Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm  Bài tiểu luận Lớp 08DTP06 Sinh viên thực hiện : 1/ Nguyễn Lê Hoàng 2/ Hoàng Ngọc Duy Quang 3/ Nguyễn Thị Kim Vân 4/ Nguyễn Ngọc Trung 5/ Lê Nguyễn Nhân Luân Tháng 5/2010 - 1 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 MỤC LỤC Giới thiệu chung .............................................................................................3 A. Giới thiệu I. Khái niệm Enzyme ......................................................................................4 II. Enzyme Amylase là gì ...............................................................................4 III. Lịch sử phát hiện .......................................................................................5 B. Tổng quan về Enzyme Amylase I. Phân loại .....................................................................................................6 II. Hệ Enzyme Amylase ..................................................................................7 1. Enzyme α -Amylase ...............................................................................7 2. Enzyme β -Amylase ................................................................................11 3. Enzyme γ -Amylase ................................................................................13 4. Oligo 1,6-glucosidase ............................................................................14 5. Enzyme pullulanase ...............................................................................15 6. α-glucosidase hay maltase .....................................................................14 III. Cơ chất ......................................................................................................15 1. Tinh bột ..................................................................................................15 2. Glycogen ................................................................................................16 IV. Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase ..................................17 1. Nguồn thu nhận .....................................................................................17 2. Thu nhận Enzyme Amylase từ thực vật ................................................19 3. Thu nhận Enzyme Amylase từ vi sinh vật .............................................22 V. Phương pháp xác định hoạt độ ...................................................................28 1. Đơn vị đo hoạt độ ..................................................................................28 2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva ......................28 3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ -Amylase ) ........................29 4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận Amylase có hoạt lực cao ...................29 C. Ứng dụng Enzyme Amylase I.Ứng dụng trong sản xuất Bia ........................................................................3 3 II.Ứng dụng trong sản xuất Bánh mì ..............................................................3 7 III. Ứng dụng trong sản xuất Siro ....................................................................3 8 IV.Ứng dụng trong sản xuất cồn .....................................................................4 1 V. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo ............................................................42 VI.Ứng dụng trong sản xuất Glucose và Mật .................................................4 3 VII.Ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc .................................................4 3 VIII. Ứng dụng trong công nghiệ p dệt ...........................................................43 Tài liệu tham khảo .....................................................................................4 5 - 2 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Giới thiệu chung Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Người La Mã gọi là amilum, một từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon ). Trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính trong thực phẩm. Ngoài ra tinh bột còn giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do những tính chất hóa lý của chúng. Tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho các thực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, là các yếu tố kết dính và làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm. Bên cạnh đó, tinh bột còn được dùng trong các ngành công nghiệp khác như sản xuất giấy, rượu, .... Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,… Trước đây người ta hay dùng acid hoặc H2SO4 để thủy phân tinh bột. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong khi giá thành lại cao. Cho nên hiện nay để thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng Enzyme Amylase thu nhận từ thực vật hoặc các loại vi sinh vật. Ngoài ra, Amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột như năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn Amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó Amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia. Nguyên liệu cho sản xuất Enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Cho nên đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh có thể làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. - 3 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 A. Giới Thiệu I. Khái niệm Enzyme: Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ mội trường. II. Enzyme Amylase là gì? Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. RR’ + H-OH  RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men. Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. - 4 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 III. Lịch sử phát hiện 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C. Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột được gọi là Amylase. Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu. Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc. Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000. Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β -Amylase là 250000. Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme α-Amylase. Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canh trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và transglucosilase. Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme, trong đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển,... đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất Enzyme nổi tiếng trên thế giới. Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nước Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme. Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông Amylase thường được sản xuất từ nấm mốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột. Như hãng Novo đã có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy… - 5 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 B. Tổng quan về Enzyme Amylase I . Phân loại : Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ). - Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6- glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. - Exoamylase. Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có: + β-Amylase (EC 3.2.1.2) + Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3) Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase * Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase: - Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt - Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau. - 6 – Amylase Exoamylase β-Amylase γ-Amylase Endoamylase Enzym khử nhánh α-Amylase Khử trực tiếp α-dextrin 6-glucanohydrolase (pullulanase) Khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase (transglucosylase) Và amylo 1,6-glucosidase Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 - Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau. I I. Hệ Enzyme Amylase: 1. Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): a) Cấu tạo: Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau. Cấu trúc không gian của α-Amylase b) Cơ chế tác dụng của α-Amylase: α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm. - 7 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn: + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). + Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α- Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 ). + Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose c) Đặc tính α-Amylase α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu tyrosine, - 8 – α-Amylase Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme: + α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. + Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 ). + Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. + Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). α-Amylase là một metaloEnzyme. Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α- Amylase. Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain... Thành phần amino acid của α-Amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ; Isoleucine = 5,2 ; prolin = 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan = 4,0; xetin = 6,5 ; trionin = 10,7 ; cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ; amide = 1,5 ( Akabori et amilose 1954 ). Không giống các α-Amylase khác, Amylase của Asp.orysee có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexosemin trên 1 mol Enzyme ( Akabori et amilose, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử Enzyme. α-Amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân Amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) . Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau: - 9 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 G5 G4 + G1; G6  G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít ) α-Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-Amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%. Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm Amylase từ Asp.orysee trong vùng 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-Amylase của Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5 ; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 0oC và pH= 2,5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. - 10 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-Amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-Amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 700C ( Kozmina, 1991 ). Trong dung dịch đệm pH = 4,7 , α-Amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-Amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ). Một số tính chất của α-Amylase từ vi sinh vật Tên vi sinh vật pHopt Topt Phân tử lượng (kD) Bacillus acidocaldarius 3,5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4,5 – 6,5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5,3 – 6,4 50 47 Acinetobacter sp.I 7,0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7,0 50 – 55 65 Bacteroides amylophilus 6,3 43 92 Micrococcus halobius 6,0 – 7,0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5,0 – 6,0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4,6 – 5,3 40 40 Thermonospora curvata 5,5 – 6,0 65 62 Aspergillus prysee 5,5 – 5,9 40 52 Mucor pusillus 3,5 – 4,0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5,5 40 38 Schwaniomyces castellii 6,0 60 40 2. Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase) (EC 3.2.1.2): a) Cấu tạo: β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm. Ở trong các hạt ngũ cốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh bột , glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch . Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β. Ở ngũ cốc, β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô. Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và có khối lượng phân tử là 59.000 Da . b) Cơ chế tác dụng của β-Amylase: - 11 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất . β-Amylase phân cắt các liên kết α- 1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin. Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột Tinh bột - amylase β → maltose (54-58%)+ β-dextrin(42-46%) (glucogen) Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%. c) Đặc tính của β-Amylase: β-Amylase là một albumin , tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme ) β-Amylase không bền khi có Ca2+, β-Amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodineoacetamide, iodine, ozon… β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid. β-Amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C. Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C , pH 5,1 – 5,5. Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron. Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động. Sau đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme. Các đặc tính của β-Amylase Nguồn gốc Enzyme pHopt Topt Phân tử lượng (kD) Đại mạch 5,2 - 56 Lúa mì 5,2 – 5,6 55 64,2 Đỗ tương 5,4 55 57 Khoai lang 5,0 – 6,0 50 – 55 50 B.cerus 7,0 40 58 B.polymyxa 7,5 40 42 B.megaterium 6,5 40 - 65 58 3. Enzyme γ-Amylase (glucoamylase) (EC 3.2.1.3): a) Cấu tạo: γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β. - 12 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus, penicillium và Rhizopus Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của Enzyme Nói chung thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa gốc cystein. Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi acid amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của Enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ tất cả các amyloglucosidase từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5 - 20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono saccharid glucose mannose, galactose và glucosamin Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoEnzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này . b) Cơ chế hoạt động: Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ). Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kích thuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân . Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit. c) Tính chất: Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: α-1,4 ; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase; taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào. Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside . Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin , dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả các loại Enzyme khác. Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so - 13 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 với các chất có phân tử nhỏ. Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β- dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh. Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng có pH 3,5 – 5,5 và nhiệt độ 500C . Nó bền với acid hơn α-Amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không được bảo vệ bởi Ca2+. 4. Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn) (EC 3.2.1.10) Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được. Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thời cũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ). Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R– Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6- glucocanhydrolase. Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase và β-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn . Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 400C và pH tối thích là 5,1. 5. Enzyme pullulanase (α-dextrin6-glucosidase) (EC 3.2.1.41) Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pululan và các dextrin tới hạn. Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của Enzyme. Đặc biệt là sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho Enzyme phân cắt liên kết này Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4. Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside. Tác dụng hiệp đồng của α-Amylase và pullulanase làm nó bị thủy phân hoàn toàn. 6. α-glucosidase hay maltase (α-D,glucoside-glucohydrolase) (EC 3.2.1.20) Nhiều loại nấm sợi sản sinh Enzyme này. Giống như glucomylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột. Maltase và glucozyltranferase là một Enzyme đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucoside sang đường và rượu. II I. Cơ chất: Cơ chất tác dụng của Amylase là tinh bột và glucose. - 14 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 1. Tinh bột: là nhóm Cacbonhydrat ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì…, trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n . Hạt tinh bột có hình dáng rất khác nhau với kích thước từ 2 đến 15µm. Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 – 1,648. - Tinh bột là chất keo háo nước điển hình cấu tạo từ amylose – mạch thẳng và amylopectin. Tỷ số amylose và amylopectin trong tinh bột thường vào khoảng 1 : 4. Cả hai đều tạo những gốc α-D-glucose. Amylo có cấu tạo mạch thẳng. Chúng được liên kết bởi các nối α-1,4 glucozit và α-1,6 glucozit nên tạo thành nhiều nhánh. Ngoài amylose và amylopectin trong tinh bột còn có chứa một lượng nhỏ các chất khác như muối khoáng, chất béo, protit… Hàm lượng chung của chúng khoảng 0,2 – 0,7%. - Tinh bột không hòa tan trong nước lạnh, trong rượu và ete. Amylose dễ tan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch. Amylopectin khi hòa tan trong nước nóng tạo dung dịch rất nhớt. - Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel. Mức độ trương của tinh bột phụ thuộc nhiệt độ. Khi tăng dần nhiệt độ, dịch tinh bột sẽ biến thành dạng keo và gọi là hồ tinh bột. Nhiệt độ làm cho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi là nhiệt độ hồ hóa của tinh bột. Trong thực tế luôn luôn tồn tại một giới hạn nhiệt độ hồ hóa, vì tinh bột của nguyên liệu bất kì đều gồm nhiều hạt có kích thước khác nhau. + Amylose: có cấu tạo chuỗi không phân nhánh, mạch thẳng cấu tạo từ các gốc α–D- glucopyranosyl, liên kết với nhau bởi gốc α-1,4 glucoside, dài khoảng 300 – 1000 gốc glucose, xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc glucose tạo thành hình lục giác. Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH tự do . Bên trong xoắn có thể kết hợp với các nguyên tử khác. Cùng với amylopectin, các phân tử amylose tham gia tạo nên cấu hình hạt tinh bột ở thực vật. Ví dụ Amylose tạo thành màu xanh khi tác dụng với Iodine, nếu đun nóng liên kết hidro bị cắt đứt, chuỗi amylose bị duỗi thẳng do bị tách ra khỏi amylose dung dịch mất màu xanh. Amilose thường được phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột. Dung dịch amylose có độ nhớt thấp hơn dung dịch amilopectin. Amylose bị kết tủa bởi ancol butylic. + Amylopectin: Là một polyme mạch nhánh, được cấu tạo từ các gốc α-D- glucopyranosyl liên kết với nhau bởi α-1,4 và α-1,6 glucozit. Mức độ polyme hóa tử amylopectin có thể lên đến giá trị hàng triệu. Cấu trúc phân mạch của nó bao gồm 1 nhánh trung tâm ( chứa liên kết 1-4 ) từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose . Khối lượng phân tử của amylopectin khoảng 500000 - 1 triệu. Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạt tinh bột. Dung dịch amylopectin có độ nhớt cao, - 15 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 khi đun nóng làm thay đổi sâu sắc và không thuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây ra trạng thái hồ hoá tinh bột. Tinh bột có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme Amylase hoặc acid tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn gọi là dextrin. Các dextrin này có thể bị thuỷ phân hoàn toàn tạo thành các gốc glucose. Như vậy sản phẩm thuỷ phân hoàn toàn tinh bột là glucose tuy nhiên ở những điều kiện xác định, dưới tác dụng của Enzyme disaccharit mantose lại là sản phẩm chủ yếu trong sản phẩm thuỷ phân tinh bột. Cấu trúc của Amylose và Amylopectin 2. Glycogen : Glycogen cũng thuộc glucan, là polysaccharide dự trữ ở người và động vật. Phân tử glycogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũng phân nhánh giống như phân tử amilopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn. Phần lớn các gốc glucose trong phân tử kết hợp với nhau qua liên kết α -1,4 glucozit , liên kết α-1,6-glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glycogen bị thuỷ phân dưới tác dụng của Enzyme amylase hoặc acid. Khi thuỷ phân hoàn toàn glycogen nhận được α-D-glucose. Glycogen hoà tan trong nước nóng, cho màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với iot Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 – 3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người glucogen chủ yếu tập trung ở gan. - 16 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột của các Enzyme Amylase IV. Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase: 1. Nguồn thu nhận: Enzyme Amylase có trong các tế bào sinh vật , động thực vật , các loại nấm mốc. Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào. Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào như nhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào, để đi vào dung dịch chiết. Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào. Việc phá vỡ cấu trúc tế bào có thể sử dụng một số cách sau : + Biện pháp cơ học như nghiền xay với bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy xay đồng hoá… + Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat … + Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV… Sau khi nghiền nhỏ Enzyme được chiết rút bằng nuớc hay dung dịch đệm thích hợp, hoặc dung dịch muối trung tính … Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác như protein phi Enzyme, muối, gluxit … Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận Enzyme có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều phương pháp tinh sạch Enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả : - 17 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 + Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm. Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua . Các chất có trọng lượng phân tử lớn bị giữ lại (Enzyme , protein... ). + Để loại prôtein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ , sắc kí trao đổi ion , điện di lọc gel… a) Động vật: Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết. Thu nhận Amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng. b) Thực vật: Được lấy từ nhiều nguồn như: - Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc. - Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á - Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin c) Vi sinh vật: Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu Enzyme Amylase chủ đạo. Những chủng VSV tạo nhiều Amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên. VSV tạo Amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. - Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus - Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces. Endomycopsy, Endomyces cũng tạo Amylase. - Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi - 18 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 nuôi chúng ít bị nhiễm VSV khác. Đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. circulans - Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ α-Amylase hoạt động ở 650C cùng với proteinase và các Enzyme khác. 2. Thu nhận Enzyme từ thực vật: a) Malt đại mạch: Malt là từ chỉ trạng thái hạt nảy mầm . Quá trình sản xuất malt gồm các bước sau : Ngâm hạt, ủ hạt cho nảy mầm, sấy malt tươi, tách mầm, bảo quản malt khô . * Yêu cầu về nguồn nguyên liệu - Hạt có màu vàng vàng óng ánh , thơm mùi rạ tươi . - Hạt phải thuần , tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được chiếm 5% . Không có hạt bị bệnh - Vỏ hạt < 7-9% trọng lượng hạt . Trọng lượng 1000 hạt khoảng 40-44g . - Sức nảy mầm ( qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm ) : 80 -90% - Khả năng nảy mầm ( tính đến ngày thứ 5 của quá trình nảy mầm : > 95% ) - Độ ẩm của hạt khoảng 15% - Dung trọng : 650 – 680g/l - Hàm lượng protein : 9 – 12% - Hàm lượng tinh bột > 63 – 65% * Sản xuất Malt Các bước trong quy trình sản xuất malt đại mạch : Đại mạch ----- > làm sạch ------ > sấy bảo quản ------ > ngâm hạt ------- > ủ mầm ------ > malt tươi ------ > sấy malt ----- > tách mầm rễ ------ > malt khô Ngâm Hạt : Đại mạch được ngâm trong nước sạch cho đến khi đạt đến sự cân bàng về độ ẩm. Chú ý đến sự thông khí trong khối hạt bằng cách đảo trộn khối hạt thường xuyên. Mục đích của giai đoạn này là tạo độ ẩm cho hạt có điều kiện lấy đủ oxy, đẩy CO2 và các sản phẩm bất lợi cho quá trình nảy mầm của hạt ra ngoài khối hạt . Khi ngâm hạt, nước sẽ ngấm vào hạt làm cho thể tích hạt tăng nên, các Enzyme đang ở trạng thái không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động và hoạt tính của Enzyme sẽ mạnh dần và thuỷ phân các chất dự trữ có phân tử lượng cao ở trong hạt thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn như đường , amino acid . Vì vậy , cần phải luôn luôn chú ý đến sự thông khí , độ ẩm của hạt và nhiệt độ . - 19 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Hạt đại mạch khô hầu như không có hoạt lực của α-Amylase. Khi hạt chuẩn bị nảy mầm thì xuất hiện hoạt lực của α-Amylase và hoạt lực này tăng dần. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 của quá trình nảy mầm ( nhiệt độ18 – 200C), hoạt lực này đạt đến mức độ tối đa, sau đó giảm xuống. Vào lúc hoạt lực của Enzyme đạt đến mức tối đa thì phải ngừng quá trình nảy mầm bằng cách sấy hạt đang nảy mầm ở nhiệt độ thích hợp . Các bước quy trình sản xuất malt khô b) Malt thóc: Đại mạch là loại ngũ cốc trồng ở vùng ôn đới có khí hậu lạnh. Ở những vùng nhiệt đới người ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc, bắp để thay thế một phần hay toàn bộ malt đại mạch. * Các bước trong quy trình sản xuất malt thóc Hạt lúa ------- > làm sạch, phân loại -------- > sấy bảo quản --------- > ngâm hạt ---- > ủ mầm ------- > malt tươi ---------> sấy malt --------- > tách mầm rễ ------ > malt khô Trong qúa trình nảy mầm của hạt, các Enzyme như Amylase, protease,… hoạt động mạnh xúc tác cho các biến đổi sinh lý, sinh hoá trong hạt như thuỷ phân các chất cao phân tử như tinh bột và cellulose, protein thành những chất đơn giản hơn. Quá trình nảy mầm xảy ra khi hạt có đầy đủ các điều kiện thích hợp về độ ẩm, nhiệt độ. Ngâm Hạt : trong hạt lúa có sẵn một lượng nước ở dạng liên kết. Nước từ bên ngoài khi thấm vào hạt sẽ hoà tan các chất dự trữ, hoạt hóa các Enzyme xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử trong hạt thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng - 20 – Sấy khô Thu nhận, xử lý, làm sạch, phân loại Mầm rễ khô Tách mầm rễ Sấy khôNảy mầmNgâm Không khí Malt khô sản xuất bia Malt khô bảo quản Bảo quản Đại mạch Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 trưởng của phôi để hình thành cây mầm. Phôi là nơi hút nước mạnh nhất. Tốc độ hút nước rất mạnh ở thời gian đầu do có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lớn giữa môi trường bên ngoài và các tế bào bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nước trương nở rất mạnh, càng về sau, sức hút nước của hạt càng giảm . Ủ hạt : việc ủ hạt trải qua 3 giai đoạn + Giai đoạn 1 : kéo dài 3 ngày. Ở ngày thứ ba bắt đầu nảy mầm, nhiệt độ của khối hạt tăng nhanh do hoạt động hô hấp mạnh. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày . + Giai đoạn 2 : kéo dài 3 ngày . Lúc này chồi mầm và rễ mầm tăng trưởng nhanh , nhiệt độ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt động hô hấp cao. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày . + Giai đoạn 3 : những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm dầm, nhiệt độ tăng yếu và khối hạt cũng cần được đảo 2 - 3 lần/ngày. * Các quá trình xảy ra trong quá trình nảy mầm của Hạt Khi nước ở bên ngoài thấm vào hạt, các hợp chất cao phân tử bên trong hạt thấm nước và trương lên, các Enzyme thuỷ phân hoạt động, phân cắt các chất này thành những chất đơn giản hơn ở trạng thái hoà tan. Các chất này một phần được chuyển đến để nuôi phôi, một phần bị tiêu hao do hoạt động hô hấp và phần lớn được sử dụng để chuyển hoá thành những chất cao phân tử mới ở các mô của cây nảy mầm. Hoạt động hô hấp trong hạt cần được cung cấp oxy đồng thời thải ra khí CO2 và toả nhiệt làm cho nhiệt độ của khối tăng lên, do đó cần phải chú ý tới đảo trộn khối hạt. Hoạt động của Enzyme : trong khối hạt, Enzyme ở dạng liên kết và chúng được chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm. Ngoài ra còn có một số Enzyme được tổng hợp mới. Các Enzyme hoạt động trong quá trình nảy mầm của hạt lúa . - α-Amylase : Enzyme này không hoàn toàn hoạt động ở hạt chín. Hoạt tính của Enzyme α-Amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở nhiệt độ 15 - 170C, hoạt tính của α-Amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10 – 12 của quá trình nảy mầm; Ở nhiệt độ 28 – 300C, hoạt tính của α-Amylase đạt cực đại vào ngày 5 – 8 . - β-Amylase : Enzyme β-Amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít hoạt động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng nên trong quá trình hạt nảy mầm. Thời gian để hoạt động của Enzyme này đạt đến cực đại cũng tuỳ thuộc vào nhiệt độ . - Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong quá trình nảy mầm , hoạt động của các ezyme này tăng nên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng gia tăng. Hoạt động hô hấp của hạt mạnh nhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt độ 27 - 280C và cường độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm của hạt, nhiệt độ vào lượng O2 cung cấp. - 21 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 * Phương pháp tinh sạch Amylase: Có hai phương pháp - Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký - Thu nhận Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE) 3. Thu nhận Enzyme từ vi sinh vật: Nguồn thu nhận chủ yếu là : nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn… Khi nuôi VSV tạo Amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ Enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình tổng hợp Amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ Enzyme phụ thuộc vào tuyến tính của sự tăng khối. * Yêu cầu chung Muốn thu nhận các Enzyme Amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp Enzyme Amylase. Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường , tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là những yếu tố cơ bản tối quan trọng * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt: • Yêu cầu đối với môi trường thành phần dinh dưỡng. Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi VSV tạo Amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi VSV tạo Enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các VSV tạo Amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Cấu tử chính của môi trường VSV tạo Amylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16–22% - 22 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P - 0.94% ) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8–16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 –5 9 %) Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi VSV, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20 %), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 - 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 - 5atm trong vòng 4 -6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường. • Độ ẩm tối thích cuả môi trường : Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối với Asp.niger , Asp.awamort, Asp.flavus , Asp.arysee) của môi trường là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như sự tạo Enzyme Amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Amylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 –68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp Enzyme Amylase như sau : - 23 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-Amylase của Asp.ozysee nuôi bằng phương pháp bề mặt . Phương án thí nghiệm 20 giờ 34 giờ 42 giờ Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô Khay để hở 27,8 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 Khay đậy nắp 46,4 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 Qua bảng số liệu trên thấy rõ là hoạt lực α-Amylase của canh trường nuôi nấm sợi , khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25 – 35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2 . Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục , gián đoạn (hoặc không khí tự nhiên) tuỳ thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi , vào khoảng cách giữa các tầng khay và đĩa khay. Thường là giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 - 5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong 1 giờ , còn ở giai đoạn thứ 2 là 30 – 60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể tích không khí . • Nhiệt độ nuôi : Toàn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ : + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối với nấm mốc 10 – 11 giờ đầu tiên, đối với vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32– 380C cho vi kh