Cơ sở lý thuyết về kỹ thuật vi sinh vật

Chương 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ KỸ THUẬT VI SINH VẬT 1.1. NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT VỀ CÁC LĨNH VỰC VI SINH VẬT VÀ PHÂN LOẠI Vi sinh vật (từ tiếng Hy Lạp mikros - nhỏ, bios - cuộc sống, logos - học thuyết) là một phần của ngành khoa học sinh học nghiên cứu hình thái, sinh hoá và sinh lý, các tính chất có lợi và có hại của vi sinh vật nhằm sử dụng hiệu quả chúng trong hoạt động thực tiển của con người. Quá trình phát triển ngành vi sinh học có liên quan chặt chẽ với hoạt động con người, đã hình thành nên những lĩnh vực vi sinh học độc lập với những định hướng và nhiệm vụ đa dạng. Những lĩnh vực sinh học bao gồm: đại cương, kỹ thuật, y tế, thú y, nông nghiệp, nước, vũ trụ v.v. Trong đó vi sinh đại cương và kỹ thuật vi sinh có tầm quan trọng lớn lao trong đời sống xã hội. Sinh học đại cương nghiên cứu sự phát triển và hoạt động sống của vi sinh vật, vai trò của chúng trong tự nhiên. Những hiểu biết này rất cần thiết khi nghiên cứu các lĩnh vực khác nhau có liên quan đến vi sinh vật. Kỹ thuật vi sinh là sự hoàn thiện các phương pháp thu nhận sinh khối vi sinh vật dạng công nghiệp và các quá trình nuôi cấy chúng. Các phương pháp hợp lý nhằm tổng hợp sản phẩm vi sinh cần thiết cho hoạt động thực tiễn của con người. Việc nghiên cứu các tính chất khác nhau của vi sinh vật đã đẩy mạnh và khám phá ra những loài trước đây chưa biết đến, số lượng các loài ngày càng nhiều dẫn đến sự cần thiết phải phân loại một cách khoa học và có cơ sở. Hiện nay có hai cách phân loại vi sinh vật. Cách thứ nhất theo hệ thống, cách thứ hai dựa theo cấu tạo của nhân vi sinh vật. Theo cách phân loại thứ nhất thì vi sinh vật được xếp trong ngành protophyta. Nó gồm ba lớp Schizomycetes (lớp vi khuẩn), Schizophycecace (lớp thanh tảo), Microtatobiotes (lớp ricketsia và vi rút). Hệ thống phân loại đã được đưa ra như sau: 5 Lớp (Class) Giống (Genus) Bộ (Order) Loài (Species) Bộ phụ (Suborder) Thứ (Variety) Họ (Family) Dạng (Forma, Type) Tộc (Tribe) Nòi (Strain) Nòi là tên gọi vi sinh vật mới phân lập thuần khiết. Năm 1979 nhà sinh vật học Trung Quốc Trần Thế Tương đưa ra hệ thống phân loại 6 giới và 3 nhóm giới sinh vật như sau: I- Nhóm giới sinh vật phi bào: 1- Giới virut. II- Nhóm giới sinh vật nhân nguyên thuỷ: 2- Giới vĩ khuẩn. 3- Giới vi khuẩn lam (hay tảo lam). III- Nhóm giới sinh vật nhân thật: 4- Giới thực vật. 5- Giới nấm. 6- Giới động vật. Đáng chú ý là vi sinh vật tuy rất đơn giản về hình thái nhưng bao gồm các nhóm có đặc điểm sinh lý khác biệt nhau rất xa (hiếu khí, kỵ khí, dị dưỡng, tự dưỡng, hoại sinh, ký sinh, cộng sinh...). Trong khi đó ở các sinh vật bậc cao (thực vật, động vật) tuy có hình thái khác nhau rất xa nhưng lại rất gần gũi với nhau về đặc điểm sinh lý. 1.2. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN VÀ TRONG NỀN KINH TẾ QUỐC DÂN Vi sinh vật sống khắp mọi nơi trên Trái đất, ngay cả nơi mà điều kiện sống tưởng chừng hết sức khắc nghiệt vẫn thấy có sự phát triển của vi sinh vật (ở đáy đại dương, ở nhiệt độ 85 ÷ 900C, ở môi trường có pH = 10 ÷11, trong dung dịch bão hoà muối, đồng hoá dầu mỏ, phenol, khí thiên nhiên...). Trong 1 g đất lấy ở tầng canh tác thường có khoảng 1 ÷ 22 tỉ vi khuẩn; 0,5 ÷ 14 6 triệu xạ khuẩn; 3 ÷ 50 triệu vi nấm; 10 ÷ 30 nghìn vi tảo... Trong 1 m3 không khí phía trên chuồng gia súc thường có 1 ÷ 2 triệu vi sinh vật, trên đường phố có khoảng 5000, nhưng trên mặt biển chỉ có khoảng 1 ÷ 2 vi sinh vật mà thôi. Vi sinh vật sống trong đất và trong nước tham gia tích cực vào quá trình phân giải các xác hữu cơ biến chúng thành CO2 và các hợp chất vô cơ khác dùng làm thức ăn cho cây trồng. Các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện việc biến khí nitơ (N2) trong không khí thành hợp chất nitơ (NH3, ) cung cấp cho cây cối. Vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất khó tan chứa P, K, S và tạo ra các vòng tuần hoàn trong tự nhiên. + 4NH Vi sinh vật còn tham gia vào quá trình hình thành chất mùn. Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân giải các phế phẩm công nghiệp, phế thải đô thị, phế thải công nghiệp cho nên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường. Các vi sinh vật gây bệnh thì lại tham gia vào việc làm ô nhiễm môi trường nơi có điều kiện vệ sinh kém. Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong năng lượng (sinh khối hoá thạch như dầu hoả, khí đốt, than đá). Trong các nguồn năng lượng mà con người hy vọng sẽ khai thác mạnh mẽ trong tương lai có năng lượng thu từ sinh khối. Sinh khối là khối lượng chất sống của sinh vật. Vi sinh vật là lực lượng sản xuất trực tiếp của ngành công nghiệp lên men bởi chúng có thể sản sinh ra rất nhiều sản phẩm trao đổi chất khác nhau. Nhiều sản phẩm đã được sản xuất công nghiệp (các loại axit, enzim, rượu, các chất kháng sinh, các axit amin, các vitamin...). Hiện tại người ta đã thực hiện thành công công nghệ di truyền ở vi sinh vật. Đó là việc chủ động chuyển một gen hay một nhóm gen từ một vi sinh vật hay từ một tế bào của các vi sinh vật bậc cao sang một tế bào vi sinh vật khác.Vi sinh vật mang gen tái tổ hợp nhiều khi mang lại những lợi ích to lớn bởi có thể sản sinh ở quy mô công nghiệp những sản phẩm trước đây chưa hề được tạo thành bởi vi sinh vật. Trong công nghiệp tuyển khoáng, nhiều chủng vi sinh vật đã được sử dụng để hoà tan các kim loại quý từ các quặng nghèo hoặc từ các bãi chứa xỉ quặng. Vi sinh vật có hại thường gây bệnh cho người, cho gia súc, gia cầm, tôm cá và cây trồng. Chúng làm hư hao hoặc biến chất lương thực, thực phẩm, vật liệu, hàng hoá. Chúng sản sinh các độc tố trong đó có những độc tố hết sức nguy hiễm. Chỉ riêng sự tấn công của virut HIV cũng đủ gây ra ở cuối thế kỷ XX khoảng 30 ÷ 50 triệu người nhiễm HIV. 7 1.3. NHỮNG ĐẶC ĐIỂM VỀ HÌNH THÁI VÀ SINH LÝ CỦA CÁC NHÓM GIỚI VI SINH VẬT. 1.3.1. Hình thái và cấu tạo tế bào các vi sinh vật nhân nguyên thuỷ Vi sinh vật nhân nguyên thuỷ bao gồm: Vi khuẩn thật (Eubacteria) và vi khuẩn cổ (Archaebacteria). Trong vi khuẩn thật lại gồm rất nhiều nhóm khác nhau, chủ yếu là vi khuẩn (Bacteria), xạ khuẩn (Actinomycetes), vi khuẩn lam (Cyanobacteria) và nhóm vi khuẩn nguyên thuỷ Micoplatma (Micoplasma), Ricketxi (Ricketsia), Clamidia (chlamydia). 1.3.1.1. Vi khuẩn Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và sắp xếp khác nhau. Đường kính của phần lớn vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2 ÷ 2,0 μm, chiều dài cơ thể khoảng 2,0 ÷ 8,0 μm. Những hình dạng chủ yếu của vi khuẩn là hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có ống, hình có sợi... Ở vi khuẩn hình cầu (cầu khuẩn - coccus) tuỳ theo hướng của mặt phẳng phân cắt và cách liên kết mà ta có: song cầu khuẩn (Diplococcus), liên cầu khuẩn (Strepto- coccus), tứ cầu khuẩn (Graffkya), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus). Ở vi khuẩn hình que- trực khuẩn (Bacillus); Bacterium có thể gặp dạng đơn, dạng đôi, dạng chuỗi... Ở vi khuẩn hình xoắn có dạng hình dấu phẩy: phẩy khuẩn (Vibrio), hình xoắn thưa (Xoắn khuẩn- Spirillum) , hình xoắn khít (Xoắn thể- Spirochaetes). Ngoài ra, còn có thể gặp các hình dạng khác của vi khuẩn (hình khối vuông, khối tam giác, khối hình sao...). Chi Beggiatoa và Saprospira có tế bào nối dài dạng sợi, chi Caryophanon có tế bào hình đĩa xếp lồng vào nhau như một xâu các đồng xu. Tế bào vi khuẩn đều rất nhỏ và rất nhẹ. Một tỉ trực khuẩn đại tràng Escherichia coli mới có 1 mg. Tiên mao (hay lông roi) là những sợi lông dài, uốn khúc, mọc ở mặt ngoài của một số vi khuẩn có tác dụng giúp các vi khuẩn này có thể chuyển động trong môi trường lỏng. Vi khuẩn di động trong môi trường lỏng theo kiểu nào phụ thuộc vào nhiều lý do khác nhau, nhiều khi hoàn toàn là ngẫu nhiên. Cũng không ít trường hợp là do tìm đến hay tránh khỏi một số yếu tố nào đó. Ví dụ tìm đến nguồn thức ăn, tìm tới chỗ có ánh sáng, tránh chỗ có hoá chất độc hại. Vi khuẩn Gram âm (G− ) thường có khuẩn mao, giúp vi khuẩn bám vào giá thể (màng nhầy của đường hô hấp, đường tiêu hoá...). Rất nhiều vi khuẩn G− có khuẩn mao là các vi khuẩn gây bệnh. 8 Thê nhân Khuẩn nanRiboxom Thể ẩn nhập Tiên mao Plasmit Màng tế bào chất Thân tế bào Bao nhầy a) VI KHUẨN Gram dương (G + ) (Arthrobacter crystlopoietes) VI KHUẨN Gram âm (G − ) (Lewthrix mucor) c) b) Peptidoglican Màng tế bào chất Peptidoglican Màng tế bào chất Lipopoll saccarit và chu chất Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn: a- Cấu trúc tế bào vi khuẩn; b- Vi khuẩn G+; c- Vi khuẩn G− So với các sinh vật khác, vi khuẩn có tốc độ sinh sản cao và ở điều kiện tối ưu, sự phát triển nhân đôi tế bào xảy ra trong vòng 20 ÷ 30 phút. Vi khuẩn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vi sinh khi sản xuất axit amin, vitamin, chất bảo vệ thực vật, làm sạch dòng nước thải bằng phương pháp sinh học. Dùng vi khuẩn để sản xuất các chế phẩm protein từ metan và hydro là một trong những hướng có triển vọng. 1.3.1.2. Xạ khuẩn Xạ khuẩn được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Trong mỗi gam đất nói chung thường có trên một triệu xạ khuẩn. Phần lớn xạ khuẩn là tế bào Gram dương, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ti). Trong số 8000 chất khoáng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh ra. Xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzim, một số vitamin và axit hữu cơ. Một số ít xạ khuẩn kỵ khí hoặc vi hiếu khí có thể gây ra các bệnh cho người, cho động vật và cho 9 cây trồng. Một số xạ khuẩn (thuộc chi Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc họ đậu và có khả năng cố định nitơ. Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh. Đường kính khuẩn ti xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2 ÷ 1,0 μm đến 2 ÷ 3 μm. Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn. Màu sắc của khuẩn ti của xạ khuẩn hết sức phong phú. Có thể có các màu trắng, vàng, da cam, đỏ , lục, lam, tím, nâu, đen... Khuẩn ti cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ti khí sinh. ADN re se me ri pm cw cp Hình 1.2. Cấu trúc khuẩn ti ở xạ khuẩn: cp- Tế bào chất; pm- Màng tế bào chât; cw- Thành tế bào; me- Mezoxom; se- Vách ngăn; ri- Riboxom; re: Chất dự trữ Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện các sợi bào tử. Sợi bào tử có thể có nhiều loại hình dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng...Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử bên trong có chứa các bào tử nang. Khuẩn lạc của xạ khuẩn rất đặc biệt, nó không trơn ướt như ở vi khuẩn hoặc nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ , vì vậy mới có tên xạ khuẩn. 1.3.1.3. Vi khuẩn lam Vi khuẩn lam trước đây thường được gọi là tảo lam (Cyanophyta). Thật ra đây là một nhóm vi sinh vật nhân nguyên thuỷ thuộc vi khuẩn thật. Vi khuẩn lam có khả năng tự dưỡng quang năng nhờ chứa sắc tố quang hợp là chất diệp lục . Quá trình quang hợp của vi khuẩn lam là quá trình phosphoryl hóa quang hợp phi tuần hoàn, giải phóng oxy như ở cây xanh. Quá trình này khác hẳn với quá trình 10 phosphoryl hoá quang hợp tuần hoàn không giải phóng oxy ở nhóm vi khuẩn kỵ khí màu tía không chứa lưu huỳnh trong tế bào thuộc bộ Rhodospirillales. Vi khuẩn lam không thể gọi là tảo vì chúng khác biệt rất lớn với tảo: Vi khuẩn lam không có lục lạp, không có nhân thực, có riboxom 7os, thành tế bào có chứa peptidoglican do đó rất mẫn cảm với penixilin và lizozim. Đại bộ phận vi khuẩn lam sống trong nước ngọt và tạo thành thực vật phù du của các thuỷ vực. Một số phân bố trong vùng nước mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nước lợ. Một số vi khuẩn lam sống cộng sinh. Nhiều vi khuẩn lam có khả năng cố định nitơ và có sức đề kháng cao với các điều kiện bất lợi, cho nên có thể gặp vi khuẩn lam trên bề mặt các tảng đá hoặc trong vùng sa mạc. Một số vi khuẩn lam vì có giá trị dinh dưỡng cao, có chứa một số hoạt chất có giá trị y học, lại có tốc độ phát triển nhanh, khó nhiễm tạp khuẩn và thích hợp được với các điều kiện môi trương khá đặc biệt (Spirulina thích hợp với pH rất cao) cho nên đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp để thu nhận sinh khối. Vi khuẩn lam có hình dạng và kích thước rất khác nhau, chúng có thể là đơn bào hoặc dạng sợi đa bào. 1.3.1.4. Nhóm vi khuẩn nguyên thuỷ Nhóm vi khuẩn này có kích thước rất nhỏ bao gồm 3 loại: Micoplatma, Ricketxi và Clamidia. Micoplatma là vi sinh vật nguyên thuỷ chưa có thành tế bào, là loại sinh vật nhỏ nhất trong sinh giới có đời sống dinh dưỡng độc lập. Nhiều loại Micoplatma gây bệnh cho động vật và người. Micoplatma có kích thước ngang khoảng 150 ÷ 300 nm, sinh sản theo phương thức cắt đôi. Chúng có thể sinh trưởng độc lập trên các môi trường nuôi cấy nhân tạo giàu dinh dưỡng, có thể phát triển cả trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nghĩa là có cả kiểu trao đổi chất oxy hoá lẫn kiểu trao đổi chất lên men. Ricketxi là loại vi sinh vật nhân nguyên thuỷ G− chỉ có thể tồn tại trong các tế bào nhân thật. Chúng đã có thành tế bào và không thể sống độc lập trong các môi trường nhân tạo. 11 Hình 1.3. Hình thái chung của vi khuẩn lam: 1- Dạng đơn bào không có màng nhầy; 2- Dạng tập đoàn; 3- Dạng sợi; 4- Hình trụ, hình cầu, hình elip (có màng nhầy); 5- Oscillatoria; 6- Phormidium ; 7- Lyngbya; 8- Schizothrix , Hydrocoleus ; 9- Spirulina, Arthrospira. 10- Dạng sợi có tế bào dị hình; 11- Dạng sợi có bào tử; 12- Sợi dính với bào tử; 13-Sợi ở cách xa bào tử; 14-Tế bào dị hình ở bên cạnh sợi; 15- Nhánh giả đơn độc; 16- Nhánh giả từng đôi một; 17- Sợi phân nhánh thực;18- Phân nhánh ở sợi có bao (nhánh mới nẩy sinh); 19- Phân nhánh ở sợi có bao (nhánh đã phát triển); 20- Phân nhánh bên; 21- Phân nhánh đôi; 22- Phân nhánh dạng chữ V ngược; 23- Vi tiểu bào nang (nannocyst); 24- Sự hình thành ngoại bào tử; 25- Sự hình thành nội bào tử; 26, 27- Hormocyst; 28- Pscudohormogenia; 29- Tảo đoạn (hormogonia); 30- Bào tử nghỉ (akinete) ở hai phía của tế bào dị hình; 31- Bào tử nghỉ ở xa tế bào dị hình; 32- Gloeocapsa; 33- Lyngbya; 34- Oscillatoria; 35- Phormidium; 36- Anabaenopsis; 37- Cylindrospermum; 38- Anabaena. Ricketxi có các đặc điểm sau: 12 - Tế bào có kích thước thay đổi, loại nhỏ nhất 0,25 × 1,0 μm, loại lớn nhất 0,6 × 1,2 μm. - Tế bào có thể hình que, hình cầu, song cầu, hình sợi... - Ký sinh bắt buộc trong tế bào các sinh vật nhân thật. Vật chủ thường là các động vật có chân đốt như ve, bọ, rận... Các động vật nhỏ bé này sẽ truyền mầm bệnh qua người. - Sinh sản bằng phương thức phân cắt thành hai phần bằng nhau. Clamidia là loại vi khuẩn rất bé nhỏ, qua lọc, G−, ký sinh bắt buộc trong tế bào các sinh vật nhân thật. Clamidia có một chu kỳ sống rất đặc biệt: dạng cá thể có khả năng xâm nhiễm được gọi là nguyên thể. Đó là loại tế bào hình cầu có thể chuyển động, đường kính nhỏ bé (0,2 ÷ 0,5 μm). Nguyên thể bám chắc được vào mặt ngoài của tế bào vật chủ và có tính cảm nhiễm cao. Nhờ tác dụng thực bào của tế bào vật chủ mà nguyên thể xâm nhập vào trong tế bào, phần màng bao quanh nguyên thể biến thành không bào. Nguyên thể lớn dần lên trong không bào và biến thành thuỷ thể. Thuỷ thể còn gọi là thể dạng lưới, là loại tế bào hình cầu màng mỏng, khá lớn (đường kính 0,8 ÷1,5 μm). Thuỷ thể liên tiếp phân cắt thành hai phần đều nhau và tạo thành vi khuẩn lạc trong tế bào chất của vật chủ. Về sau một lượng lớn các tế bào con này lại phân hoá thành các nguyên thể nhỏ hơn nữa. Khi tế bào vật chủ bị phá vỡ các nguyên thể được giải phóng ra sẽ xâm nhiễm vào các tế bào khác. 1.3.2. Hình thái và cấu tạo tế bào các vi sinh vật nhân thật (eukaryote) Loại này bao gồm các vi nấm (microfungi), một số động vật nguyên sinh, một số tảo đơn bào. Vi nấm lại được chia thành nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous fungi). Trong phần này chỉ xem xét về vi nấm (cụ thể là nấm men và nấm sợi). Nấm men phân bổ rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp (trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong đất nhiễm dầu mỏ. Loại nấm men nhà máy rượu, nhà máy bia thường sử dụng là Saccharomyces cerevisiae, có kích thước thay đổi trong khoảng 2,5 ÷10 μm × 4,5 ÷21 μm. Tuỳ loài nấm men mà tế bào có rất nhiều hình dạng khác nhau. Có loại nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả. Khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. Có loài có thể tạo thành váng khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể. Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào có chứa các enzim thuỷ phân, poliphosphat, lipoit, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian. Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào. 13 Nấm men có nhiều phương thức sinh sôi nẩy nở: Sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Hình 1.4. Khuẩn ti của nấm Hình 1.6. Sự nẩy mầm bào tử để tạo hệ sợi nấm: 1- Ở nấm Coprinus sterquilinus; 2- Ở nấm Lachnellula willkomii Hình 1.5. Cấu trúc của tế bào nấm: 1- Thể biên; 2- Thành tế bào; 3- Màng tế bào; 4- Nhân tế bào; 5- Hạt nhân; 6- Màng nhân ; 7- Không bào; 8- Mạng lưới nội chất; 9- Hạt dự trữ; 10- Ti thể; 11- Tế bào chất Sợi nấm có vách ngăn Vách ngăn Sợi nấm Sợi nấm không có vách ngăn Nẩy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sối nẩy nở nhanh, hầu như tế bào nấm men nào cũng có chồi. Khi một chồi xuất hiện các enzim thuỷ phân sẽ làm phân giải phần polisacarit của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ. Vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến 14 chồi và làm chồi phình to dần lên, khi đó sẽ xuất hiện một vách ngăn giữa chồi vớí tế bào mẹ. Phân cắt là hình thức sinh sản ở chi nấm men Schizosaccharomyces. Tế bào dài ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào ra thành hai phần tương đương nhau. Mỗi tế bào con có một nhân. Rất nhiều loại nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: bia, rượu, nước giải khát, sinh khối, lipit nấm men, các enzim, một số axit, vitamin B , các axit amin. 2 Tuy nhiên cũng có không ít các nấm men có hại. Có khoảng 13 ÷ 15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người và cho động vật chăn nuôi. Nấm sợi còn được gọi là nấm mốc. Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn chứa chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ấm. Trên nhiều vật liệu vô cơ do dính bụi bặm nấm mốc vẫn có thể phát triển, sinh axit và làm mờ các vật liệu này. Nhiều nấm sợi ký sinh trên người, trên động vật, thực vật và gây ra các bệnh khá nguy hiểm. Nhiều nấm sợi sinh ra các độc tố có thể gây ra bệnh ung thư và nhiều bệnh tật khác. Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rất rộng rãi và tham gia tích cực vào các chu kỳ tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ để hình thành chất mùn. Rất nhiều loài nấm sợi được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm (làm tương, nước chấm, nấu cồn, rượu sakê, axit xitric, axit gluconic...), trong công nghiệp enzim , công nghiệp dược phẩm, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng thực vật, sản xuất sinh khối nấm sợi phục vụ chăn nuôi, sản xuất các bình nấm giống để mở rộng nghề trồng nấm ăn các loại. Các nấm đều có chiều ngang tương tự như đường kính nấm men. Cấu trúc của sợi nấm cũng tương tự như cấu trúc của tế bào nấm men. Bên ngoài có thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong là tế bào chất với nhân phân hoá. Màng nhân có cấu tạo hai lớp và trên màng có nhiều lỗ nhỏ. Trong nhân có hạch nhân. Bên trong tế bào nấm còn có không bào, thể màng biên... Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp nón, dưới chóp nón là một phần có thành rất mỏng, dưới nữa là phần tạo ra thành tế bào và dưới cùng là phần tăng trưởng. Ngọn sợi nấm tăng trưởng được là nhờ phần này.Tiếp phần dưới cùng là phần thành cứng hay còn gọi là phần thành thục của sợi nấm. Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm. Ở phần tăng trưởng sợi nấm chứa đầy nguyên sinh chất với nhiều nhân, nhiều cơ quan tử, nhiều enzim, nhiều axit nucleic. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và sự phân nhánh của sợi nấm. Khi bào tử nấm rơi vào điều kiện môi trường thích hợp nó sẽ nẩy mầm theo cả không gian ba chiều tạo thành hệ sợi nấm hay gọi khuẩn ty thể. Khuẩn ty thể có hai loại: Khuẩn ty cơ chất hay khuẩn ty dinh dưỡng và khuẩn ty ký sinh. Khuẩn ty cơ chất cắm sâu vào môi trường còn khuẩn ty ký sinh phát triển tự do trong không khí. 15 Bó giá Các dạng biến đổi của hệ sợi nấm Thành tế bào có màu xám Biểu bì rỗng Tầng ngoài Tầng trong Hình 1.7. Các dạng biến đổi của hệ sợi nấm và hạch nấm 1.3.3. Virut Virut thuộc loại sinh vật phi tế bào, siêu hiển vi, mỗi loại virut chỉ chứa một loại axit nucleic. Chúng chỉ ký sinh bắt buộc trong các tế bào sống, dựa vào sự hiệp trợ của hệ thống trao đổi chất của vật chủ mà sao chép nucleic, tổng hợp các thành phần như protein...sau đó tiến hành lắp nối để sinh sản; trong điều kiện ngoài cơ thể chúng có thể tồn tại lâu dài ở trong trạng thái đại phân tử hoá học không sống và có hoạt tính truyền nhiễm (theo định nghĩa của giáo sư Chu Đức Khánh ở Đại học Phúc Đán, Trung Quốc). Tuyệt đại đa số virut có kích thước rất nhỏ, có thể lọt qua các nền lọc vi khuẩn. Virut chưa có cấu tạo tế bào, mỗi virut được goi là hạt virut . Thành phần chủ yếu của hạt virut là axit nucleic (AND hay ARN) được bao quanh bởi một vỏ protein. Axit nucleic nằm ở giữa hạt virut tạo thành lõi hay gen của virut. Protein bao bọc bên ngoài lõi tạo thành một vỏ gọi là capsit. Capsit mang các thành phần kháng nguyên và có tác dụng bảo vệ lõi nucleic. Capsit cấu tạo bởi các đơn vị phụ gọi là hạt capsit hay capsome. Lõi và vỏ hộp lại tạo thành một nucleocapsit, đó là kết cấu cơ bản của mọi virut. Một số virut có cấu tạo khá phức tạp, bên ngoài capsit còn có một màng bao có bản chất là lipit hay lipoprotein. Lúc tế bào nhiễm virut, dưới kính hiển vi quang học có thể thấy một đám lớn các hạt virut tập hợp lại với nhau tạo ra các thể bao hàm. 16 Các virut ký sinh trên người hoặc trên các loài động vật, thực vật, vi sinh vật có ích đối với người thường là các virut có hại. Ngược lại cũng có một số virut có ích đó là các loại virut ký sinh trên côn trùng và các động vật có hại khác, cỏ dại và các thực vật có hại khác, các vi sinh vật gây bệnh cho người và các động vật chăn nuôi. 1.4. DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 1.4.1. Thành phần tế bào và dinh dưỡng của vi sinh vật Các chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật là bất kỳ chất nào được vi sinh vật hấp thụ từ môi trường xung quanh và được chúng sử dụng làm nguyên liệu để cung cấp cho quá trình sinh tổng hợp tạo ra các thành phần của tế bào hoặc để cung cấp cho quá trình trao đổi năng lượng. Quá trình hấp thụ các chất dinh dưỡng để thoả mãn mọi nhu cầu sinh trưởng và phát triển được gọi là quá trình dinh dưỡng. Chất dinh dưỡng phải là những hợp chất có tham gia vào các quá trình trao đổi chất nội bào. Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng. Thành phần hoá học của các chất dinh dưỡng được cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa và vi lượng. Lượng các nguyên tố chứa ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Trong các điều kiện nuôi cấy khác nhau, tương ứng với các giai đoạn phát triển khác nhau, lượng các nguyên tố chứa trong cùng một loài vi sinh vật cũng không giống nhau. Trong tế bào vi sinh vật các hợp chất được phân thành hai nhóm lớn: (1) nước và các muối khoáng; (2) các chất hữu cơ. Nước và muối khoáng. Nước chiếm đến 70 ÷ 90 % khối lượng cơ thể vi sinh vật. Phần nước có thể tham gia vào quá trình trao đổi chất của vi sinh vật được gọi là nước tự do. Đa phần nước trong vi sinh vật đều ở dạng nước tự do. Nước kết hợp là phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong tế bào. Nước liên kết mất khả năng hoà tan và lưu động. Muối khoáng chiếm khoảng 2 ÷ 5 % khối lượng khô của tế bào. Chúng thường tồn tại dưới các dạng muối sunfat, phosphat, cacbonat, clorua...Trong tế bào chúng thường ở dạng các ion. Các ion trong tế bào vi sinh vật luôn luôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định, nhằm duy trì độ pH và áp suất thẩm thấu thích hợp cho từng loại vi sinh vật. Chất hứu cơ trong tế bào vi sinh vật chủ yếu được cấu tạo bởi các nguyên tố: C, H, O, N, P, S...Riêng các nguyên tố C, H, O, N chiếm tới 90 ÷ 97% toàn bộ chất khô của tế bào. Đó là các nguyên tố chủ yếu cấu tạo nên protein, axit nucleic, lipit, hydrat- cacbon. Trong tế bào vi khuẩn các hợp chất đại phân tử chỉ chiếm 3,5% , còn các ion vô cơ chỉ có 1%. Vitamin cũng có sự khác nhau rất lớn về nhu cầu của vi sinh vật. Có những vi sinh vật tự dưỡng chất sinh trưởng, chúng có thể tự tổng hợp ra các vitamin cần thiết. Nhưng cũng có nhiều vi sinh vật dị dưỡng chất sinh trưởng, chúng đòi hỏi phải cung cấp nhiều loại vitamin khác nhau với liều lượng khác nhau. 1.4.2. Nguồn thức ăn cacbon của vi sinh vật Căn cứ vào nguồn thức ăn cacbon người ta chia sinh vật thành các nhóm sinh lý tự dưỡng và dị dưỡng. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cácbon được cung cấp có thể là các 17 chất vô cơ (CO , NaHCO , CaCO2 3 3...) hoặc chất hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật. Thường sử dụng đường làm nguồn cacbon khi nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị dưỡng. Trong các môi trường chứa tinh bột trước hết phải tiến hành hồ hoá tinh bột ở nhiệt độ 60 ÷ 700C, sau đó đun sôi rồi mới đưa đi khử trùng. Xenluloza được đưa vào các môi trường nuôi cấy vi sinh vật phân giải xenluloza dưới dạng giấy lọc, bông hoặc các dạng xenluloza . Khi sử dụng lipit, parafin, dầu mỏ... làm nguồn cácbon nuôi cấy một số loài vi sinh vật, phải thông khí mạnh để tạo từng giọt nhỏ để có thể tiếp xúc được với thành tế bào của vi sinh vật. Các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu...) có thể sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật. Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn cacbon rẻ tiền và rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. 1.4.3. Nguồn thức ăn nitơ của vi sinh vật Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH và . +4NH3 Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp đối với nhiều loại tảo, nấm sợi và xạ khuẩn nhưng ít thích hợp đối với nhiều loại nấm men và vi khuẩn. Thường sử dụng muối NH NO4 3 để làm nguồn nitơ cho nhiều loại vi sinh vật. Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên chính là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển. Vi sinh vật còn có khả năng đồng hoá rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật là pepton loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để của một nguồn protein nào đấy. Nhu cầu về axit amin của các loại vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau. 1.4.4. Nguồn thức ăn khoáng của vi sinh vật Khi tạo các môi trường tổng hợp (dùng nguyên liệu là hoá chất) bắt buộc phải bổ sung đủ các nguyên tố khoáng cần thiết. Nồng độ cần thiết của từng nguyên tố vi lượng trong môi trường thường chỉ vào khoảng 10-6÷ 10-8 M. Nhu cầu khoáng của vi sinh vật cũng không giống nhau đối với từng loài, từng giai đoạn phát triển. 1.4.5. Nhu cầu về chất sinh trưởng của vi sinh vật Một số vi sinh vật muốn phát triển cần phải được cung cấp những chất sinh trưởng thích hợp nào đó. Đối với vi sinh vật chất sinh trưởng là một khái niệm rất linh động. Chất sinh trưởng có ý nghĩa nhất là những chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của một loài vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được ra chúng từ các chất khác. Như vậy những chất được coi là chất sinh trưởng của loại vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là chất sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. 18 Thông thường các chất được coi là các chất sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật nào đó có thể là một trong các chất sau đây: các gốc kiềm purin, pirimidin và các dẫn xuất của chúng, các axit béo và các thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường... 1.5. SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT Sinh trưởng là sự tăng kích thước và khối lượng của tế bào, còn phát triển (hoặc sinh sản) là sự tăng số lượng tế bào. Khi nói về sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập tới sinh trưởng và phát triển của một số lượng lớn tế bào của cùng một loài. Do tế bào vi khuẩn quá nhỏ nên việc nghiên cứu chúng gặp nhiều khó khăn. Sự tăng số lượng không phải bao giờ cũng diễn ra cùng với sự tăng sinh khối. Vì vậy cần phải phân biệt các thông số và hằng số khác nhau khi xác định số lượng và khối lượng vi khuẩn. Bảng 1.1. Các thông số và hằng số sử dụng khi xác định số lượng và khối lượng vi khuẩn Các thông số cần xác định Số lượng vi khuẩn Khối lượng vi khuẩn Đơn vị thể tích Nồng độ vi khuẩn (số tế bào/ ml) Mật độ vi khuẩn (sinh khối khô/ ml) Số lần tăng đôi sau một đơn vị thời gian Hằng số tốc độ phân chia C (h Hằng số tốc độ sinh trưởng μ (h−1 −1) ) Thời gian cần thiết cho sự tăng đôi Thời gian thế hệ g (h) Thời gian tăng đôi (h) Tuỳ theo tính chất thay đổi của hệ vi khuẩn có hai phương pháp nuôi cấy vi khuẩn cơ bản: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy liên tục.Trong vi sinh vật học khi nói đến sinh trưởng là nói đến sự sinh trưởng của cả quần thể. Dưới đây chúng ta khảo sát mẫu thí nghiệm lí tưởng để theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nếu số tế bào ban đầu là N thì sau n lần phân chia số tế bào tổng cộng là N: o (1.1) no 2⋅= NN Giá trị n (số thế hệ) có thể tính nhờ logarit thập phân: 2lognNlogNlog o += ( ologlog2log 1 NNn −= ) (1.2) Thời gian thế hệ (g) được xác định theo công thức : o 12 loglog 2log NN tt n tg − −== (1.3) trong đó: t là thời gian vi khuẩn phân chia n lần; t − t2 1 biểu thị sự sai khác giữa thời gian đầu (t ) và thời gian cuối (t ), h. 1 2 19 Hằng số tốc độ phân chia: 12 ologlog 2log 11 tt NN t n g C − −⋅=== (1.4) Rõ ràng, thời gian thế hệ càng ngắn, vi khuẩn sinh trưởng và sinh sản càng nhanh. t nC = nên n = Ct (1.5) Vì Thay giá trị của n vào phương trình (1.1), ta có: (1.6) Cto 2⋅= NN Hằng số tốc độ phân chia C phụ thuộc vào một số điều kiện: loài vi khuẩn, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy. Nhưng không phải bao giờ sinh trưởng cũng diễn ra song song với sinh sản, vì vậy khi nghiên cứu động học trong quá trình nuôi cấy liên tục thường theo dõi sinh trưởng và sinh sản của quần thể vi khuẩn bằng một tiêu chuẩn khác. Thay cho hằng số tốc độ phân chia (C) ở đây chúng ta dùng hằng số tốc độ sinh trưởng (μ). Như vậy trong một khoảng thời gian dt đã có một sự tăng dX của sinh khối vi khuẩn tỷ lệ với X và μ. Nghĩa là: X t X ⋅= μ d d (1.7) X X t d1d ⋅⋅= μ Tích phân phương trình trong giới hạn (Xo, X) và (0, t), ta có: (1.8) to μ⋅= eXX Ở đây X là lượng sinh khối ban đầu. o t XlnXln o−=μVì Và chuyển sang logarit thập phân ( ) 12 olglg3022 tt XX , − −=μ (1.9) Nếu lượng sinh khối (X , X) biểu thị bằng số tế bào (No o, N) ta sẽ xác định được mối quan hệ qua lại giữa hằng số tốc độ sinh trưởng (μ) , hằng số tốc độ phân chia (C) và thời gian thế hệ (g). Kết hợp các phương trình (1.4) và (1.9), ta có : g ,C, 690690 ==μ (1.10) 1.5.1. Sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuôi cấy tĩnh Phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó người ta không bổ sung thêm chất dinh dưỡng và cũng không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của sự trao đổi chất gọi là nuôi cấy tĩnh (quần thể tế bào bị giới hạn trong một khoảng thời gian nhất định). Sự 20 sinh trưởng trong một “hệ thống động” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc [theo các pha lag (pha mở đầu), pha log, pha ổn định và pha tử vong]. 1.5.1.1. Pha lag Pha này tính từ lúc bắt đầu cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha lag vi khuẩn chưa phân chia nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình tổng hợp các chất trước hết là các hợp chất cao phân tử (protein, enzim, axit nucleic) diễn ra mạnh mẽ. Độ dài của pha lag phụ thuộc trước hết vào tuổi của ống giống và thành phần môi trường. Thường tế bào càng già thì pha lag càng dài. Việc tìm hiểu độ dài của pha lag là cần thiết trong việc phán đoán đặc tính của vi khuẩn và tính chất của môi trường. Để thuận tiện cho việc tính toán người ta chuyển các phương trình này thành các phương trình đường thẳng bằng cách sử dụng logarit: to t1 ti tr h log2N 1 2 Hình 1.8 .Đồ thị biểu diễn pha lag: 1- Đường thẳng lý tưởng; 2- Đường thẳng thực tế; (r- Thực tế; i- Lý tưởng) h log2Ni = log2Nr = oN CtN ln2lnln += olnNt += μ Và = o222 loglog log NeN += μ o2log NCt += Pha lag được coi như là khoảng cách thời gian giữa đường thẳng thực nghiệm (hoặc thực tế) và đường thẳng lý tưởng song song với nó khi mà vi khuẩn, giả dụ không phải trải qua pha lag. Gọi thời gian của pha lag là TL, ta có : ir ttTL −= = (1.11) o1 tt −= Phương trình của đường thẳng lý tưởng là: 0ii loglog NCtN += ri loglog NN =Vì: Có thể viết: oir loglog NCtN += ior loglog CtNN =− C NN t ori loglog −= 21 Thay giá trị của t vào phương trình (11), ta có : i C NN tTL orr loglog −−= Như vậy trong vùng sinh tưởng logarit ,chỉ cần chọn một giá trị tr thích hợp và nếu biết được giá trị Nr tương ứng cùng với hằng số tốc độ phân chia C, ta có thể tính được độ dài của pha lag TL . Tuy nhiên thời gian vật lý (h) không phải là giá trị đo thích hợp của pha lag. Vì vậy người ta thường đo pha lag bằng đơn vị thời gian sinh học như thời gian tăng gấp đôi, thời gian thế hệ, hằng số tốc độ sinh trưởng. Biết thời gian thế hệ (g) ta có thể xác định độ dài thời gian của pha lag (TL) gấp mấy lần thời gian thế hệ. Đại lượng này gọi là lag sinh trưởng. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến pha lag, nhưng ba yếu tố đáng chú ý nhất gồm: tuổi cấy giống, lượng cấy giống (trong công nghiệp lên men, tỷ lệ cấy giống thường ở mức 1/10) và thành phần môi trường. 1.5.1.2. Pha log Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa, nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình: N = No.2ct hay X = Xo.Cμt. Trong pha này kích thước của tế bào, thành phần hoá học, hoạt tính sinh lý... không thay đổi theo thời gian. Nếu lấy trục tung là logarit của số tế bào thì đường biểu diễn sinh trưởng theo luỹ thừa của vi khuẩn sẽ là đường thẳng. Vì pha sinh trưởng theo luỹ thừa của vi khuẩn được biểu diễn bằng sự phụ thuộc theo đường thẳng giữa thời gian và logarit của số tế bào nên pha này được gọi là pha logarit. Thường dùng logarit cơ số 2 là thích hợp hơn cả vì sự thay đổi một đơn vị của log2 trên trục tung chính là sự tăng đôi số lượng vi khuẩn và thời gian cần để tăng một đơn vị của log lại là thời gian thế hệ. 2 Thời gian thế hệ (hoặc thời gian tăng đôi) g, hằng số tốc độ phân chia C và hằng số tốc độ sinh trưởng μ là ba thông số quan trọng của pha log. Các hằng số C và μ có thể tính được từ phương trình: ( )122 1222 log loglog tte XX − −=μ Trong điều kiện thí nghiệm có thể điều chỉnh sao cho tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn chỉ mẫn cảm, nghĩa là chỉ phụ thuộc vào một yếu tố. Trong trường hợp như vậy yếu tố đã cho là yếu tố hạn chế tốc độ sinh trưởng. Chất dinh dưỡng hạn chế có thể là đường, axit amin, chất vô cơ. Mối quan hệ giữa các hằng số C và μ với nồng độ chất dinh dưỡng hạn chế được biểu diễn qua các phương trình: [ ] [ ]SK SCC += Smax 22 [ ] [ ]SK S += Smax μμVà trong đó: C và μ - hằng số tốc độ phân chia và hằng số tốc độ sinh trưởng cực đại; max max - hằng số bão hoà và [ ]S K là nồng độ chất dinh dưỡng hạn chế. S 1.5.1.3. Pha ổn định Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học. Số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả là số tế bào và cả sinh khối không tăng cũng không giảm. Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của trao đổi chất và việc cạn kiệt chất dinh dưỡng. Sự tăng sinh khối tổng cộng tỷ lệ thuận với nồng độ ban đầu của chất dinh dưỡng hạn chế. G = K.C trong đó: G - độ tăng sinh khối tổng cộng; C - nồng độ ban đầu của chất dinh dưỡng hạn chế; K - hằng số hiệu suất: C GK = Hằng số hiệu suất K thường được biểu thị bằng số miligam chất khô đối với 1 mg chất dinh dưỡng. Đối với các loại đường, K thường dao động trong khoảng từ 0,20 đến 0,30 nghĩa là từ 100 g đường được tạo thành 20 ÷ 30 mg khối lượng khô của tế bào. Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và số lượng các chất dinh dưỡng sử dụng và vào điều kiện nuôi cấy. Đó là sự sai khác giữa số lượng vi khuẩn cực đại và khối lượng vi khuẩn ban đầu (hình 1.9 ): X = X − Xε max o Tỷ lệ sản lượng của tế bào đối với lượng cơ chất tiêu dùng có ý nghĩa rất quan trọng. Nếu biểu thị cả hai đại luợng thành đơn vị khối lượng và sẽ gọi tỷ lệ này (X/S) là hệ số kinh tế (Y). Nếu tính sản lượng ra gam và cơ chất tiêu dùng ra mol thì được gọi là hệ số kinh tế mol (Ym). Nếu biết con đường phân huỷ cơ chất đã cho và hiệu suất ATP do kết quả của sự phân huỷ này, có thể tính được sinh khối vi khuẩn (gam) đối với 1 mol ATP. Ta gọi đó là hệ số năng lượng (Y logX logXmax logXo logX Hình 1.9 .Tính sản lượng của vi khuẩn t ATP). 1.5.1.4. Pha tử vong Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo luỹ thừa. Chưa có một quy luật chung cho pha tử vong. 23 Sự chết của tế bào có thể nhanh hay chậm, có liên quan đến sự tự phân hay không tự phân. Trong trường hợp môi trường tích lũy các axit là nguyên nhân làm chết tế bào tương đối rõ thì nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết và hậu quả là giảm hoạt tính trao đổi chất, phân huỷ dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết hàng loạt của tế bào. Ngoài đặc tính của bản thân chủng vi sinh vật, tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích luỹ lại cũng ảnh hưởng đến tiến trình của pha tử vong. 1.5.2. Sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy liên tục Trong thực tiển sản xuất cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong pha log. Dĩ nhiên ở một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần vào môi trường dinh dưỡng mới. Đơn giản hơn nên đưa liên tục môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi khuẩn. Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong các thiết bị nuôi cấy liên tục. Giả sử có một bình nuôi cấy trong đó vi khuẩn đang sinh trưởng, phát triển. Liên tục bổ sung vào bình môi trường mới có thành phần không đổi. Thể tích bình nuôi cấy không đổi, nghĩa là lượng môi trường được bổ sung cân bằng với lượng môi trường đi ra cùng tốc độ. Gọi thể tích bình là V (lít), tốc độ dòng môi trường đi vào là f (lít/h) thì tốc độ pha loãng (hệ số pha loãng) D sẽ là f/V. Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ. Nếu vi khuẩn không sinh trưởng và phát triển, chúng sẽ bị rút khỏi bình nuôi cấy với tốc độ: DX t xV =−=− d d trong đó : X - là sinh khối tế bào, g/l. Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi khuẩn trong bình được biểu diễn bởi phương trình: X t xV μ==+ d d Tốc độ thay đổi cuối cùng (tăng hoặc giảm) mật độ vi khuẩn trong nuôi cấy liên tục là sự sai khác giữa tốc độ tăng +V và tốc độ giảm −V : ( )XD t xVVV −==−= −+ μ d d Nếu μ > D thì giá trị V = dx/dt có giá trị dương, nghĩa là mật độ vi khuẩn trong bình tăng, ngược lại nếu μ < D, V sẽ có giá trị âm và mật độ vi khuẩn trong bình giảm. Trong trường hợp đặc biệt μ = D, ta có V = 0, nghĩa là mật độ tế bào không tăng không giảm theo thời gian, quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học. Nếu bình thí nghiệm có thiết bị duy trì sao cho μ luôn luôn bằng D, ta sẽ thu được quần thể vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa thường xuyên ở mật độ tế bào không đổi và không phụ thuộc vào thời gian. Trong trường hợp như vậy không những kích thước trung bình của tế bào mà cả môi trường nuôi cấy đều không đổi và không 24 phụ thuộc vào thời gian. Điều này, một mặt tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sinh trưởng và sinh lý của tế bào vi khuẩn, mặc khác cải thiện quá trình sản xuất sinh khối vi sinh vật ở quy mô công nghiệp. Nuôi cấy tĩnh được coi như hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng trong đó phải trải qua các pha mở đầu, logarit, ổn định và tử vong. Mỗi pha sinh trưởng được đặc trưng bởi những điều kiện nhất đinh. Việc tự động hoá các pha là khó thực hiện. Nuôi cấy liên tục, trái lại, là hệ thống mở có khuynh hướng dẫn đến việc thiết lập một cân bằng động học. Yếu tố thời gian ở đây, trong phạm vi nhất định, bị loại trừ. Tế bào được cung cấp những điều kiện không đổi, nhờ việc điều chỉnh tự động. Có thể biểu thị bằng toán học quá trình nuôi cấy liên tục một cách đơn giản như sau: G o d d d d ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛−+−=⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛⋅ t xVQXQX t xV V - thể tích dịch nuôi, l. Q - hệ số dòng chảy, l/ h. G - biểu thị tăng trưởng. Cd d d d ⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛−+−=⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛⋅ t sVQSQS t xV o C - biểu thị tiêu hao. X Y X t x X t xt s C μ SX 1 d d1 d d 1 d d −=⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛ ⋅⋅ ⎟⎟ ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎜⎜ ⎝ ⎛ −=⎟⎠ ⎞⎜⎝ ⎛−Bởi vì Y = g sinh khối/ g cơ chất. x/S 0 d d = t sThay thế vào và coi , ta có : SS X s xY −== 0SX d d Ở trạng thái ổn định, hiệu suất sinh trưởng có thể biểu đạt bằng lượng sinh khối X và nồng độ cơ chất S. Theo mô hình của Monod thì: ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −= +== Dm DKS SK SmD μ μμ S S Thay thế vào công thức tính YX/S, ta có: ( ) ⎥⎦ ⎤⎢⎣ ⎡ ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −−=−= Dm DKSYSSYX μSoSXoSX Suy ra đơn vị thời gian để thu được sinh khối là: 25 ⎥⎦ ⎤⎢⎣ ⎡ ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ −−= Dm DKSDYD Sx μSoX Đồng thời có thể biết được lúc: ⎟⎟⎠ ⎞ ⎜⎜⎝ ⎛ +−= oS S m 1 Sk k mD μ thì D X là sinh khối cực đại. 26