Đánh giá khả năng diệt tụ cầu da (staphylococcus epidermidis) của nano bạc trên invitro

43Số 28 (Tháng 05/2019) 'A /,ӈ8 HӐ& NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ÑAÙNH GIAÙ KHAÛ NAÊNG DIEÄT TUÏ CAÀU DA (STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS) CUÛA NANO BAÏC TREÂN INVITRO Tống Thị Kim Tuyến*, Nguyễn Minh Hoan*, Hoàng Thị Thanh Hoa*, Lê Hạ Long Hải*, Lê Văn Hưng** TÓM TẮT Tụ cầu da (S. epidermidis) là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ hội quan trọng ở da và niêm mạc, thường gặp nhất là các nhiễm trùng trên da, niêm mạc và ở các bệnh nhân đã được thực hiện can thiệp thủ thuật ngoại khoa. Các nghiên cứu cho thấy, tình trạng kháng kháng sinh của tụ cầu da ngày một nghiêm trọng. Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát khả năng diệt khuẩn (theo thời gian và nồng độ) của nano bạc đối với các chủng tụ cầu da trên invitro. Phương pháp nghiên cứu: 30 chủng S. epidermidis sau khi được nuôi cấy phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân mắc các nhiễm trùng da đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương và các bệnh nhân có can thiệp thủ thuật ngoại khoa, được cho tiếp xúc với nano bạc ở các nồng độ và khoảng thời gian khác nhau để đánh giá khả năng diệt tụ cầu da S. epidermidis của nano bạc. Kết quả: Tại nồng độ 50 mg/L và ủ trong vòng 2 giờ, nano bạc có khả năng diệt 100% các chủng tụ cầu da. Tại nồng độ 5 mg/L, nano bạc khi được ủ với S. epidermidis từ 2 đến 4 giờ cho thấy khả năng diệt tụ cầu da là trên 99,9%. Kết luận: Nano bạc có khả năng diệt tụ cầu da gây bệnh, khả năng này tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc. Từ khóa: Nano bạc; tụ cầu da. Phản biện khoa học: PGS.TS. Nguyễn Hữu Sáu *Bộ môn Vi sinh - Ký sinh trùng lâm sàng, Trường Đại học Y Hà Nội. **Bộ môn Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Tụ cầu da (S. epidermidis) là cầu khuẩn Gram dương không có men coagulase, thuộc giống Staphylococcus. Tụ cầu da là thành viên trong vi hệ trên da và niêm mạc của người khỏe mạnh. Chúng là tác nhân gây bệnh cơ hội quan trọng, thường gặp nhất là các nhiễm trùng ngoài da và trong các trường hợp bệnh nhân có can thiệp các thủ thuật như đặt nội khí quản, xông dạ dày, bệnh nhân cấy ghép tạng, sử dụng van tim nhân tạo, phẫu thuật xương, Tụ cầu da sinh trưởng trên các bề mặt các dụng cụ và vật liệu y tế nói trên, hình thành màng sinh học (biofilm) [1], được đặc trưng bởi các polysaccharide, màng sinh học bao bọc và bảo vệ vi khuẩn, dẫn đến ngăn cản tác dụng diệt tụ cầu da của kháng sinh và hệ miễn 44 'A /,ӈ8 HӐ& Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC dịch của cơ thể. Nếu không có hướng điều trị thích hợp, ở trường hợp nặng bệnh nhân có thể có thể bị nhiễm khuẩn huyết và tử vong [2] [3] [4] [5]. Nano bạc được xem là chất kháng khuẩn tự nhiên an toàn và hiệu quả. Ion bạc có hoạt tính mạnh, dễ dàng liên kết với các protein tích điện âm, RNA, DNA, ion clorid. Đặc tính này đóng vai trò chính trong cơ chế kháng khuẩn của bạc [8]. Hoạt động kháng khuẩn của nano bạc dựa vào các cơ chế: (1) Bám dính lên bề mặt thành tế bào và màng tế bào; (2) thâm nhập vào trong tế bào và làm hủy hoại cấu trúc nội bào (ty thể, không bào, ribosome) và các phân tử sinh học (protein, lipid và DNA); (3) gây độc tế bào và tăng cường các phản ứng oxy hóa với sự tham gia của các gốc tự do; (4) Thay đổi các con đường các con đường truyền tín hiệu tế bào [9]. Ở Việt Nam, hiện tại chưa có nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng tiêu diệt diệt tụ cầu da của nano bạc. Chính vì các vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục đích: “Khảo sát khả năng diệt tụ cầu da của nano bạc trên invitro (theo thời gian và nồng độ)”. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 30 chủng tụ cầu da (S. epidermidis) được phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân bị viêm nang lông (các sẩn, mụn mủ), viêm kẽ đến khám và các vật liệu y tế can thiệp trong ngoại khoa của bệnh nhân nằm điều trị tại viện (ống nội khí quản, van tim nhân tạo,..) đã được chỉ định làm xét nghiệm tại Khoa Xét nghiệm Vi sinh - Nấm - Ký sinh trùng, Bệnh viện Da liễu Trung ương và đã được xác định S. epidermidis là căn nguyên gây bệnh. 2.2. Vật liệu - Dung dịch nano bạc có nồng độ 500mg/L được cung cấp bởi Phòng Công nghệ thân môi trường, Viện Công nghệ môi trường. - Môi trường thạch thường, môi trường Skim milk, tủ ấm CO2 (Thermo), tủ an toàn sinh học, tủ lạnh thường, tủ âm sâu, máy đo độ đục (BioMérieux), máy vortex (IKA), bộ nhuộm Gram. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang, sử dụng các kỹ thuật xét nghiệm labo: kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, kỹ thuật pha loãng để khảo sát khả năng diệt tụ cầu da (theo thời gian và nồng độ) của nano bạc. 2.3.1. Chuẩn bị chủng 30 chủng tụ cầu da (S. epidermidis) được cấy chuyển 2 lần lên môi trường để ổn định các đặc tính sinh học. Cấy trên môi trường thạch thường, 35 - 370C; 5 - 7% CO2 trong 18 - 24 giờ. 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch nano bạc với các nồng độ khác nhau Pha loãng dung dịch nano bạc có nồng độ giảm dần, bắt đầu với nồng độ 500mg/L của dung dịch nano bạc gốc, cụ thể như sau: 45Số 28 (Tháng 05/2019) 'A /,ӈ8 HӐ& NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Hình 2.1: Pha loãng dung dịch nano bạc ở các nồng độ khác nhau • Ống chứng: ống nghiệm vô trùng chứa 2ml nước cất tiệt trùng. 2ml dd Nano bạc 1ml Nước cất 1,2ml Nước cất 1ml Nước cất 1,8ml Nước cất 1,6ml Nước cất 1ml Nước cất 1ml Nước cất 1ml Nước cất 1,8ml Nước cất 0,2ml 1ml 0,8ml 1ml 0,2ml 0,4ml 1ml 1ml 1ml 1 1/10 1/20 1/50 1/100 1/1000 1/5000 1/10000 1/20000 1/40000 2.3.3. Đánh giá khả năng diệt tụ cầu da của nano bạc Pha hỗn hợp của huyền dịch vi khuẩn và dung dịch nano bạc ở các nồng độ khác nhau, điều chỉnh độ đục đạt 0,5 McFarland (tương đương 108 CFU/ml). Vortex để trộn đều hỗn hợp. Cấy 100µl hỗn hợp lên môi trường thạch thường, nuôi cấy ở 370C, 5 -7% CO2. Đối chứng chỉ có nước cất vô trùng và khuẩn lạc của vi khuẩn S. epidermidis. Tác dụng diệt tụ cầu da được đánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc của S. epidermidis còn mọc trên môi trường so với nồng độ vi khuẩn ban đầu sau các khoảng thời gian tiếp xúc với dung dịch nano bạc. Số lượng khuẩn lạc của hỗn hợp ở từng nồng độ và thời gian tiếp xúc mọc trên đĩa nuôi cấy được tính trung bình trên 30 chủng. Phương pháp đếm khuẩn lạc: Hình 2.2: Phương pháp đếm khuẩn lạc Đĩa nuôi cấy sau 24 - 48 giờ được lấy ra để quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc 2.3.4. Xác định khả năng diệt tụ cầu da của nano bạc theo thời gian tiếp xúc Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration-MBC) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn ban đầu. Trong nghiên cứu này, MBC của dung dịch nano bạc là nồng độ ở ống mà khi cấy lên môi trường không có khuẩn lạc mọc. Số liệu được xử lý theo chương trình Excel 2016. 46 'A /,ӈ8 HӐ& Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 3. KẾT QUẢ Khả năng diệt tụ cầu da của nano bạc theo nồng độ và thời gian tiếp xúc Biểu đồ 3.1: Khả năng diệt tụ cầu da của nano bạc theo nồng độ (một số nồng độ trong thử nghiệm) và thời gian tiếp xúc Tại thời điểm 0 giờ, dung dịch nano bạc không thể diệt hoàn toàn S. epidermidis ở mọi nồng độ thử nghiệm, tại thời điểm này, khi nồng độ tăng lên 5mg/L và 50mg/L, số chủng vi khuẩn tụ cầu da bị diệt tương ứng là 70% và 95,3%. Khi thời gian ủ nhỏ hơn 4 giờ, tại nồng độ 0,1mg/L, nano bạc không có khả năng diệt tụ cầu da, khi thời gian ủ tăng lên 4 giờ, có thể diệt được 4% số chủng tụ cầu da. 70% số chủng S. epidermidis bị diệt ngay thời điểm tiếp xúc và > 99% số chủng bị diệt khi ủ nồng độ nano bạc 5 mg/L ở các điều kiện 15 phút, 1 giờ, 2 giờ và 4 giờ. Tại nồng độ 50 mg/L, nano bạc cho thấy khả năng diệt tụ cầu da khoảng > 95% ở thời điểm vừa tiếp xúc, khả năng diệt khuẩn đối với tụ cầu da tăng lên đến 100% khi ủ trong 2 giờ. 47Số 28 (Tháng 05/2019) 'A /,ӈ8 HӐ& NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 4. BÀN LUẬN Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm ở nhiều nồng độ nano bạc khác nhau: 1, 1/10, 1/20, 1/50, 1/100, 1/1000, 1/5000, 1/10000, 1/20000, 1/40000. Tuy nhiên, thử nghiệm đã cho thấy, ở tất cả các nồng độ nano bạc, đều cần thời gian ủ thì mới có khả năng diệt tụ cầu da. Kết quả này có thể lý giải bởi tụ cầu da là vi khuẩn Gram dương, có lớp vách tế bào chứa peptidoglycan dày và chúng có thể hình thành lớp biofilm, vì vậy đòi hỏi thời gian tiếp xúc với nano bạc với dài hơn mới phát huy hiệu quả diệt tụ cầu da[1] [10] [11]. Trên thế giới, tuy chưa có nhiều nghiên cứu riêng biệt về vấn đề này, nhưng đã có các nghiên cứu liên quan và kết luận này của nhóm nghiên cứu chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước kia được tiến hành bởi Bahman Khameneh và cộng sự [10], Zenon Foltynowicz và cộng sự [11]. Trong kết quả nghiên cứu, nồng độ 5 mg/L là ngưỡng thấp nhất không còn khả năng diệt hoàn toàn đối với S. epidermidis ở mọi thời gian ủ được thử nghiệm. Tại nồng độ 10 mg/L, nano bạc cho thấy khả năng diệt lên đến 100% khi ủ với S. epidermidis trong 4 giờ và diệt khoảng trên 50% số chủng ngay khi vừa tiếp xúc với nồng độ này. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Emerson Danguy Cavassin và cộng sự [12]. 5. KẾT LUẬN Nano bạc cho thấy hiệu quả diệt khuẩn đối với tụ cầu da là rất tốt, khả năng diệt khuẩn này phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tiếp xúc. Nền y học có thể hướng tới các dược phẩm ứng dụng nano bạc trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do tụ cầu da, góp phần giải quyết vấn đề kháng thuốc của tụ cầu da và giải quyết vấn đề ngăn cản tác động của thuốc kháng sinh tới vi khuẩn bởi biofilm. Tác dụng diệt khuẩn của nano bạc với tụ cầu da đã góp phần mở ra hướng điều trị mới đối với các bệnh trong chuyên ngành Da liễu như: viêm kẽ, viêm âm hộ, loét da và niêm mạc do tụ cầu da và các loài vi khuẩn kháng thuốc khác. Ngoài ra, có thể ứng dụng nano bạc để sản xuất các dung dịch sát trùng, kem bôi, miếng dán, gạc đắp các vết thương và nhiều sản phẩm khác như băng vệ sinh, bỉm cho trẻ em và người già. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Jawetz Melnick&Adelbergs (2015). Medical Microbiology (27th), McGraw Hill Education Medical (2015). 2. Eftekhar F, Dadaei T. Biofilm formation and detection of icaAB genes in clinical isolates of methicillin resistant Staphylococcus aureus. Iran J Basic Med Sci. 2011; 14(2): 132-136. 3. Bose S, Ghosh AK. Biofilms A challenge to medical science. J Clin Diagn Res. 2011; 5(1): 127-130. 4. Morones JR, Elekiguerra JL, Camacho A, Holt K, Kouri JB, Ramirez JT, Yacaman MJ. The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology. 2005; 16 : 2346-2353. Doi: 10.1088 / 0957-4484 / 16/10/059. [ PubMed ] [ CrossRef ]. 5. Ansari MA, HM Khan, AA Khan, Malik A, Sultan A, Shahid M, Shujatullah F, Azam A. Evaluation of antibacterial activity of silver nanoparticles MSSA and MRSA Against isolates from skin infections on.Biol Med. 2011; 3 : 141-146. 6. Gong P, Li H, He X, Wang K, Hu J, Tan W, Tan S, Zhang XY. Preparation and antibacterial activity of Fe3O4 Ag nanoparticles. Nanotechnology.2007; 18 : 604-611. 48 'A /,ӈ8 HӐ& Số 28 (Tháng 05/2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 7. Shunmugaperumal T. Microbial colonization of medical devices and novel preventive strategies. Recent Pat Drug Deliv Formul. 2010; 4(2): 153-173. 8. Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM.(2010). Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications. Trends Biotechnol. 2010 Nov; 28(11):580-8. 9. Tikam Chand Dakal , Anu Kumar, Rita S. Majumdar , and Vinod Yadav. Mechanistic Basis of Antimicrobial Actions of Silver Nanoparticles, NCBI, Front Microbiol . 2016; 7: 1831, Published online 2016 Nov. 10. The effect of silver nanoparticles on Staphylococcus epidermidis biofilm biomass and cell viability, Bahman Khamench, Hamed Zarei, Bibi Sedigheh Fazly Bazzaz, Nanomedicine Journal, Jul. 12, 2014, Vol. 1, No. 5, Autumn 2014, page 302-307. 11. Zenon Foltynowicz et al. Antimicrobial Properties of Socks Protected with Silver Nanoparticles, , Fibres and Textiles in Eastern Europe 21(5):91-96 • September 2013. 12. Emerson Danguy Cavassin et cc. Comparison of methods to detect in vitro activity of silver nanoparticles (AGNP) against multidrug resistant bacteria, J Nanobiotechnology . 2015; 13: 64. Published online Oct. 2015 5. SUMMARY DETERMINATION OF MINIMUM BACTERICIDAL CONCENTRATION OF SILVER NANOPARTICLES TO STAPHYLOCOCCUS AUREUS CAUSING CUTANEOUS DISEASES Staphylococcus epidermidis an important opportunistic infection, most commonly on skin and mucosal infections, and in patients who have had surgical interventions. Studies show that the antibiotic resistance of S. epidermidis is more serious. Method: S. epidermidis was isolated from 30 patients with cutaneous infections at National hospital of Dermatology and Venereology and patients who having surgical interventions. 30 isolates S. epidermidis were exposed to silver nanoparticles at different concentrations and durations to evaluate the bactericidal effect of silver nanoparticles to S. epideermidis. Results: At 50 mg/L of concentration and in 2 hours of exposure, bactericidal effect of silver nanoparticles to S. epidermidis was 100%. At 5 mg/L of concentration, bactericidal effect of silver nanoparticles was more than 99,9% in 2 and 4 hours of exposure, respectively. Conclusion: Bactericidal effect of silver nanoparticles to S. epidermidis isolates was directly proportional to concentration and contacting time period. Key word: Silver nanoparticle, Staphylococcus epidermidis.