Đánh giá sàng lọc sự có mặt GMO trong sản phẩm bắp và đậu nành

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 342 ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC SỰ CÓ MẶT GMO TRONG SẢN PHẨM BẮP VÀ ĐẬU NÀNH Nguyễn Đỗ Phúc*, Nguyễn An Huy*Phạm Hùng Vân** TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Công tác kiểm nghiệm sinh học phân tử trong phân tích các sản phẩm có nguồn gốc biến ñổi gen là cần thiết, giúp trong việc giám sát và kiểm tra chất lượng hàng hoá trong nước và nhập khẩu hiện nay ñang ñược Bộ Y tế quan tâm. Mục tiêu nghiên cứu: Áp dụng qui trình PCR sàng lọc phát hiện sản phẩm bắp, ñậu nành chứa GMO với các mồi ñặc hiệu ñể phát hiện trình tự promoter 35S và Terminator HAnos giúp công tác xét nghiệm ñịnh lượng nhanh hơn.. Phương pháp nghiên cứu: Tách chiết DNA của các sản phẩm bắp và ñậu nành bằng bộ tách chiết của hãng Promega và sử dụng kỹ thuật PCR ñể phát hiện các sản phẩm chứa GMO. Sử dụng cặp mồi ñược thiết kế ñể khuyếch ñại DNA từ CaMV promoter 35S và Terminator HAnos. Kết quả khuyếch ñại ñối với cặp mồi CaMV35 là sản phẩm PCR có kích thước 195 bp và cặp mồi HAnos là sản phẩm PCR có kích thước 118bp. Kết quả nghiên cứu: Kết quả tách chiết DNA có nồng ñộ và ñủ số lượng ñưa vào phản ứng PCR. Trong 25 mẫu bắp khảo sát có 10/25 mẫu có biến ñổi gen, chiếm tỷ lệ 40%, và 21 mẫu ñậu nành khảo sát, có 15/21 mẫu có biến ñổi gen, chiếm tỷ lệ 71,4%. Kết luận: Sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi ñặc hiệu ñể phát hiện trình tự Promotor 35S và Terminator HAnos có trong các sản phẩm bắp và ñậu nành nhằm mục ñích sàng lọc trong quá trình kiểm nghiệm, giúp cho xét nghiệm ñịnh lượng % GMO ñược thuận lợi và chính xác. Từ khóa: thực phẩm biến ñổi gen, GOM. ABSTRACT ASSESSMENT THE PRESENCE OF GMO IN CORN AND SOYA BY THE SCREENING PCR METHOD Nguyen Do Phuc, Nguyen An Huy, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 342 - 347 Background: Molecular technique is necessary in analysis of genetically modified (GM) food. Objectives: Applying the screening PCR method for detection GMO in cereals products with specific primers for detection gene sequences of promoter 35S và Terminator HAnos. Method: Isolation of genomic DNA by Promega kit from soybeans, maize content enough level of GM content, and enough for the screeningPCR method. This PCR method to detect foreign DNA in genetically modified food, using primers that designed to amplify DNA from the CaMV35S promoter and HAnos Terminator component of the gene cassette. Amplification of this Promoter yields DNA fragments 195bp and this Terminator yields DNA fragments 118bp in length. Results: The method of DNA isolation is enough DNA for PCR test. In this study show that in 40% of maize samples and 71.4% of soybeans samples is presence of GMO. Conclusion: The PCR method for detection genetically modified food with the specific primers to amplify Promoter35S and Terminator HAnos is screening GMO products for determination quantization of GM DNA content in food. Keywords: genetically modified food, GOM. * Viện Vệ sinh - Y tế Công cộng TP Hồ Chí Minh **Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Địa chỉ liên lạc: Ths. Nguyễn Đỗ Phúc ĐT: 0907 669 008 Email: nguyendophuc@ihph.org.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 343 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới hiện nay các kỹ thuật sinh học phân tử ñã ñược áp dụng trong hầu hết các ngành khoa học tự nhiên. Ðặc biệt trong thập niên cuối thế kỷ 20, với cuộc cách mạng sinh học phân tử ñã làm nên những ñiều kỳ diệu trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghệ gen, công nghệ sinh học, tiến hóa học, y sinh học. Trong Y sinh học, có rất nhiều ñối tượng nghiên cứu, kiểm nghiệm chúng ta phải sử dụng ñến kỹ thuật sinh học phân tử thì mới có thể giải quyết ñược vấn ñề. Ví dụ trong chẩn ñoán phát hiện các ñột biến gen, kỹ thuật phân tích các sinh vật biến ñổi gen thì bắt buộc phải dùng ñến kỹ thuật sinh học phân tử; hay trong chẩn ñoán các vi sinh vật gây nhiễm trùng thực phẩm mà các kỹ thuật vi sinh học truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp, ñộ nhạy thấp thì sinh học phân tử là một kỹ thuật không thể thiếu ñược. Trong xu thế hội nhập quốc tế, Việt Nam ñã trở thành nước thành viên của WTO vào tháng 11 năm 2006. Khi gia nhập WTO Việt nam ñã có những cam kết trong lĩnh vực sinh vật biến ñổi gen. Trong nghị ñịnh thư Cartagena về an toàn sinh học bắt buộc các nhà xuất khẩu phải cung cấp nhiều thông tin hơn nữa cho các nước nhập khẩu về sản phẩm GMO. Ngoài ra, các nước nhập khẩu có quyền phản ñối hàng nhập khẩu hay hàng viện trợ là sản phẩm GMO nếu những sản phẩm này gây ảnh hưởng ñến cây trồng truyền thống và văn hoá - xã hội ở nước nhập khẩu kể cả khi họ không có ñủ bằng chứng khoa học. Tháng 8 năm 2005, Thủ tướng Chính phủ ñã ban hành Quyết ñịnh số 212/2005/QD-TTg về Quy chế Quản lý GMO. Theo ñó, các sản phẩm hàng hóa GMO khi nhập khẩu, xuất khẩu hoặc lưu hành trên thị trường Việt Nam phải dán nhãn và ghi rõ: Sản phẩm có sử dụng công nghiệp biến ñối gen. Trước tình hình ñó việc triển khai công tác kiểm nghiệm sinh học phân tử trong phân tích các sản phẩm có nguồn gốc biến ñổi gen là cần thiết, giúp trong công tác giám sát và kiểm tra chất lượng hàng hoá nhập khẩu ñược chặt chẽ hơn. Trong giới hạn của ñề tài chúng tôi tiến hành khảo sát sàng lọc sự có mặt GMO trong bắp, ñậu nành và các sản phẩm từ bắp và ñậu nành ñể xem xét tình hình thực tế sử dụng thực phẩm biền ñổi gen hiện nay tại TP. Hồ Chí Minh. Mục tiêu nghiên cứu - Tách chiết DNA và ño hàm lượng DNA trước khi thực hiện phản ứng PCR - Đánh giá sàng lọc các mẫu bắp và sản phẩm bắp chứa các promoter 35S và Terminator HAnos, xác ñịnh tỷ lệ mẫu chứa GMO trên sản phẩm bắp. - Đánh giá sàng lọc các mẫu ñậu nành và sản phẩm ñậu nành chứa các promoter 35S và Terminator HAnos, xác ñịnh tỷ lệ mẫu chứa GMO trên sản phẩm ñậu nành. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Các loại ngũ cốc: bao gồm 25 mẫu bắp và sản phẩm bắp và 21 mẫu ñậu nành và sản phẩm ñậu nành ñược lấy ngẫu nhiên từ các chợ, siêu thị, quầy bán lẽ, trên ñường phố tại các Quận, Huyện tại Thành phố Hồ Chí Minh. - Mồi chuyên biệt phát hiện trình tự promoter 35S- CaMV: Mồi xuôi: 5’-gCT CCT ACA AAT gCC ATC A- 3’. Mồi ngược: 5’-gAT AgT ggg ATT gTg CgT CA- 3’. - Mồi chuyên biệt phát hiện trình tự Terminator nos . Mồi xuôi: HA-nos 118f: 5’-gCA TgA CgT TAT TTA TgA gAT ggg - 3’ Mồi ngược: HA-nos 118r: 5’-gAC ACC gCg CgC AgT AAT TTA TCC-3’ - Chứng dương: ñậu nành dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready® Soya 0,1% (IRMM -410). - Chứng âm: ñậu nành dòng GTS 40-3-2 (Roundup Ready® Soya 0 % (IRMM -410). - Thành phần kit thử phát hiện trình tự promoter 35S- CaMV: Mater Mix 2 X: 12,5µl; primer 35S1 (5pm): 0,5, primer 35S2 (5pm): 0,5; dH2O:10,5µl; Tổng thể tích 24µl. - Thành phần kit thử phát hiện trình tự Terminator HAnos: Mater Mix 2 X: 12,5µl; primer HAnos 118f (20pm): 0,5µl; HAnos 118r (20pm): 0,5µl; dH2O:10,5µl; Tổng thể tích 24µl. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang Tách chiết DNA Theo qui trình tách chiết của bộ kít Promega Đo nồng ñộ DNA: ñược ño trên máy - Qui trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 35S1 và 35S2: Khuếch ñại và biến tính ban ñầu 95oC/10 phút; chu trình nhiệt 2: 40 chu kỳ với ba bước nhiệt ñộ: 940C/20giây; 540C/40 giây và 720C/60 giây. Chu kỳ 3: 720C/3 phút và giữ 40C. Sản phẩm PCR bảo quản trong -20oC cho ñến khi ñiện di. Sản phẩm sau phản ứng PCR ñược ñiện di trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide 8µl (dung dịch ethidium bromide 5mg/ml). Điện di ở ñiện thế 135V trong 25 phút. Sau ñó quan sát kết quả trên máy chụp hình ñiện di bằng tia UV có bước sóng 312nm. Nếu xuất hiện vạch tương ứng khoảng 195bp thì xem là sản phẩm có Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 344 chứa vật liệu biến ñổi gen và phải tiến hành khẳng ñịnh sản phẩm ñó. - Qui trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi HA- nos 118-f và HA-nos118-r: Khuếch ñại và biến tính ban ñầu 95oC/10 phút; chu trình nhiệt 2: 50 chu kỳ với ba bước nhiệt ñộ: 940C/25giây; 620C/30 giây và 720C/45 giây. Chu kỳ 3: 720C/7 phút và giữ 40C. Sản phẩm PCR bảo quản trong -20oC cho ñến khi ñiện di. Sản phẩm sau phản ứng PCR ñược ñiện di trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide 8µl (dung dịch ethidium bromide 5mg/ml). Điện di ở ñiện thế 135V trong 25 phút. Sau ñó quan sát kết quả trên máy chụp hình ñiện di bằng tia UV có bước sóng 312nm. Nếu xuất hiện vạch tương ứng khoảng 118bp thì xem là sản phẩm có chứa vật liệu biến ñổi gen và phải tiến hành khẳng ñịnh sản phẩm ñó. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả ño nồng ñộ DNA mẫu sau tách chiết Bảng 1: Kết quả xác ñịnh nồng ñộ DNA sau tách chiết của mẫu bắp và sản phẩm bắp TT Tên mẫu Mã số OD Nồng ñộ µg/µl 1 Bắp khô BK1 1,72 70 2 Bắp khô BK2 1,75 40 3 Bắp xay BX1 0 0 4 Bắp xay BX2 1,77 40 5 Bắp xay BX3 1,46 10 6 Bắp xay BX4 1,90 420 7 Bắp xay BX5 1,56 10 8 Bắp tươi BT1 1,69 20 9 Bắp tươi BT2 1,70 50 10 Bắp tươi BT3 1,73 40 11 Bắp tươi BT4 1,71 40 12 Bắp tươi BT5 1,72 90 13 Bắp tươi BT6 1,54 20 14 Bắp tươi BT7 1,82 20 15 Bắp tươi BT8 1,72 40 16 Bắp tươi BT9 1,68 70 17 Bắp tươi BT10 1,55 30 18 Bắp tươi BT11 1,72 60 19 Bắp hộp BH1 1,38 10 20 Bắp hộp BH2 1,40 10 21 Bắp hộp BH3 1,72 10 22 Bắp hộp BH4 1,68 20 23 Bắp hộp BH5 1,71 20 24 Bắp hộp BH6 1,70 20 25 Bắp hộp BH7 1,53 10 Bảng 2: Kết quả xác ñịnh nồng ñộ DNA sau tách chiết của mẫu ñậu nành và sản phẩm ñậu nành TT Tên mẫu Mã số OD Nồng ñộ µg/µl TT Tên mẫu Mã số OD Nồng ñộ µg/µl 1 Đậu nành hạt ĐK1 1,89 110 2 Đậu nành hạt ĐK2 1,85 150 3 Đậu nành hạt ĐK3 1,82 100 4 Đậu nành hạt ĐK4 1,75 80 5 Đậu nành hạt ĐK5 1,72 110 6 Đậu nành hạt ĐK6 1,70 70 7 Đậu nành hạt ĐK7 1,65 60 8 Đậu nành xay ĐX1 1,54 20 9 Đậu nành xay ĐX2 1,55 30 10 Đậu nành xay ĐX3 1,93 410 11 Đậu nành xay ĐX4 1,58 80 12 Đậu nành xay ĐX5 1,75 40 13 Đậu nành xay ĐX6 1,28 130 14 Đậu nành xay ĐX7 1,64 150 15 Đậu nành xay ĐX8 1,70 70 16 Đậu nành xay ĐX10 1,77 160 17 Đậu nành xay ĐX11 1,67 110 18 Đậu nành xay ĐX12 1,48 30 19 Đậu nành xay ĐX13 1,65 30 20 Đậu nành xay ĐX14 1,87 90 21 Đậu nành xay ĐX15 1,72 200 Qua kết quả bảng 1 và 2 cho thấy mẫu ñược tách chiết DNA có nồng ñộ DNA ñáp ứng với yêu cầu của phương pháp thử và sử dụng ñể sàng lọc các biến ñổi gen. Kết quả sàng lọc các mẫu biến ñổi gen Bảng 3: Kết quả sàng lọc các biến ñổi gen bằng promoter 35S và Terminator nos của bắp và sản phẩm bắp TT Tên mẫu Mã số Promoto r 35S Termin ator nos Kết quả 1 Bắp khô BK1 + + dương tính 2 Bắp khô BK2 + - dương tính 3 Bắp xay BX1 - - âm tính 4 Bắp xay BX2 + + dương tính 5 Bắp xay BX3 - + dương tính 6 Bắp xay BX4 + + dương tính 7 Bắp xay BX5 + + dương tính 8 Bắp tươi BT1 - - âm tính 9 Bắp tươi BT2 - - âm tính 10 Bắp tươi BT3 + - dương tính 11 Bắp tươi BT4 - - âm tính 12 Bắp tươi BT5 - + dương tính 13 Bắp tươi BT6 - - âm tính 14 Bắp tươi BT7 - - âm tính 15 Bắp tươi BT8 - âm tính 16 Bắp tươi BT9 - - âm tính 17 Bắp tươi BT10 + - dương tính Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 345 18 Bắp tươi BT11 - + dương tính 19 Bắp hộp BH1 - - âm tính 20 Bắp hộp BH2 - - âm tính 21 Bắp hộp BH3 - - âm tính 22 Bắp hộp BH4 - - âm tính 23 Bắp hộp BH5 - - âm tính 24 Bắp hộp BH6 - - âm tính 25 Bắp hộp BH7 + - dương tính Hình 1. Kết quả hình ảnh ñiện di sàng lọc GMO bằng promoter 35S trên mẫu bắp và sản phẩm bắp Qua kết quả phân tích trên bảng 3 và hình 1 và 2 cho thấy trong số 25 mẫu bắp có 10/25 mẫu có sự hiện diện của biến ñổi gen, chiếm tỷ lệ 40%, trong ñó có 4/25 mẫu phát hiện có dương tính với promoter 35S và Terminator HSnos, chiếm tỷ lệ 16% và có 5/25 mẫu dương tính với promoter 35S, chiếm tỷ lệ 20% và có 2/25 mẫu phát hiện có dương tính với Terminator HAnos, chiếm tỷ lệ 8,8%. Hình 2. Kết quả hình ảnh ñiện di sàng lọc GMO bằng Terminator nos trên mẫu bắp và sản phẩm bắp Bảng 4: Kết quả sàng lọc các biến ñổi gen bằng promoter 35S và Terminator HAnos của ñậu nành và sản phẩm ñậu nành TT Tên mẫu Mã số Promoto r 35S Termin ator nos Kết quả 1 Đậu nành hạt ĐK1 - - âm tính 2 Đậu nành hạt ĐK2 + + dương tính 3 Đậu nành hạt ĐK3 + + dương tính 4 Đậu nành hạt ĐK4 + + dương tính TT Tên mẫu Mã số Promoto r 35S Termin ator nos Kết quả 5 Đậu nành hạt ĐK5 + + dương tính 6 Đậu nành hạt ĐK6 - + dương tính 7 Đậu nành hạt ĐK7 - - âm tính 8 Đậu nành xay ĐX1 + + dương tính 9 Đậu nành xay ĐX2 + + dương tính 10 Đậu nành ĐX3 + + dương Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 346 TT Tên mẫu Mã số Promoto r 35S Termin ator nos Kết quả xay tính 11 Đậu nành xay ĐX4 + + dương tính 12 Đậu nành xay ĐX5 + + dương tính 13 Đậu nành xay ĐX6 + + dương tính 14 Đậu nành xay ĐX7 + - dương tính 15 Đậu nành xay ĐX8 - + dương tính 16 Đậu nành xay ĐX10 - - âm tính 17 Đậu nành xay ĐX11 + - dương tính 18 Đậu nành xay ĐX12 - - âm tính 19 Đậu nành xay ĐX13 - - âm tính 20 Đậu nành xay ĐX14 - - âm tính 21 Đậu nành xay ĐX15 + - dương tính Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 347 Hình 3. Kết quả ñiện di sàng lọc GMO bằng Promoter 35S và Terminator HAnos trên một số mẫu ñậu nành và sản phẩm ñậu nành Qua kết quả phân tích trên bảng 4 và hình 3 cho thấy trong số 21 mẫu ñậu nành và sản phẩm ñậu nành có 15/21 mẫu có sự hiện diện biến ñổi gen, chiếm tỷ lệ 71,4%, trong ñó có 10/21 mẫu phát hiện dương tính với promoter 35S và Terminator HAnos, chiếm tỷ lệ 47,6%: có 3/21 mẫu dương tính với Promoter 35S, chiếm tỷ lệ 14,3% và có 2/21 mẫu dương tính với Terminator HAnos chiếm tỷ lệ 9,5%. KẾT LUẬN - Sử dụng bộ kít Promega ñể chiết tách DNA cho hàm lượng DNA ñủ, ñể xác ñịnh GMO trong sản phẩm bắp và ñậu nành. - Đã khảo sát ñược 25 mẫu bắp và các sản phẩm bắp và 21 mẫu ñậu nành, kết quả sàng lọc cho thấy mẫu bắp có chứa sự hiện diện GMO chiếm tỷ lệ là 40% và mẫu ñậu nành là 71,4%. KIẾN NGHỊ - Xác ñịnh GMO trong các sản phẩm ngủ cốc làm cơ sở cho việc qui ñịnh dán nhãn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Brandnor DL. (2002), PCR-based detection of genetically modified Food ISO 21571 : 2005, Foodstuffs- Mehtod of analysis for the detection of genetically modified organism and derived products- nucleotic acid extraction method ISO 21571:2005 Foodstuffs- Method of analysis for the detection of genetically modified organism and derived products- Quanlitative nucleotic acid based method. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7605:2007 (ISO 21569:2005). Thực phẩm- Phương pháp phân tích ñể phát hiện sinh vật biến ñổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến ñổi gen-Phương pháp dựa trên ñịnh tính axit nucleic. Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7606:2007 (ISO 21571:2005). Thực phẩm- Phương pháp phân tích ñể phát hiện sinh vật biến ñổi gen và sản phẩm có nguồn gốc biến ñổi gen- Tách chiết axít nucleic. 35S nos