Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa bụp giấm (Hibiscus Sabdariffa L. Malvaceae) trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính bằng Ethanol

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 75 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA BỘT SẤY PHUN TỪ ĐÀI HOA BỤP GIẤM (HIBISCUS SABDARIFFA L. MALVACEAE) TRÊN CHUỘT NHẮT TỔN THƯƠNG TẾ BÀO GAN CẤP TÍNH BẰNG ETHANOL Lê Thị Lan Phương*, Phạm Huy Kiến Tài*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mở đầu: Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) là một loài cây nhiệt đới đã được trồng ở Việt Nam hơn 10 năm nay. Bộ phận thường sử dụng là đài hoa với hàm lượng anthocyanin toàn phần khá cao đã được nghiên cứu bào chế thành dạng chế phẩm bột sấy phun, tuy nhiên, các nghiên cứu về công dụng của dạng chế phẩm này còn rất ít. Mục tiêu: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (BSP) trên chuột nhắt trắng tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol. Phương pháp: Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của BSP với liều 450 mg/kg (1/20 Dmax) và 900 mg/kg (1/10 Dmax) sử dụng trong 14 ngày trên mô hình gây tổn thương gan cấp tính bằng ethanol 40%, 5 g/kg, 3 lần, cách nhau 12 giờ. Định lượng AST, ALT trong máu; MDA, GSH trong gan 4 giờ sau liều ethanol cuối và sinh thiết gan chuột. Kết quả: Liều 450 mg BSP/kg, làm giảm men gan AST 27% (p <0,01), ALT 25% (p < 0,05), MDA 30% (p < 0,01) và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan so với nhóm gây độc. Không có sự khác biệt về nồng độ GSH giữa các nhóm nghiên cứu. Kết luận: BSP thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol. Tác dụng này phụ thuộc liều sử dụng. Từ khóa: Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, ethanol.. ABSTRACT EVALUATING THE PROTECTIVE EFFECT OF DRY POWDER OF HIBISCUS SABDARIFFA CALYCES ON ETHANOL-INDUCED ACUTE HEPATOTOXICITY IN MICE Le Thi Lan Phuong, Pham Huy Kien Tai, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 75 - 79 Background and aimed: The calyce of Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae with high quantity of total anthocyanin has been used in Vietnam since 10 years. However, there is none researchs about its hepato protective effects. The present study was designed to evaluate the hepatoprotective effect of dry powder from Hibiscus’s calyce on ethanol-induced acute hepatotoxicity in mice. Method: Studying the hepatoprotective effect of BSP at dose of 450 mg/kg (1/20 Dmax) and 900 mg/kg (1/10 Dmax). Using BSP during 14 days in acute hepatotoxicity mice by ethanol 40%, p.o., 5 g/kg x 3 times each 12 h. Quantifying level AST, ALT, MDA, GSH 4 hours after the last dose of ethanol and test histopathological liver of mice. Results: The dose of 450 mg/kg BSP (1/20 Dmax) showed significant reduction in AST level by 27% (p < ∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS.DS. Lê Thị Lan Phương ĐT: 0907748591 Email: lanphuongd04@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 76 0.01), ALT level by 25% (p < 0.05), MDA 30 % (p < 0.01) and also reduced microvesicular in acute hepatotoxicity mice. However, no significant change in GSH level was observed. Conclusion: The results indicate that BSP exhibit the hepatoprotective effect on ethanol-induced acute hepatotoxicity which belongs to the used dose in mice. Key words: Hepatoprotective, Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, ethanol. MỞ ĐẦU Trong nguồn nguyên liệu thiên nhiên vô cùng phong phú của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, có rất nhiều động thực vật và khoáng vật đã được dùng làm cây thuốc và vị thuốc giúp phục vụ cho việc bảo vệ và nâng cao sức khỏe. Một trong số đó là Bụp giấm, tên khoa học Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae, một loài cây nhiệt đới có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, đã được trồng ở Việt Nam hơn 10 năm nay với bộ phận thường được thu hoạch sử dụng là đài hoa. Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy thành phần của đài hoa Bụp giấm có chứa nhiều các hoạt chất chống oxy hóa rất tốt như anthocyanin, acid protocatechic, acid ascorbic cũng như các vi chất như magie, kali(4) giúp hỗ trợ điều trị các bệnh lý rối loạn mỡ máu, tăng huyết áp, chống ung thư.... Ngoài những tác dụng trên, Bụp giấm còn có tác dụng bảo vệ gan và đã được chứng minh trên mô hình thực nghiệm gây tổn thương gan bằng paracetamol và carbon tetrachlorid...(1,2). Hiện nay, loại cây này đang được trồng ở Bình Thuận với quy mô rộng, đạt tiêu chuẩn VietGAP và nghiên cứu sản xuất thành công dạng bột sấy phun từ đài hoa, đây là nguyên liệu phù hợp để sản xuất các dạng chế phẩm trong tương lai. Tuy nhiên, dạng bột sấy phun này chỉ mới được nghiên cứu về tác dụng hạ lipid máu ở liều 450 mg/kg (1/20 Dmax) và 900 mg/kg (1/10 Dmax) trên chuột nhắt tăng lipid máu nội sinh và ngoại sinh(3). Với mong muốn góp phần nghiên cứu một chế phẩm điều hòa lipid máu đồng thời có tác dụng bảo vệ gan để có thể sử dụng phối hợp điều trị hoặc làm giảm các tác dụng không mong muốn trên gan khi sử dụng dài ngày các thuốc tân dược điều trị rối loạn lipid máu(9), chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá tác dụng bảo vệ gan của bột sấy phun đài hoa Bụp giấm trên chuột nhắt tổn thương gan cấp tính bằng ethanol. PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu Bột sấy phun (BSP) từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) do Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu Miền trung cung cấp, chứa 0,215% anthocyanin toàn phần, độ ẩm < 5%, có màu đỏ nâu, đạt yêu cầu về độ mịn, độ nhiễm khuẩn, kim loại nặng, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật. Phương tiện Ethanol dược dụng (99,5%). Thuốc đối chiếu: Silymarin 10g – Sigma. Thiết bị xét nghiệm: Máy sinh hóa tự động Biolis 24i. Súc vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng phái đực, trưởng thành (5 – 6 tuần tuổi), chủng Swiss abino, nặng 18 – 22 g được cung cấp bởi viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh. Chuột được nuôi ở nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 giờ sáng/tối, mỗi lồng 6 – 8 chuột, sử dụng thức ăn là cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp, carbohydrat và vitamin trong suốt thử nghiệm. Phương pháp nghiên cứu (7) Chuột thử nghiệm nuôi ổn định trước 1 tuần, chia chuột làm 5 nhóm (n = 7). Hai tuần trước khi gây mô hình, nhóm chứng và nhóm gây độc được cho uống nước cất, nhóm đối chiếu uống silymarin 50 mg/kg, nhóm thử 1 uống BSP liều 450 mg/kg (1/20 Dmax), nhóm thử 2 uống BSP liều 900 mg/kg (1/10 Dmax) với thể tích 10 ml/kg vào 8 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 77 – 9 giờ sáng. Ở ngày thứ 15, tất cả các lô, trừ lô chứng, uống ethanol 40% liều 5 g/kg x 3 lần mỗi 12h (7h sáng, 7h tối, 7h sáng). 4 giờ sau khi gây độc bằng ethanol, chuột được gây mê bằng đá CO2, tiến hành giải phẫu lấy máu tim và gan, thực hiện các xét nghiệm xác định AST, ALT, MDA và GSH. Tách lọc gan để khảo sát hình thái mô học. Phương pháp xác định hàm lượng các aminotransferase (AST và ALT) Chuột sau khi bị gây mê sẽ được lấy máu toàn phần từ tim và đựng trong ống có chứa chất chống đông heparin, ly tâm lấy huyết thanh định lượng AST, ALT. Phương pháp xác định hàm lượng malondialdehyde (MDA) và glutathione (GSH) Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15% theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0 -5oC. Lấy 2 ml dịch đồng thể thêm vào 1 ml dung dịch đệm Tris - HCl, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, và lấy dịch trong. Tiến hành định lượng hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột như sau: Xác định hàm lượng MDA(6) Lấy 2 ml dung dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 15 phút và đo quang ở bước sóng λ = 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy chất chuẩn MDA. y = 0,0637x – 0,0029 (R2 = 0,9981)
CnMMDA/ml dịch đt = (OD thử + 0,0029) / 0,0637 Hàm lượng MDA (nM/g protid): C = CnMMDA/ml dịch đồng thể x 1000 / Cprotid Với Cprotid = 36,629 (mg protid / ml dịch đồng thể ) Hàm lượng MDA trong các mẫu thử (nM/ml): C thử = (ODthử / ODchuẩn) x Cchuẩn Trong đó: OD là mật độ đo quang; C là Hàm lượng MDA (nM/ml) Hoạt tính chống oxy hoá (HTCO): HTCO (%) = ((CMDA chứng - CMDA thử) / CMDA chứng ) / 100 Xác định hàm lượng GSH (5) Lấy 1ml dịch trong cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA phosphate vừa đủ 3 ml. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/g protid) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH. y = 0,0022x – 0,0334 (R2 = 0,998) → CnMMDA/ ml dịch đồng thể = (OD thử + 0,0334) / 0,0022 Hàm lượng GSH (nM/g protid): C = CnMGDH/ml dịch đồng thể x 1000 / Cprotid Với Cprotid = 36,629 (mg protid / ml dịch đồng thể ) Giải phẫu bệnh Sau khi lấy máu, chuột được mổ, tách gan và thận chuột, cố định trong dung dịch formol 10%. Sau đó mẫu mô được xử lý bằng các phương pháp thường quy và đúc tiêu bản trong paraffin và cắt thành lát dày 4 μm để nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) để quan sát trên kính hiển vi ở vật kính hiển vi, độ phóng đại 40 và 100 lần(8). Phương pháp thống kê – xử lý dữ liệu Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD). Phân tích số liệu bằng phép kiểm t-test và Anova một chiều, một yếu tố với phần mềm Minitab 15.0. KẾT QUẢ Tác dụng của BSP trên chuột nhắt gây tổn thương gan cấp tính bằng ethanol Ở lô gây độc bằng ethanol, các chỉ số AST, ALT tăng có ý nghĩa thống kê (p < 0,001), MDA tăng (p < 0,05) so với nhóm chứng, đồng thời kết quả sinh thiết gan cho thấy có sự tổn thương gan, hoại tử ở mức độ nhẹ và có biểu hiện của phản ứng viêm trong tế bào. Nhóm uống silymarin có giá trị AST giảm (p < 0,05), ALT và MDA giảm (p < 0,01) và mức độ viêm tại tế bào gan cũng giảm so với nhóm gây độc. Nhóm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 78 uống BSP với liều 450 mg/kg có giá trị AST giảm (p < 0,01), ALT giảm (p < 0,05) và MDA giảm (p < 0,01) so với nhóm gây độc. Nhóm uống BSP liều 900 mg/kg có biểu hiện giảm AST, ALT và MDA so với nhóm gây độc nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê. Sinh thiết gan cho thấy mức độ giảm tổn thương gan ở nhóm uống BSP 450 mg/kg. Giá trị GSH không có sự khác biệt giữa các nhóm thử nghiệm. Bảng 1. Kết quả định lượng AST, ALT, MDA và GSH của các nhóm thử nghiệm Lô chuột AST (U/L) ALT (U/L) MDA (nM/g protein) GSH (nM/g protein) Chứng 101,8 ± 21,77 50,0 ± 11,46 103,82 ± 18,25 11091,91 ± 1710 Gây độc 191,4 ± 44,60*** 88,6 ± 19,55*** 157,88 ± 43,30* 11887,89 ± 1598 Silymarin 50 mg/kg 144,6 ± 40,65*# 73,1 ± 17,26** 89,32 ± 16,40## 10960,73 ± 2168 BSP 450 mg/kg (BG1) 139,8 ± 27,57**## 66,8 ± 15,46*# 110,90 ± 18,74## 9200,36 ± 623 BSP 900 mg/kg (BG2) 166,4 ± 33,46*** 82,1 ± 20,98** 117,14 ± 40,96 10118,66 ± 2643 P * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 so với nhóm chứng; P # < 0,05, ## < 0,01 so với nhóm gây độc. Bảng 2. Kết quả vi phẫu gan của các nhóm thử nghiệm (mức độ tăng của các nhóm so với nhóm chứng uống nước cất) Tế bào gan thoái hóa mỡ TB gan hoại tử Xâm nhập TB viêm đơn nhân Xâm nhập TB viêm đa nhân Viêm khoảng cửa Tăng sinh tái tạo TB gan Độc Tăng 2% loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy, 2% loại không bào lớn trong tiểu thùy và quanh TMTT tiểu thùy + 0 + + 0 Silymarin Tăng 0,4 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy 0 0 0 0 0 BG1 Tăng 1,5 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy 0 0 0 0 0 BG2 Tăng 5 % loại không bào nhỏ rải rác trong tiểu thùy + 0 + 0 0 Kết quả được đọc bởi Khoa Giải Phẫu Bệnh – Bệnh viện Chợ Rẫy TP.Hồ Chí Minh Hình 1. Giá trị men gan AST, ALTcủa các nhóm thử nghiệm. P: * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 so với nhóm chứng, # < 0,05, ## < 0,01 so với nhóm gây độc Hình 2. Giá trị MDA, GSH của các nhóm thử nghiệm. P: * < 0,05, ** < 0,01, *** < 0,001 so với nhóm chứng, # < 0,05, ## < 0,01 so với nhóm gây độc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 79 KẾT LUẬN Bột sấy phun đài hoa Bụp giấm đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột nhắt gây tổn thương tế bào gan cấp tính bằng ethanol 40%, 5 g x 3 lần. Liều 450 mg/kg bột sấy phun làm giảm men gan AST 27%, ALT 25%, MDA 30% và làm giảm mức độ viêm, hoại tử tế bào gan. Những nghiên cứu trước đây được thực hiện trên những giống chuột khác nhau đã cho thấy tác dụng bảo vệ gan của đài hoa Bụp giấm trên mô hình gây độc gan bằng acetaminophen, bằng CCl4 qua việc đánh giá các chỉ tiêu AST, ALT, MDA, GSH, sinh thiết gan,... Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu được công bố về tác dụng của Bụp giấm trên mô hình gây độc cấp tính bằng ethanol. Nhóm tác giả xin cảm ơn Sở khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tài trợ kinh phí thông qua Chương trình Vườn ươm sáng tạo khoa học và công nghệ trẻ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ali BH, Mousa HM, El-Mougy S (2003). "The effect of a water extract and anthocyanins of Hibiscus sabdariffa L. on paracetamol-induced hepatoxicity in rats". Phytother Res, 17(1), pp. 56 - 59. 2. Dahiru D, Obi OJ, Umaru H (2003). "Hibiscus sabdariffa extract enhances the recovery from hepatic damage induced by carbon tetrachloride". Biokemistri, 15(1), pp. 27 - 33. 3. Lê Thị Lan Phương, Nguyễn Phương Dung (2013). "Đánh giá tác dụng điều hòa lipid máu của bột sấy phun từ đài hoa Bụp giấm (Hibiscus sabdariffa L. Malvaceae) trên chuột nhắt". Tạp chí Y học, 17 (Phụ bản của số 1), tr. 369 - 373. 4. Mahadevan N, et al. (2009). "Hibiscus sabdariffa Linn.–An overview". Natural Product Radiance, 8(1), pp.77 - 83. 5. Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Trần Mỹ Tiên, Trần Công Luận, Phạm Khánh Biền (2008)."Nghiên cứu tác dụng dược lý thực nghiệm của chế phẩm “Kỷ thược địa hoàng gia vị” theo hướng tăng cường thể trạng và chức năng gan". Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, 12 (phụ bản của số 4), tr. 152 - 158. 6. Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2010). "Nghiên cứu chống oxy hoá theo hướng bảo vệ gan của nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum)". Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh, 14 (phụ bản số 2), tr. 129 - 134. 7. Song Z, Deaciuc I, Song M, Lee DY, Liu Y, Ji X, et al. (2006). "Silymarin Protects Against Acute Ethanol-Induced Hepatotoxicity in Mice". Alcohol Clin Exp Res, 30(3), pp. 407 - 413. 8. Tuñón MJ, Alvarez M, Culebras JM, González-Gallego J (2009). "An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure". World J Gastroenterol, 15 (25), pp. 3086 - 3098. 9. Trần Thị Thu Hằng (2009). Dược lực học, Nhà xuất bản Phương Đông, tr. 569 - 583. 10. Võ Văn Chi (2012). Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y Học Hà Nội, tập 1, tr. 265 – 266. Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/10/2013, 17/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014