận 1 trường hợp thuộc nhóm I, nhóm chưa ghi nhận sự thiếu hụt các CD trên các dòng tế bào, và 1 trường hợp (50%) thuộc nhóm II, nhóm có sự thiếu hụt đối với 1 loại CD hoặc đối với 1 dòng tế bào. Một nghiên cứu năm 1999 ở Tây Ban Nha khảo sát trên 29 bệnh nhân suy tủy cũng cho kết quả 48% có CD55 âm và CD59 bình thường(3). Cũng theo nghiên cứu này tiếp tục theo dõi tế bào dòng chảy có một số ca sẽ tăng dòng tế bào PNH cũng có ca mất hẳn dòng tế bào này sau điều trị. Vậy bệnh nhân thứ hai cần tiếp tục theo dõi vì có thể đây là giai đoạn phát triển chưa đầy đủ của PNH điển hình. Tóm lại, kỹ thuật tế bào dòng chảy giúp phát hiện sớm dòng tế bào PNH trên bệnh nhân suy tủy chưa có biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng gợi ý PNH và theo dõi sự phát triển thành PNH điển hình trong quá trình theo dõi điều trị. Theo hướng dẫn của Clinical Citometry Society (năm 2010) bệnh nhân suy tủy cần được tầm soát PNH mỗi năm một lần. *Trên 14 bệnh nhân thiếu máu tán huyết Trong số 14 trường hợp thiếu máu tán huyết chúng tôi ghi nhận có 2 trường hợp giảm tiểu cầu (14%). Như vậy giảm 2-3 dòng tế bào là triệu chứng có thể gặp ở PNH và có thể biểu hiện đồng thời hoặc trước hoặc sau thiếu máu tán huyết điển hình. Chính vì vậy mà bệnh nhân suy tủy cần được tầm soát mỗi năm như đã đề cập ở trên. Bằng kỹ thuật DAMD, chúng tôi ghi nhận 6 trường hợp (43%) thuộc nhóm II, nhóm có sự thiếu hụt đối với 1 loại CD hoặc đối với 1 dòng tế bào, và 8 trường hợp (57%) thuộc nhóm III, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 486 nhóm có sự thiếu hụt từ 2 CD trở lên đối với 2 dòng tế bào trở lên. Như vậy so với nhóm suy tủy thì kích thước quần thể tế bào đột biến PNH lớn hơn. Chính vì vậy triệu chứng tán huyết nội mạch rõ ràng hơn ở những bệnh nhân này. Trong số 8 bệnh nhân thuộc nhóm III (nhóm được chẩn đoán xác định PNH), chúng tôi ghi nhận 5 bệnh nhân có tiểu Hb (62,5%). Con số này tương đương với nghiên cứu của một tác giả Trung Quốc cho thấy tỉ lệ tiểu Hb/PNH là 61,5%(10). Nghiên cứu của tác giả Nishimura trên 2 quần thể người Mỹ và người Nhật cho thấy tỉ lệ tiểu Hb dao động từ 33,5%-48,4%(6).Sự khác biệt này là do có bệnh nhân suy tủy trong nghiên cứu sau chứ không chỉ thuần nhất bệnh nhân thiếu máu tán huyết. Điều này cho thấy triệu chứng tiểu Hb không phải lúc nào cũng gặp trên bệnh nhân PNH. Vậy nếu ta chỉ nghĩ đến bệnh lý PNH ở những bệnh nhân tiểu đỏ hoặc tiểu màu xá xị thì sẽ bỏ sót rất nhiều chẩn đoán. Cũng trong nhóm này, chúng tôi ghi nhận 6 trường hợp Hamdacie dương tính (75%). Như vậy, xét nghiệm Hamdacie chỉ đặc hiệu trong 75% các trường hợp được chẩn đoán xác định PNH. Tác giả Lê Xuân Hải cũng cho thấy có 30 ca Test Đường-Ham dương tính trong số 45 ca xác định được clone tế bào có thiếu hụt dấu ấn miễn dịch gắn GPI chiếm 67%(5). Dựa vào các yếu tố trên cho thấy việc sử dụng kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) để tầm soát và chẩn đoán PNH là xét nghiệm có tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Do đó chúng ta cần phải bổ sung kỹ thuật tế bào dòng chảy để tầm soát và chẩn đoán PNH trong các trường hợp bệnh nhân nghi ngờ PNH theo khuyến cáo của Nhóm vì quyền lợi của bệnh nhân PNH quốc tế (I-PIG)(7). KẾT LUẬN Việc tầm soát và chẩn đoán PNH là rất quan trọng vì nếu chúng ta chỉ chỉ nghĩ đến bệnh lý PNH ở những bệnh nhân tiểu đỏ hoặc tiểu màu xá xị và có xét nghiệm Hamdacie dương tính thì sẽ bỏ sót rất nhiều chẩn đoán. Trong khi đó, kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch bằng phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) có thể thực hiện chẩn đoán dễ dàng và chính xác bệnh PNH. Phát hiện sự thiếu hụt của một CD trên một dòng tế bào không thể khẳng định chẩn đoán PNH, cần theo dõi thêm nhất là đối với CD59 trên dòng hồng cầu. Ngoài ra cần phải xác định kích thước dòng tế bào PNH vì cần phải theo dõi thêm trong quá trình điều trị. Kích thước quần thể tế bào PNH càng lớn, càng nhiều dòng tế bào đột biến thì triệu chứng PNH càng điển hình. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi vẫn còn trong giai đoạn khởi đầu, trong tương lai cần có những nghiên cứu lớn hơn và thời gian đủ dài để khẳng định chắc chắn giá trị của nó trong việc tầm soát và chẩn đoán bệnh lý này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Borowitz Michael J., Craig Fiona E., DiGiuseppe Joseph A.(2010), Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxymal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry, Clinical Cytometry, vol. 78B, 211-230. 2. Dworacki Grzegorz, Sikora Jan, al Et (2006), Flowcytometric analysis of CD55 and CD59 expression on blood cells in paroxymal nocturnal heamoglobinuria, Folia histochemica et cytobiologica, vol. 43(2), 117-120. 3. Fores R, Alcocer M, Cabrera R (1999), "Detection of PNH clones using flow cytometry in aplastic anemia and paroxymal nocturnal hemoglobinuria", Sangre, vol. 44(3), 199-203. 4. Hall SE, Rosse WF (1996), The use of monoclonal antibodies and flow cytometry in the diagnosis of paroxymal nocturnal hemoglobinuria, Blood, vol. 87, 5332-5340. 5. Lê Xuân Hải, Vũ Thị Tường Vân (2010), kỹ thuật tế bào dòng chảy phân tích CD55/CD59 hồng cầu trong chẩn đoán bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm tại viện Huyết học-Truyền máu trung ương, y học thực hành, (771), 15-18. 6. Nishimura Jun-Ichi, Kanakura Yuzuru, Ware Russell E., et al. (2004), Clinical course and flow cytometric analysis of paroxymal nocturnal hemoglobinuria in the United States and Japan. Medicine, vol. 83(3), 193-207. 7. Parker Charles J (2010), Paroxymal nortunal hemoglobunuria. In Kenneth Kaushansky, A. Litchman Marshall, Beutler Ernest (Eds.), Williams Hematology, McGraw Hill company, 8th ed., pp. 635-646. 8. Wanachiwanawin W, Siripanyaphinyo U, Piyawattanasakul N, et al. (2006), A cohort study of the nature of paroxymal nocturnal hemoglobinuria clones and PIG-A mutations in patients with aplastic anemia, Eur J Haematol, vol. 76(6), 502- 509. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 487 9. Yamashina Manabu, Ueda Etsuko, Kinoshita Taroh, et al.(1990), Inherited Complete Deficiency of 20-Kilodalton Homologous Restriction Factor (CD59) as a Cause of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria, new England journal medicine, vol. 323, 1184- 1189. 10. Zhao Mingfeng, Shao Zonghong, Li Ke (2002), Clinical analysis of 78 cases of paroxymal nocturnal hemoglobinuria diagnosed in the past ten years, Chineses Medical Journal, vol. 115(3), 398-401.