Đánh giá công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa từ tô mộc (Caesalpinia Sappan)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 535 ĐÁNH GIÁ CÔNG THỨC DUNG DỊCH TẠO BỌT PHỤ KHOA TỪ TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN) Bùi Thị Ánh Mai*, Đỗ Thị Hồng Tươi*, Phạm Đ nh Du * TÓM TẮT Mục tiêu: Đ{nh gi{ tính kh{ng viêm, kh{ng khuẩn, kháng nấm và thử tính kích ứng của công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa từ cao lỏng Tô Mộc. Phương pháp Công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa được xây dựng với nồng độ cao lỏng Tô Mộc được chọn thông qua việc đ{nh gi{ hoạt tính kháng viêm. Từ đó, dung dịch được đ{nh gi{ hoạt tính kháng vi sinh vật và thử tính kích ứng da. Kết quả: Nồng độ cao lỏng Tô Mộc được chọn cho công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa là 15%. Dung dịch tạo bọt phụ khoa chứa cao lỏng Tô Mộc có m|u n}u đỏ trong suốt, mùi thơm mùi thơm đặc trưng của cao dược liệu, pH 4,03, tỉ trọng dung dịch tạo bọt 1,06 và mật độ bọt tạo ra 0,117 g/ml. Kết quả định tính v| định lượng x{c định đúng dung dịch tạo bọt có chứa cao lỏng Tô Mộc với lượng polyphenol toàn phần tương đương 23,79 mg acid gallic/ml . Dung dịch có khả năng kh{ng một số chủng vi khuẩn và vi nấm. Bên cạnh đó, dung dịch có khả năng kh{ng viêm tương đương với thuốc đối chiếu Hydrocortison 1% đang lưu h|nh trên thị trường. Thử tính kích ứng cho thấy dung dịch không gây kích ứng trên thỏ. Kết luận: Dung dịch tạo bọt phụ khoa chứa cao lỏng Tô Mộc có thể được ứng dụng trong phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ. Từ khóa: Dung dịch tạo bọt phụ khoa, Tô Mộc, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và kích ứng ABSTRACT EVALUATION 0F ANTI-INFLAMMATORY, ANTIBACTERIAL ANDANTIFUNGAL ACTIVITIES OF FEMININE FOAMABLE SOLUTION COINTAINING CAESALPINIA SAPPAN EXTRACT Bui Thi Anh Mai, Do Thi Hong Tuoi, Pham Dinh Duy * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 535 - 543 Objective: Evaluating anti-inflammatory, antibacterial, antifungal and skin irritation activities of feminine foaming solution Caesalpinia sappan extract. Method: Formulation of feminine foaming solution was established by choosing the concentration of Caesalpinia sappan extract through evaluating anti-inflammatory activity. Then the solution’s antimicrobial and irritation activities were evaluated. Results: The concentration of Caesalpinia sappan extract chosen for feminine foaming solution was 15%. The foaming solution containing Caesalpinia sappan extract has transparent red brown color, flavor of herbal extract, pH 4. 03, emulsion density of 1.06 and foam density of 0.117 g/ml. The results of identification and assay indicated that the foaming solution contains correctly Caesalpinia sappan extract with 23.79 mg/ ml of Gallic acid equivalents. The foaming solution could be resistant to some micro-organisms. Besides, the anti-inflammatory of the foaming solution was similar to that of Hydrocortisone 1% on the market. Irritation test proved that the foamable solution did not irritate in rabbit skin. Conclusion: The feminine foaming solution containing Caesalpinia sappan extract can be applied for * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phạm Đình Duy ĐT: 0908832827 Email: phamdinhduy1981@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 536 prevention and adjuvant therapy of diseases related to lower genital tract infections among women. Key Words: Feminine foaming solution, Caesalpinia sappan, anti-inflammatory, antibacterial antifungal and irritation ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm nhiễm đường sinh dục dưới là một trong những bệnh hay gặp ở phụ nữ tuổi sinh sản, là nguyên nhân gây ra hàng loạt các rối loạn về sức khỏe, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống v| đặc biệt là sức khỏe sinh sản. Nếu không được điều trị kịp thời có thể gây vô sinh, thai ngoài tử cung, ung thư cổ tử cung v| tăng nguy cơ l}y truyền HPV, HIV(5). Trong việc điều trị, ngoài các thuốc chuyên trị như dùng kh{ng sinh, kháng nấm, kh{ng kí sinh trùng,<thì c{c chế phẩm phụ khoa dùng tại chỗ cũng hỗ trợ điều trị bệnh. Bên cạnh đó, c{c chế phẩm phụ khoa còn giúp phòng ngừa bệnh bằng cách làm sạch, cân bằng pH, ngăn nguy cơ tăng sinh qu{ mức hệ vi sinh vật tại }m đạo(1). Với ưu thế tác dụng tại chỗ, trực tiếp, ít tác dụng không mong muốn, chế phẩm phụ khoa dùng tại chỗ hứa hẹn sẽ được sử dụng rộng rãi ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản. Cùng với sự phát triển của các dạng bào chế dùng ngoài như: gel, lotion, dung dịch lỏng, kem, thuốc đặt thì dạng bọt cũng đang được chú ý phát triển nhờ v|o phương ph{p sử dụng tiện lợi, bọt dễ dàng len lõi vào các ngóc ngách và phát huy tác dụng. Tuy nhiên, để tạo ra bọt thì dung dịch cần được đóng trong bao bì chuyên dụng, có khả năng tạo bọt, vì thế chi phí sẽ cao hơn. Ng|y nay, cùng xu hướng quay về với thiên nhiên thì các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đang ng|y c|ng được quan tâm. Với đặc tính kháng khuẩn, tiêu viêm mạnh, Tô Mộc từ l}u đã được sử dụng trong các bài thuốc dân gian. Kinh nghiệm sử dụng trong dân gian cùng với các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như t{c dụng của Tô Mộc khiến loại dược liệu này hứa hẹn khả năng trị liệu cao(2,6,7). Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc nghiên cứu ứng dụng Tô Mộc vào việc chữa bệnh vẫn còn ít được quan tâm mặc dù khí hậu Việt Nam rất thuận lợi để phát triển loại dược liệu này. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu n|y l| đ{nh gi{ tính kh{ng vi m, kh{ng khuẩn và kháng nấm của công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa từ cao lỏng Tô Mộc nhằm phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh li n quan đến viêm nhiễm đường sinh dục dưới ở phụ nữ. NGUYÊN LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Cao lỏng Tô Mộc đã được tiêu chuẩn hóa, Bộ môn Bào chế - Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM; glycerin, natri lauryl sulfat, cocamidopropyl betain, acid lactic, dinatri EDTA, kali sorbat, glucose, cloroform, acid formic, natri carbonat đạt tiêu chuẩn cơ sở (Trung Quốc); Kolliphor RH40 đạt tiêu chuẩn P2010 (Đức); chất chuẩn acid gallic - GAE (Trung Quốc) và các dung môi ethanol, aceton (Việt Nam) đạt tiêu chuẩn ph}n tích. Nước sử dụng l| nước cất 1 lần. Phƣơng pháp Đánh giá tính kháng khuẩn, kháng nấm của cao lỏng Tô Mộc Việc đ{nh gi{ tính kh{ng khuẩn, kháng nấm của cao lỏng Tô Mộc được tiến hành dựa trên việc x{c định MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) trên một số chủng vi sinh vật có khả năng g}y bệnh đường sinh dục dưới bao gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans bằng phương ph{p pha loãng trong thạch. Môi trường được chuẩn bị bằng cách hòa tan mẫu thử nghiệm vào dung môi DMSO, sau đó pha loãng trong c{c môi trường Muller Hinton Agar (MH ) đối với vi khuẩn và hỗn hợp MH v| glucose 2% đối với nấm để được giai nồng độ cuối cùng là 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,1563; 0,0781; 0,0391 (mg/ml). Môi trường được đổ ra c{c đĩa petri, sau đó vi sinh vật thử nghiệm được ph}n t{n đều trong nước Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 537 muối sinh lý sao cho mật độ vi sinh vật thu được tương đương FcFarland 0,5. Sau đó, huyền trọc vi khuẩn tiếp tục được pha loãng 10 lần bằng nước muối sinh lý, còn huyền trọc nấm thì không cần pha loãng. Lần lượt cho 1-2 l huyền trọc vi sinh vật lên mặt đĩa thạch. Ủ c{c đĩa thạch trong tủ ấm 35-37 oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với nấm. MIC được x{c định bằng nồng độ thấp nhất của mẫu thử ở đĩa thạch mà không có sự phát triển của khóm vi sinh vật v| đĩa chứng phải không ức chế sự phát triển của vi sinh vật (có khóm vi sinh vật mọc). Định lượng polyphenol toàn phần trong cao Tô Mộc Thực hiện theo phụ lục 12.6 Dược Điển Việt Nam IV(3) trong điều kiện tránh ánh sáng. - Xây dựng đường chuẩn: đường chuẩn được xây dựng bằng cách hút chính xác lần lượt 1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml; 5,0 ml dung dịch chuẩn chứa acid gallic 0,05 mg/ml vào các bình định mức 25 ml riêng biệt màu nâu, thêm vào mỗi bình 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, sau đó thêm lần lượt 11 ml; 10 ml; 9 ml; 8 ml; 7 ml nước v|o c{c bình tương ứng, thêm dung dịch natri carbonat 29% đến vạch, lắc đều. Đo độ hấp thu của các dung dịch thu được ở 760 nm. Chuẩn bị song song một mẫu trắng. Xây dựng đường chuẩn với độ hấp thu là trục tung và nồng độ dung dịch là trục hoành. - Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 100 mg cao dược liệu cho v|o bình định mức 100 ml màu nâu, thêm khoảng 80 ml nước cất, siêu âm 30 phút, để nguội, th m nước cất vừa đủ, lắc đều, để lắng. Lọc bằng giấy lọc, bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dịch lọc v|o bình định mức 100 ml màu nâu, bổ sung nước cất vừa đủ. - Tiến hành: Hút chính xác 2 ml dung dịch thử v|o bình định mức 25 ml màu nâu, thêm vào mỗi bình 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu, sau đó th m 10 ml nước vào các bình tương ứng, thêm dung dịch natri carbonat 29% đến vạch, lắc đều. Đo độ hấp thu của các dung dịch thu được ở 760 nm. - Dựa tr n đường chuẩn acid gallic đã x}y dựng, tính h|m lượng phenolic trong dung dịch phản ứng. Từ đó, tính h|m lượng phenolic theo đơn vị tương đương acid gallic (mg G E/ml). Điều chế bọt phụ khoa từ Tô Mộc Chế phẩm dung dịch tạo bọt phụ khoa chứa cao lỏng Tô Mộc có công thức gồm các thành phần sau. Bảng 1: Thành phần cao lỏng Tô Mộc Thành phần Khối lượng (g) Chiết xuất tô mộc 10-20 g Kolliphor RH40 10 g Natri lauryl sulfat 0,25 g Cocamidopropyl betain 0,25 g Acid lactic ến pH 4,0 Dinatri EDTA 0,1 g Kali sorbat 0,2 g Chất t o ương v Nư c cất 100 m Quy trình điều chế công thức 100 ml chế phẩm: hòa tan natri lauryl sulfat với khoảng 40 ml nước trong 1 cốc có mỏ 250 ml (1). Hòa cocamidopropyl betain trong khoảng 20 ml nước trong cốc có mỏ 100 ml (2). Cho từ từ (2) vào (1), vừa cho vừa khuấy đều. Tiếp tục cho dinatri EDTA, kali sorbat vào, khuấy đều đến tan hoàn toàn. Cho tiếp Kolliphor RH40 vào và kết hợp với đun nóng nhẹ, khuấy đều đến đồng nhất. Cho tiếp cao lỏng Tô Mộc vào khuấy đều đến tan hoàn toàn. Cho chất tạo hương v|o. ổ sung nước cất gần đến 95 ml. Khuấy nhẹ. Điều chỉnh pH dung dịch bằng acid lactic đến pH khoảng 4,0. Bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml. Đóng chai, dán nhãn. Đánh giá tác dụng kháng viêm của chế phẩm Nồng độ cao lỏng Tô Mộc được lựa chọn dựa tr n đ{nh gi{ t{c dụng kháng viêm. Tiến h|nh đ{nh gi{ hoạt tính kháng viêm của chế phẩm ở ba mức nồng độ cao lỏng Tô Mộc là 10%; 15%; 20% (kl/tt). Thử nghiệm được tiến hành theo mô hình gây viêm bằng carrageenan do Winter và cộng sự đề nghị năm 1962(11). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 538 Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng trưởng thành, chủng Swiss albino, trọng lượng trung bình 25-30 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Chuột được giữ trong 4 ng|y để quen với môi trường thử nghiệm. Trong suốt quá trình thử nghiệm, chúng được cung cấp đầy đủ thức ăn v| nước uống. Hóa chất và nguyên liệu thử nghiệm Dung dịch carrageenan 1% được pha bằng c{ch ng}m carrageenan cho trương nở ho|n to|n trong nước muối sinh lý natri clorid 0,9%, tiến h|nh trước khi gây viêm khoảng 2 giờ. Thuốc đối chiếu là kem Hydrocortison 1% mua từ Kotra Pharma (Melaka, Malaysia). Thuốc thử là các chế phẩm đang khảo sát. Tiến hành Chuột được chia ngẫu nhiên thành 1 lô chứng bệnh, 3 lô thử, 1 lô t{ dược nền v| 1 lô đối chứng, mỗi lô có 12 chuột. Thử nghiệm được tiến hành trong 2 ngày. Ngày 1: thử nghiệm trên lô chứng bệnh, 3 lô thử cần khảo s{t, lô đối chứng. Ngày 2: thử nghiệm trên lô chứng bệnh và lô tá dược nền. Cách tiến hành của hai ng|y tương tự nhau. Đầu tiên, bôi mẫu thử nghiệm lên chân chuột bằng cách nhẹ nhàng cọ xát, bôi 2 lần cách nhau 5 giờ trước khi tiêm carageenan 1 giờ. Các chuột thuộc nhóm chứng bệnh chỉ được thoa nước muối sinh lý, còn những chuột thuộc nhóm đối chứng được thoa kem Hydrocortison 1%. Chuột được tiêm vào gan bàn chân 0,03 ml carrageenan 1%. Thể tích chân chuột được đo bằng dụng cụ đo thể tích chân chuột Plethymometer (Model 7140, Ugo Basile, Milan, Ý) trước và 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 8 giờ, 16 giờ sau khi ti m. Độ sưng phù ch}n chuột được tính theo công thức: V(%)=(Vt-Vo)/Vo× 100 V(%): độ sưng phù ch}n chuột (%). Vo: thể tích chân chuột trước khi gây viêm (ml). Vt: thể tích chân chuột sau khi gây viêm (ml). Đ{nh gi{ kết quả Hoạt tính kh{ng vi m được đ{nh gi{ dựa vào hiệu quả giảm phù giữa lô thử so với lô tá dược nền hoặc lô đối chứng so với lô chứng bệnh. Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm Dung dịch tạo bọt chứa 15% cao lỏng Tô Mộc được đóng v|o chai có khả năng tạo bọt và thực hiện đ{nh gi{ c{c chỉ tiêu: Cảm quan Quan sát bằng mắt thường về độ trong, màu sắc, mùi của chế phẩm. Đồng thời, quan sát hình dạng, màu sắc, độ đồng đều của bọt tạo thành sau khi bóp khỏi đầu phun tạo bọt. pH pH của chế phẩm được đ{nh gi{ bằng máy đo pH theo Phụ lục 6.2, DĐVN IV(3). C{c phép đo phải được tiến h|nh trong cùng điều kiện nhiệt độ khoảng từ 20-25 oC. M{y được hiệu chuẩn với các mẫu pH 4, 7 v| 9 trước khi sử dụng. Mẫu đo được nhúng ngập điện cực và ghi nhận kết quả. Tỉ trọng dung dịch Được x{c định bằng picnomet theo Phụ lục 6.5, DĐVN IV(3). Cân chính xác picnomet rỗng, khô và sạch. Đổ vào picnomet mẫu thử đã điều chỉnh nhiệt độ thấp hơn 20 oC, chú ý không để có bọt khí. Giữ picnomet ở nhiệt độ 20 oC trong khoảng 30 phút. Dùng một băng giấy lọc để thấm hết chất lỏng thừa trên vạch mức, làm khô mặt ngoài của picnomet, cân rồi tính khối lượng chất lỏng chứa trong picnomet. Đổ mẫu thử đi, rửa sạch picnomet, làm khô bằng cách tráng ethanol rồi tráng aceton, thổi không khí nén hoặc không khí nóng đuổi hết hơi aceton. X{c định khối lượng nước cất chứa trong picnomet ở nhiệt độ 20 oC như l|m với mẫu thử. Tỷ số giữa khối lượng mẫu thử và khối lượng nước cất thu được là tỷ trọng cần x{c định. Mật độ bọt Cho dung dịch v|o bao bì có đầu phun tạo bọt, để ở nhiệt độ 25 oC trong ít nhất 24 giờ. Trước khi phun thì lắc đều và bấm nút để bỏ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 539 lượng dung dịch tho{t ra ban đầu khoảng 5-10 g. Cân bì 1 cốc hình trụ có dung tích nhất định (100 mL) được mo. Bấm nút để chuyển dung dịch vào cốc sao cho bọt phủ đầy và cao hơn mặt cốc. Dùng một phiến mỏng gạt cho bọt bằng phẳng và vừa đúng thể tích của cốc. Cân khối lượng thu đc mt. Tiến h|nh đo 3 lần, lấy kết quả trung bình(9). Định tính - Phản ứng hóa học: pha loãng 1 ml thành phẩm với nước cất theo tỉ lệ 1:10 trong ống nghiệm. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% hoặc NaOH 1% vào. Quan sát màu của dung dịch so với ống chứng. - Sắc kí lớp mỏng: dung dịch thử được chuẩn bị bằng c{ch hòa tan 1 lượng chế phẩm trong ethanol 95%, chấm lên bản mỏng silica gel G, thực hiện song song với dung dịch đối chiếu chứa cao Tô Mộc hòa trong ethanol 95%. Dung môi khai triển gồm cloroform-aceton-acid formic (8 : 4 : 1)(3). Sau khi khai triển, để khô bản mỏng, phun dung dịch kali hydroxyd 3% trong methanol rồi quan s{t dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm. Định lương: thực hiện định lượng polyphenol toàn phần trong chế phẩm tương tự như định lượng trong Cao lỏng Tô Mộc. Dung dịch thử là dung dịch tạo bọt được pha loãng 500 lần. Đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chế phẩm Chế phẩm được đ{nh gi{ khả năng kh{ng khuẩn, kháng nấm bằng phương ph{p giếng thạch(4). Tiến h|nh đổ c{c đĩa thạch chứa môi trường MH để thử nghiệm vi khuẩn và hỗn hợp MHA và glucose 2% để thử nghiệm nấm. Sau đó vi sinh vật thử nghiệm được phân tán đều trong nước muối sinh lý sao cho mật độ vi sinh vật thu được tương đương FcFarland 0,5. Huyền trọc S. aureus ATCC 29213, E. coli ATCC 29252, P. aeruginosa ATCC 27853 hoặc C. albicans ATCC 10231 được trải l n đĩa thạch rồi đặt lên mặt thạch 1 đĩa giấy có tẩm 165 l chế phẩm (tương đương lượng chế phẩm trong một nhát bóp). Tiến hành song song với 1 đĩa giấy có tẩm 165 l dung dịch t{ dược nền. Để yên khoảng 15 phút cho các mẫu thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37 oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với nấm. Chế phẩm có khả năng kh{ng khuẩn, kháng nấm khi xung quanh giấy tẩm có vòng kháng khuẩn, kháng nấm. Đồng thời, mẫu chứng chứa dung dịch t{ dược nền không ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nấm hoặc có đường kính vòng kháng khuẩn, kháng nấm nhỏ hơn mẫu thử chứa chế phẩm khảo sát. Thử tính kích ứng của chế phẩm Động vật thử nghiệm Thỏ trắng được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành phố Hồ Chí Minh, có trọng lượng 2,5-3,0 kg. Thỏ được cung cấp đầy đủ thức ăn v| nước uống trong suốt quá trình thử nghiệm. Hóa chất và nguyên liệu thử nghiệm Dung dịch phẩm xanh lam Evans 0,25% được pha bằng cách hòa tan phẩm xanh lam Evans (Đức) trong dung dịch nước muối sinh lí. Chứng dương l| cloroform đạt TCCS (Trung Quốc). Chất thử là chế phẩm khảo sát. Tiến hành Thỏ được cạo sạch lông vùng bụng trước khi làm thử nghiệm 12-24 giờ rồi vẽ các ô vuông A, B, C, D (2,5 cm x 2,5 cm) cách nhau ít nhất 6 cm. Ở các ô lần lượt thoa dung dịch nước muối sinh lý (chứng âm), chế phẩm khảo sát. Ô chứng dương đặt một miếng bông gòn thấm đều 0,1 ml cloroform, để yên trong 10 giây, lau sạch da bằng nước cất. Sau 10 phút, ti m v|o tĩnh mạch tai thỏ 1ml/kg dung dịch phẩm xanh lam Evans 0,25% pha trong natri clorid 0,9%. Bỏ gạc và làm sạch mẫu thử bằng dung môi thích hợp không gây kích ứng. Quan sát sự xuất hiện của phẩm màu xanh lam trong các khoảng thời gian từ 15 phút đến 120 phút sau khi thoa/đắp thuốc. Mỗi mẫu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 540 thử nghiệm tiến hành trên 5 thỏ khác nhau, vị trí c{c ô , , C, D được thay đổi luân phiên. Ghi điểm phản ứng trên da ở các ô tiêm mẫu thử so với phần da không tiêm mẫu thử. Mức độ kích ứng được sắp xếp theo bậc thang điểm như sau: không màu (0), có màu xanh lam rất nhạt (2), có màu xanh lam nhạt (4), có màu xanh lam sậm (8) v| có điểm tụ m{u (m|u đỏ) bao quanh bởi 1 vòng xanh lam sậm (16). KẾT QUẢ Kết quả đánh giá tính háng huẩn, kháng nấm của cao lỏng Tô Mộc Kết quả trình bày ở Bảng 1 cho thấy cao lỏng Tô Mộc có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật thử nghiệm ở nồng độ cao lỏng 0,61 – 10 mg/ml. Sau khi định lượng cao lỏng, thì nồng độ polyphenol toàn phần được x{c định trong cao lỏng Tô Mộc là 16,05% (kl/kl). Từ kết quả định lượng suy ra, nồng độ polyphenol có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật thử nghiệm là 0,098 – 1,161 mg/ml. Bảng 2: Kết quả MIC của cao lỏng Tô Mộc (mg/ml) Chủng Vi sinh MIC mẫu cao (mg/ml) MIC polyphenol (mg/ml) E.coli 1,25 0,201 S.aureus 0,61 0,098 P.aeruginosa 2,5 0,401 C. albicans 10 1,161 Kết quả đánh giá tác dụng kháng viêm của chế phẩm Kết quả độ phù bàn chân chuột ở Bảng 3 và Hình 1 cho thấy hiệu quả giảm phù của các chế phẩm đang khảo sát là nhiều và khác biệt đ{ng kể so với lô chứng bệnh, tuy có thấp hơn lô đối chứng Hydrocortison 1% nhưng thấp hơn không nhiều. Bên cạnh đó, kết quả độ phù bàn chân chuột của lô đối chứng so với lô chứng bệnh cho thấy mô hình tr n có đ{p ứng với chế phẩm đã có trên thị trường. Vì thế, có thể sử dụng kết quả mô hình tr n để đ{nh gi{ hoạt tính kháng viêm cho các chế phẩm cần khảo sát. Khi so sánh giữa các chế phẩm ở các mức nồng độ khác nhau, hiệu quả giảm phù tăng theo nồng độ của cao lỏng. Lô chuột được bôi chế phẩm 15% và 20% cao lỏng có xu hướng giảm phù tương tự với lô đối chứng. Mặc khác, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa hai lô trên (|t| = 1,13 < t0,05(4) = 2,78). Bảng 3: Kết quả độ phù bàn chân chuột trung bình ngày 1 Lô Độ phù bàn chân chuột (%) 1 gi 3 gi 5 gi 8 gi 16 gi Ch ng bệnh 63,6 59,8 54,6 44,4 38,3 Bọt phụ khoa 10 % 41,8 50,7 35,2 23,5 17,6 Bọt phụ khoa 15 % 50,4 43,6 29,4 16,5 21,4 Bọt phụ khoa 20 % 50,2 37,4 25,5 19,9 19,0 Hydrocortison 1 % 37,8 32,0 22,9 16,0 18,0 Hình 1: Độ phù bàn chân chuột (%) của lô chứng bệnh (CB), lô chế phẩm10% cao lỏng (T10), lô chế phẩm 15% cao lỏng (T15), lô chế phẩm 20% cao lỏng (T20) v| lô đối chứng Hydrocortison 1% (HC). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 541 Hình 2: Độ phù bàn chân chuột (%) của lô chứng bệnh (CB) v| lô t{ dược nền (TDN). Bảng 4: Kết quả độ phù bàn chân chuột trung bình ngày 2 Lô Độ phù bàn chân chuột (%) 1 gi 3 gi 5 gi 8 gi 16 gi Ch ng bệnh 54,5 70,9 67,7 62,5 65,8 á dược nền 54,9 69,6 65,4 60,2 58,1 Kết quả ở Bảng 4 v| đồ thị ở hình 2 cho thấy độ phù bàn chân chuột giữa lô t{ dược nền và lô chứng bệnh kh{c nhau không có ý nghĩa thống kê ( = 1,97 < t0,05(4)) = 2,78). T{ dược nền hầu như không có t{c dụng kh{ng vi m, điều đó chứng tỏ tác dụng kh{ng vi m có được là do cao lỏng Tô Mộc mang lại. Kết quả đánh giá chất lƣợng của chế phẩm Công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa chứa 15% cao lỏng Tô Mộc được điều chế ở quy mô 500 ml v| được đ{nh gi{ c{c chỉ tiêu cảm quan, pH, tỉ trọng tương đối, mật độ bọt, định tính, định lượng. Kết quả được trình bày ở Bảng 5. Kết quả đánh giá hả năng háng huẩn, kháng nấm của chế phẩm Khả năng kh{ng khuẩn, kháng nấm của chế phẩm được đ{nh gi{ thông qua đường kính vòng kháng khuẩn được trình bày trong Bảng 5. Kết quả ở Hình 3 cho thấy xung quanh giấy tẩm chế phẩm đều có vòng kháng khuẩn chứng tỏ chế phẩm có hoạt tính trên cả bốn chủng vi sinh vật khảo sát. Kết quả này cho thấy nồng độ sử dụng của cao lỏng Tô Mộc là 15% (cao gấp 15 lần giá trị MIC cao nhất thu được) đảm bảo được hoạt tính kháng vi sinh vật cho chế phẩm. Kết quả thử tính kích ứng của chế phẩm Trong thử nghiệm trên thỏ, mẫu chứng âm là dung dịch nước muối sinh lý không thể hiện tính kích ứng, mẫu chứng dương cloroform gây kích ứng ở mức độ trung bình ở 30 phút đầu và gây kích ứng mạnh từ sau 45 phút đến 120 phút sau khi đắp. Mẫu chế phẩm khảo sát không gây kích ứng da tương tự mẫu chứng âm. Bảng 5: Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dung dịch tạo bọt phụ khoa từ Tô Mộc. Chỉ tiêu Kết quả Cảm quan Dung dịch trong suốt, m u nâu ỏ, ó mùi t ơm. i xịt bọt cho bọt ều, mịn, màu sắ ồng nhất. pH 4,0 4,09 4,05 3,99 4,02 3,99 4,03 ± 0,04 Tỉ trọng dung dịch t o bọt 1,06 1,08 1,05 1,06 1,06 1,05 1,06± 0,01 Mật ộ bọt (g/ml) 0,120 0,116 0,116 0,117 0,115 0,118 0,117 ± 0,002 Định tính Hình phản ng và hình sắc ký Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 542 - Phản ng hóa học v i NaOH, FeCl3. - Sắc kí l p mỏng - Chế phẩm có phản ng dương tín v i các thuốc th ặ trưng ủa hợp chất phenolic. - Sắ í ồ của mẫu cao và mẫu chế phẩm cho các vết có cùng Rf và màu sắc. Ghi chú: Vết 1: cao lỏng Tô Mộc Vết 2: dung dịch tạo bọt phụ khoa Địn ượng (mg GAE/ml) 23,44 23,93 24,02 23,79 ± 0,31 Bảng 6: Kết quả đo đường kính vòng kháng khuẩn của chế phẩm Đư ng kính vòng kháng khuẩn (mm) E.coli S.aureus P.aeruginosa C.albicans 18 29 18 13 Hình 3: Kết quả định tính kháng vi sinh vật của chế phẩm. TP: chế phẩm đang khảo sát TD: T{ dược nềnSta: S. Aureus E: E. Coli Pseu: P. Aeruginosa Can: C. albicans Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 543 Bảng 7: Kết quả thử tính kích ứng của chế phẩm trên thỏ Th i điểm Dung dịch NaCl 0,9% Thành phẩm khảo sát Cloroform 15 phút 0 0 7,43 45 phút 0 0 9,14 75 phút 0 0 9,43 105 phút 0 0 9,71 BÀN LUẬN Với kết quả MIC này, cao lỏng Tô Mộc cho thấy khả năng kh{ng vi sinh vật tương đối cao so với các loại chiết xuất dược liệu có tính kháng vi sinh vật kh{c như chiết xuất lá Petiveria alliacea L. (>50 mg/mL)(8) và chiết xuất keo ong (0,5 - 16 mg/mL)(10). Chế phẩm có nồng độ cao lỏng là 15% được chọn. Ngoài tác dụng kháng viêm ra, với nồng độ này dung dịch tạo bọt chứa cao lỏng còn có thể cho tác dụng kháng các vi sinh vật E.coli, S.aureus, P.aeruginosa và C. albicans. KẾT LUẬN Công thức dung dịch tạo bọt phụ khoa chứa 15% cao lỏng Tô Mộc đã được đ{nh gi{ c{c chỉ tiêu chất lượng như cảm quan, pH, tỉ trọng dung dịch, mật độ bọt tạo ra, định tính, định lượng. Các thử nghiệm bước đầu cho thấy chế phẩm có khả năng kh{ng lại các vi sinh vật S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans v| có t{c động kh{ng vi m tương đương với thuốc đối chiếu. Chế phẩm không gây kích ứng da khi thử nghiệm trên thỏ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Baki G and Alexander KS (2015). Introduction to cosmetic formulation and technology. John Wiley & Sons. 2. Đỗ Huy Bích. (2004). Cây thuốc v| động vật làm thuốc ở Việt Nam tập II. NXB Khoa học và kỹ thuật p. 972 - 975. 3. Bộ Y tế. (2009). Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học: Hà Nội p. 919-920, PL 12.6, PL 6.2, PL 6.5, PL 6.3. 4. Trần C{t Đông and Nguyễn Văn Thanh. (2002). X}y dựng mô hình đ{nh gi{ chất có tiềm năng kh{ng khuẩn. Y học TP. Hồ Chí Minh. 6(1): p. 309-313. 5. Galask R and Larsen B (1986). Infectious Diseases in the Female Patient. Springer-Verlag New York. 6. Mueller M, Weinmann D, Toegel S, Holzer W, Unger F, and Viernstein H (2016). Compounds from Caesalpinia sappan with anti-inflammatory properties in macrophages and chondrocytes. Food Funct. 7(3): p. 1671-9. 7. Nirmal NP, Rajput MS, Prasad RGSV, and Ahmad M. (2015). Brazilin from Caesalpinia sappan heartwood and its pharmacological activities: A review. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 8(6): p. 421-430. 8. Ochoa Pacheco A, Marín Morán J, González Giro Z, Hidalgo Rodríguez A, Mujawimana RJ, Tamayo González K, and Sariego Frómeta S (2013). In vitro antimicrobial activity of total extracts of the leaves of Petiveria alliacea L. (Anamu). Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 49: p. 241-250. 9. Phillips LG, Haque Z, and Kinsella JE (1987). A method for the Measurement of Foam Formation and Stability. Journal of Food Science. 52(4): p. 1075-1077. 10. Turhan Togan EE, Özgür Çİftcİ, Hüseyin Narci, Mehmet Musa Özcan, And Hande Arslan. (2014). The Antibacterial Effect of Propolis against Clinical Isolates. Sci-Afric Journal of Scientific Issues, Research and Essays 2(12): p. 551-553. 11. Vogel HG (2008). Drug discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. New York: Springer Berlin Heidelberg Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018