Mở đầu
Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê năm 2008, cả nước có 26,7 triệu con lợn, sản lượng thịt lợn hơi đạt 2.771.000 tấn, chiếm tỷ lệ 73,9% tổng sản lượng thịt gia súc, gia cầm [20]. Ngành chăn nuôi lợn ở nước ta đã khẳng định được tầm quan trọng và đòi hỏi sự phát triển mạnh mẽ trong tương lai. Xuất phát từ nhu cầu ấy, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã đề ra kế hoạch đến năm 2010 phải đạt bình quân đầu người 35 kg thịt lợn hơi. Cả nước sẽ có 30 triệu con lợn với chất lượng đàn lợn thịt có tỷ lệ nạc cao đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu [20].
Tuy nhiên, việc phát triển đàn lợn cũng làm xuất hiện các loại bệnh, ảnh hưởng không nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi. Trở ngại lớn nhất hiện nay, đặc biệt trong các cơ sở chăn nuôi lợn sinh sản là bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi và phù đầu ở lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi. Bệnh không chỉ phổ biến ở nước ta mà còn xuất hiện khắp thế giới, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn sinh sản. Bệnh xuất hiện lúc ồ ạt, lúc lẻ tẻ tùy thuộc vào thời tiết, khí hậu, điều kiện chăm sóc, quản lý. Tỷ lệ lợn mắc bệnh cao, từ 70 - 85%, có những nơi 100%, tỷ lệ chết tới 18 - 20% [3]. Đặc biệt, tại các trại chăn nuôi lợn tập trung, bệnh càng gây thiệt hại đáng kể [21].
Để chống lại bệnh do E. coli, các nhà chăn nuôi đã sử dụng nhiều phương thuốc, từ cổ truyền đông y đến các liệu pháp kháng sinh hiện đại, kể cả các phương pháp hoá sinh hay dinh dưỡng kỹ thuật cao, nhưng cũng chỉ khống chế được một phần. ở Việt Nam nhiều biện pháp áp dụng đã mang lại kết quả, trong đó tác dụng cao nhất là dùng thuốc kháng sinh. Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh đã giảm bớt đáng kể tổn thất do dịch bệnh. Tuy nhiên, các nhà khoa học trong nước khẳng định E. coli đã kháng thuốc với tỷ lệ cao và kháng nhiều loại thuốc kháng sinh khác nhau [8], [19]. Bên cạnh đó mặt trái của thuốc kháng sinh ngày càng lộ rõ, việc dùng thuốc kháng sinh kéo dài đã tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi trong đường ruột. Hậu quả là lợn con còi cọc, chậm lớn, lông xù, thịt lợn bị tồn dư kháng sinh, ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và giảm giá trị thịt lợn xuất khẩu.
Xu hướng dùng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi là liệu pháp đúng đắn mà thế giới đang yêu cầu và phát triển. Không chỉ giới hạn trong mục đích phòng trị bệnh, nâng cao năng suất chăn nuôi, việc sử dụng chế phẩm sinh học còn có ý nghĩa quan trọng đối với môi trường và sức khoẻ cộng đồng vì nó tạo ra một nền sản xuất thực phẩm an toàn, đảm bảo sự ổn định trạng thái cân bằng của môi trường sinh thái.
Muốn đạt được yêu cầu đó, việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học an toàn để phòng và chữa bệnh cho vật nuôi đang đòi hỏi cấp bách. Dựa trên cơ sở miễn dịch học và phản ứng kháng nguyên - kháng thể người ta đã sản xuất được nhiều loại kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh động vật để chữa bệnh, nhưng giá thành cao, khi dùng dễ gây phản ứng huyết thanh nên ít được sử dụng rộng rãi.
Gần đây người ta phát hiện ra rằng, khi gà được tiêm kháng nguyên, kháng thể ở máu được truyền sang lòng đỏ trứng tới 80%, đặc biệt là thành phần IgG. Kháng thể đặc hiệu chế từ lòng đỏ trứng gà được miễn dịch sẽ có nhiều ưu thế hơn hẳn so với kháng thể đặc hiệu chế từ huyết thanh động vật, vì khi ứng dụng vào sản xuất nó có thể sản xuất với số lượng lớn, giá thành sản xuất thấp, không phải giết động vật và khi dùng không xảy ra phản ứng phụ. Cho đến nay đã có nhiều công trình ở các nước như: Đức, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc công bố về việc chế tạo và sử dụng kháng thể ở lòng đỏ để điều trị và phòng nhiều bệnh vật nuôi có hiệu quả cao. Qua gà, người ta đã thu được nhiều loại kháng thể chống lại các vi rút, vi khuẩn, độc tố, nọc rắn, các hoá chất . để dùng cho các xét nghiệm chẩn đoán y học [36].
Để có thể sớm tạo ra một loại thuốc phòng và chữa trị hiệu quả, an toàn bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli gây ra ở lợn, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn", với hai mục tiêu sau:
Phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng E. coli gây bệnh điển hình có độc lực, có tính kháng nguyên mạnh để làm giống.
Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học đặc hiệu – kháng thể phòng và chữa bệnh tiêu chảy và sưng phù đầu của lợn do E. coli.
86 trang |
Chia sẻ: banmai | Lượt xem: 1832 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sưng phù đầu do E. coli ở lợn, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
vµ sng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i trong nghiªn cøu nµy ngoµi viÖc chÕ t¹o kh¸ng thÓ chèng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn th©n cña vi khuÈn, cßn ph¶i chÕ t¹o ®îc c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu ®Ó trung hßa ®éc tè cña vi khuÈn. §Ó cã thÓ chÕ t¹o ®îc kh¸ng thÓ kh¸ng ®éc tè, bíc ®Çu tiªn lµ chÕ t¹o ®îc kh¸ng nguyªn ®éc tè an toµn ®Ó miÔn dÞch cho ®éng vËt thÝ nghiÖm.
3.2.1. Nghiªn cøu ®éng th¸i sinh trëng cña E. coli
Tõ bé gièng gåm 10 chñng E. coli ph©n lËp ®îc, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®éng th¸i sinh trëng cña vi khuÈn trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh©n t¹o. Chóng t«i nu«i cÊy 10 chñng E. coli ë ®iÒu kiÖn 370C, sau ®ã theo dâi sù biÕn ®éng vÒ sè lîng vi khuÈn vµ pH sau 24, 48 vµ 72 giê nu«i cÊy. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 11.
B¶ng 11: §éng th¸i sinh trëng cña c¸c chñng E. coli trong bé gièng ®· chän
Chñng E. coli
Thêi gian nu«i cÊy (®iÓm kh¶o s¸t)T
0h (1)
24h (2)
48h (3)
72h (4)
Hanco 1
CFU(107/ml)
0
142.0
85.5
52.25
pH
7.2
5.62
7.01
7.31
Hanco 2
CFU(107/ml)
0
115
83.5
52
pH
5.76
6.46
7.73
Hanco 3
CFU(107/ml)
0
129.5
75.5
22.6
pH
7.2
5.72
6.01
7.81
Hanco 4
CFU(107/ml)
0
103.5
73.9
32.5
pH
7,2
5.61
6.03
6.21
Hanco 5
CFU(107/ml)
0
107
74.9
40
pH
7,2
5.66
5.98
6.39
Hanco 6
CFU(107/ml)
0
108
74.6
39
pH
7,2
5.73
6.95
7.48
Hanco 7
CFU(107/ml)
0
26.5
18.7
16
pH
7,2
5.88
6.52
7.17
Hanco 8
CFU(107/ml)
0
141
98.5
64
pH
7,2
5.96
6.58
7.77
Hanco 9
CFU(107/ml)
0
129.5
62.1
35.7
pH
7,2
5.65
6.25
7.12
Hanco 10
CFU(107/ml)
0
132
68.5
24
pH
7,2
5.74
6.72
7.30
3.2.2. Nghiªn cøu m«i trêng vµ ®iÒu kiÖn nu«i cÊy thÝch hîp ®Ó s¶n sinh ®éc tè E. coli.
Song song víi nghiªn cøu ®éng th¸i sinh trëng cña vi khuÈn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thö ®éc lùc cña dÞch nu«i cÊy theo tõng c«ng thøc vµ m«i trêng kh¸c nhau b»ng c¸ch tiªm cho chuét b¹ch.
Chóng t«i ®· chÕ t¹o 9 lo¹i m«i trêng víi c¸c chØ tiªu dinh dìng kh¸c nhau (phï hîp víi yªu cÇu dinh dìng cña E. coli trong ®iÒu kiÖn nu«i cÊy nh©n t¹o) nh»m t×m kiÕm mét m«i trêng thÝch hîp cho sù sinh trëng vµ s¶n sinh ®éc tè cña E. coli. ChØ tiªu dinh dìng cña c¸c lo¹i m«i trêng ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 12.
B¶ng 12: ChØ tiªu dinh dìng cña c¸c m«i trêng nu«i cÊy
M«i trêng
§¹m amin (mg/ml)
Tryptophan (mg%)
Pepton (gr%)
NaCl
(%)
pH
MT1
1.297
17.5
2.1
0.351
7.15
MT2
2.330
50.0
2.8
1.390
7.00
MT3
1.760
25.0
2.2
0.769
7.13
MT4
0.440
11.0
2.4
0.910
7.26
MT5
1.205
34.0
2.6
0.806
7.40
MT6
2.160
20.0
3.0
0.720
7.22
MT7
2.820
15.0
3.0
0.860
6.97
MT8
1.650
24.0
3.0
0.430
7.04
MT9
1.360
20.9
2.07
0.183
7.27
Víi 9 lo¹i m«i trêng ë trªn, chóng t«i nu«i cÊy chñng Hanco 3 víi c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau ®Ó theo dâi sù liªn quan gi÷a ®éng th¸i sinh trëng víi ®éc lùc cña níc läc canh trïng (®éc tè) trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm
Sau khi nu«i cÊy trªn c¸c m«i trêng cã c¸c c«ng thøc nu«i cÊy kh¸c nhau, dÞch nu«i cÊy sèng ®îc ly t©m ë 7000g/15 phót, thu phÇn níc trong, läc qua mµng läc cã kÝch thíc lç läc 0,2 μm, dung dÞch thu ®îc sau khi läc gäi lµ dÞch chøa ®éc tè, ký hiÖu lµ T2, chóng t«i tiÕn hµnh tiªm dÞch qua läc T2 cho chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®éc lùc giÕt chuét ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 13.
B¶ng 13: §éc lùc cña dÞch nu«i cÊy ®îc x¸c ®Þnh b»ng c¸ch tiªm dÞch qua läc T2
M«i trêng
Tû lÖ chÕt/ tiªm
§êng tiªm
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5
CT6
CT7
CT8
CT9
MT1
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
0/4
0/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
1/4
1/4
0/4
1/4
MT2
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
0/4
1/4
1/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
1/4
0/4
1/4
0/4
MT3
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
MT4
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
0/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
1/4
0/4
1/4
0/4
MT5
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
0/4
0/4
1/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
1/4
1/4
0/4
MT6
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
1/4
1/4
0/4
1/4
MT7
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
0/4
0/4
MT8
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
1/4
1/4
1/4
0/4
1/4
MT9
DD
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
FX
0/4
0/4
0/4
0/4
2/4
1/4
1/4
1/4
1/4
TM
0/4
0/4
0/4
0/4
2/4
2/4
2/4
1/4
2/4
Qua b¶ng 13 chóng t«i thÊy ®éc tè nµy yÕu, tiªm díi da kh«ng ph¸t hiÖn ®îc (chuét kh«ng chÕt) mµ chØ ph¸t hiÖn ®îc b»ng tiªm phóc xoang hoÆc tÜnh m¹ch. Còng tõ kÕt qu¶ trªn, chóng t«i thÊy m«i trêng 9 lµ m«i trêng mµ E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. C¸c c«ng thøc nu«i cÊy 5, 6, 7, 8, 9 lµ nh÷ng c«ng thøc nu«i cÊy mµ E. coli cã thÓ s¶n sinh ®éc tè. Chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm lÆp l¹i nh÷ng c«ng thøc nµy trªn m«i trêng 9. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 14.
B¶ng 14: §éc lùc ®îc x¸c ®Þnh víi liÒu tiªm vµ ®êng tiªm kh¸c nhau
Tû lÖ chuét chÕt
C«ng thøc
Tiªm phóc xoang
Tiªm tÜnh m¹ch
∑sè chuét chÕt /chuét tiªm
0,2ml
0,4ml
0,2ml
0,4ml
CT5
1/4
2/4
1/4
3/4
7/12
CT6
0/4
1/4
0/4
2/4
3/12
CT7
0/4
1/4
1/4
2/4
4/12
CT8
0/4
1/4
0/4
1/4
2/12
CT9
0/4
1/4
0/4
2/4
3/12
§C
0/4
0/4
0/4
0/4
0/16
Ghi chó: §C - §èi chøng lµ m«i trêng v« trïng
Qua b¶ng 14 chóng t«i thÊy víi c«ng thøc 5 E. coli s¶n sinh ®éc tè m¹nh nhÊt. LÆp l¹i vµ më réng, chóng t«i chÕ t¹o dÞch nu«i cÊy ®éc tè víi tõng chñng E. coli b»ng m«i trêng 9 vµ nu«i cÊy theo c«ng thøc 5, sau ®ã kiÓm tra ®éc lùc dÞch nu«i cÊy víi tõng chñng vµ ®a chñng (trén 10 chñng) b»ng c¸ch: tiªm 0,4 ml/con dÞch qua läc T2 vµo tÜnh m¹ch chuét b¹ch, theo dâi tû lÖ chuét chÕt/tiªm. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 15.
B¶ng 15: §éc lùc cña ®éc tè T2 do c¸c chñng E. coli riªng rÏ vµ kÕt hîp t¹o ra
Gièng Hanco
§êng tiªm/ liÒu tiªm (ml)
Sè chuét TN
(con)
Sè chuét èm/tiªm
Tû lÖ èm (%)
Sè chuét chÕt/tiªm
Tû lÖ chÕt (%)
Hanco 1
TM/0.4
5
4/5
80
0/5
0
Hanco 2
TM/0.4
5
5/5
100
0/5
0
Hanco 3
TM/0.4
5
5/5
100
1/5
20
Hanco 4
TM/0.4
5
5/5
100
2/5
40
Hanco 5
TM/0.4
5
5/5
100
2/5
40
Hanco 6
TM/0.4
5
5/5
100
5/5
100
Hanco 7
TM/0.4
5
5/5
100
2/5
40
Hanco 8
TM/0.4
5
5/5
100
2/5
40
Hanco 9
TM/0.4
5
5/5
100
2/5
40
Hanco 10
TM/0.4
5
4/5
80
0/5
0
Poly (§a gi¸)
TM/0.4
5
5/5
100
4/5
80
§èi chøng
TM/0.4
5
0/5
0
0/5
0
Ghi chó: §C - §èi chøng lµ m«i trêng v« trïng
“chuét èm” lµ chuét sau khi tiªm rÊt mÖt, thë m¹nh, thë dèc, l«ng dùng lªn, n»m gôc, kh«ng muèn ho¹t ®éng, tô thµnh tõng ®¸m, bá ¨n. Cã con thØnh tho¶ng bÞ co dËt, cã con ®iªn cuång, ch¹y lung tung, cã con liÖt ch©n sau, ®i kÐo lª trªn sµn. Tríc khi chuét chÕt cã thÓ co dËt hoÆc kh«ng; còng cã trêng hîp chuét chÕt nhanh, co dËt mÊy lÇn råi chÕt, sau 48 giê con nµo kh«ng chÕt th× håi phôc dÇn.
KÕt qu¶ cho thÊy tõng chñng cã ®éc lùc cña ®éc tè kh¸c nhau, tõng chñng cã thÓ lµm chuét chÕt hoÆc èm kh¸c nhau (chuét ®èi chøng kh«ng cã hiÖn tîng nµy). Nhng ë ®éc tè poly (trén nhiÒu chñng) th× ®éc lùc thÓ hiÖn râ rÖt. §ã lµ sù céng hëng cña c¸c ®éc tè.
V× vËy, môc tiªu cña chóng t«i lµ chÕ t¹o kh¸ng nguyªn cã chøa hçn hîp ®éc tè cña nhiÒu chñng E. coli, ®Ó kh¸ng thÓ thu ®îc cã thÓ ®èi phã víi tÝnh phøc t¹p cña E. coli vµ tÝnh ®a d¹ng bÖnh cña nã g©y ra còng nh dÞch tÔ häc cña c¸c bÖnh nµy trong thùc tÕ ch¨n nu«i.
3.3. Nghiªn cøu ph¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn
3.3.1. Nghiªn cøu ph¬ng ph¸p lµm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc
KÕ thõa nh÷ng nghiªn cøu tríc ®©y vÒ E. coli vµ ®éc tè E. coli, chóng t«i tiÕn hµnh thö nghiÖm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn b»ng c¸c ph¬ng ph¸p sau:
+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ë nhiÖt ®é 700C trong 30 phót.
+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 3 0/00.
+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng phenol 5 0/00.
+ BÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng thiomersal 0,40/00.
M«i trêng sau khi nu«i cÊy ®¹t tiªu chuÈn ®îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè, ®îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng c¸c ph¬ng ph¸p trªn. DÞch nu«i sau khi xö lý, ®îc ®Æt trong tñ Êm 370C trong 24h.
Sau ®ã chóng t«i tiÕn hµnh kiÓm tra v« trïng theo thêng quy trªn c¸c m«i trêng kh¸c nhau ®Ó xem ë ®iÒu kiÖn ®ã cã bÊt ho¹t ®îc vi khuÈn hay kh«ng. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 16.
B¶ng 16: KÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t
Canh trïng xö lý
KÕt qu¶ kiÓm tra trªn m«i trêng
KÕt qu¶
NA
NB
BA
SA
Thio
700C/30 phót
-
-
-
-
-
§¹t
Formol 3 0/00
-
-
-
-
-
§¹t
Phenol 5 0/00
-
-
-
-
-
§¹t
Thiomersal 0.4 0/00
-
-
-
-
-
§¹t
(-): kh«ng cã vi khuÈn mäc (+): cã vi khuÈn mäc
B»ng kÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng chóng t«i nhËn thÊy c¶ 4 ph¬ng ph¸p v« ho¹t vµ gi¶i ®éc trªn ®Òu cã kh¶ n¨ng bÊt ho¹t E. coli.
TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra hiÖu qu¶ gi¶i ®éc cña c¸c ph¬ng ph¸p trªn b»ng c¸ch ly t©m dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t, lÊy níc trong läc qua mµng 0,2 mm thu ®îc dÞch läc gäi lµ “gi¶i ®éc tè”, sau ®ã tiªm gi¶i ®éc tè ®ã cho chuét b¹ch 18 - 20 gam víi liÒu tiªm 0,4 ml vµo tÜnh m¹ch vµ so s¸nh víi tiªu chuÈn ®éc tè ë trªn (tiªu chuÈn ®Ó ®¸nh gi¸ ®éc tè E. coli ®ã lµ cø 0,4ml ®éc tè khi tiªm tÜnh m¹ch cho chuét 18 – 20g, ph¶i g©y chÕt Ýt nhÊt lµ 40% tæng sè chuét ®îc tiªm). NÕu gi¶i ®éc tè g©y chÕt tíi 40% sè chuét thÝ nghiÖm th× ®éc tè ®ã cha ®îc gi¶i ®éc, tøc lµ ph¬ng ph¸p gi¶i ®éc ®ã kh«ng ®¹t vµ ngîc l¹i. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 17.
B¶ng 17: TÝnh an toµn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc
Ph¬ng ph¸p bÊt ho¹t
LiÒu tiªm (ml)
§êng tiªm
Tû lÖ chuét chÕt/chuét tiªm
% chuét chÕt
HiÖu qu¶ gi¶i ®éc
700C/30 phót
0,4
TM
2/10
20%
§¹t
Formol 3 0/00
0,4
TM
1/10
10%
§¹t
Phenol 5 0/00
0,4
TM
6/10
60%
Kh«ng ®¹t
Thiomersal 0,40/00
0,4
TM
10/10
100%
Kh«ng ®¹t
KÕt qu¶ trªn cho thÊy:
Ph¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng phenol vµ thiomersal kh«ng nh÷ng kh«ng mang l¹i hiÖu qu¶ gi¶i ®éc mµ cßn lµm t¨ng tÝnh ®éc cña ®éc tè, do ®ã kh«ng thÓ dïng hai hãa chÊt nµy ®Ó gi¶i ®éc ®îc.
Ph¬ng ph¸p gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 vµ 700C/30 phót cã hiÖu qu¶ gi¶i ®éc t¬ng ®èi tèt.
3.3.2. KiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i cÊy sau khi bÊt ho¹t
TiÕp theo chóng t«i kiÓm tra tÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 vµ 700C/30 phót. Chóng t«i dïng dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®ù¬c bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc ®Ó tiªm miÔn dÞch cho chuét b¹ch 18 - 20 gam liÒu 0,4 ml/con vµo díi da. Sau tiªm 21 ngµy lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh kiÓm tra hiÖu gi¸ ngng kÕt. KÕt qu¶ tr×nh bµy ë b¶ng 18.
B¶ng 18: TÝnh kh¸ng nguyªn cña dÞch nu«i cha ®éc tè sau khi ®· bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc
Ph¬ng ph¸p bÊt ho¹t
§êng tiªm
LiÒu tiªm (ml)
Sè lîng (con)
HiÖu gi¸ ngng kÕt
HGKT trung b×nh
Formol 30/00
DD
0.4
5
1/128 1/64 1/64 1/256 1/128
1/128
700C/30 phót
DD
0.4
5
1/128 1/32 1/64 1/64 1/32
1/64
* “DD”: díi da
Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy chuét tiªm dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®îc xö lý b»ng formol nång ®é 30/00 cho hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n (trung b×nh 1/128). Nh vËy ph¬ng ph¸p bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc b»ng formol 30/00 ë 37oC trong 24h cã hiÖu qu¶ tèt nhÊt. DÞch nu«i chøa ®éc tè sau khi bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc, ®éc lùc gi¶m ®i nhng vÉn cã tÝnh kh¸ng nguyªn.
3.3.3. X¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè
§éc tè cña E. coli lµ mét yÕu tè quan träng tham gia vµo qu¸ tr×nh g©y bÖnh tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu ë lîn. V× vËy, sau khi ®· chÕ t¹o ®îc dÞch nu«i chøa gi¶i ®éc tè nh trªn, cÇn x¸c ®Þnh tÝnh kh¸ng nguyªn cña gi¶i ®éc tè trong dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· gi¶i ®éc.
3.3.3.1. Nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè
Chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu ®¸p øng miÔn dÞch cña gi¶i ®éc tè trªn ®èi tîng lµ chuét b¹ch víi ph¬ng ph¸p nh sau:
ChÕ t¹o gi¶i ®éc tè E. coli (Kh¸ng nguyªn ®éc tè T2): dÞch nu«i cÊy chøa ®éc tè (hçn hîp 10 chñng E. coli) ®îc gäi lµ dÞch nu«i chøa ®éc tè E. coli ®a gi¸ ®îc gi¶i ®éc b»ng focmol 30/00 ë 37oC/24h, ly t©m víi tèc ®é 7000g/15phót, lÊy níc trong läc qua mµng läc cã kÝch thíc lç läc 0,2 μm, thu dÞch läc, dÞch läc ®ã gäi lµ gi¶i ®éc tè E. coli ®a gi¸ (hçn hîp gi¶i ®éc tè 10 chñng E. coli). NÕu chÕ t¹o víi mét chñng E. coli th× gäi lµ gi¶i ®éc tè T2 chñng E. coli ®ã.
ChÕ t¹o kh¸ng huyÕt thanh:
Chuét b¹ch ®îc tèi miÔn dÞch b»ng gi¶i ®éc tè ®a gi¸ theo quy tr×nh sau:
LÇn tiªm
1
2
3
4
5
6
§êng tiªm
DD
DD
FX
DD
FX
DD
LiÒu tiªm (ml)
0.5
0.8
0.4
1.0
0.8
1.2
Mçi mòi ®îc tiªm c¸ch nhau 1 tuÇn. 21 ngµy sau khi tiªm mòi cuèi cïng th× tiÕn hµnh lÊy m¸u, ch¾t huyÕt thanh.
KiÓm tra sù ®¸p øng miÔn dÞch b»ng ph¬ng ph¸p kiÓm tra kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh chuét miÔn dÞch b»ng c¸c ph¶n øng huyÕt thanh häc sau:
3.3.3.2. Ph¶n øng kÕt tña trong èng nghiÖm gi÷a gi¶i ®éc tè víi huyÕt thanh cña chuét miÔn dÞch gi¶i ®éc tè
HuyÕt thanh ®îc ly t©m (tèi thiÓu 4500g/phót) lo¹i hÕt cÆn (nÕu cã). HuyÕt thanh ®îc pha lo·ng theo cÊp sè 2 nh thêng quy, bæ sung kh¸ng nguyªn ®éc tè vµo huyÕt thanh ®· pha lo·ng theo tû lÖ thÓ tÝch 1:1. HiÖu gi¸ ®îc x¸c ®Þnh lµ ®é pha lo·ng huyÕt thanh cao nhÊt mµ vÉn thÊy kÕt tña. KÕt tña xuÊt hiÖn râ sau 36 – 48 giê vµ kÕt luËn ë 72 giê sau ph¶n øng. KÕt qu¶ cña ph¶n øng ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 18.
H×nh 3: Ph¶n øng kÕt tña trªn èng nghiÖm gi÷a ®éc tè T2 víi kh¸ng huyÕt thanh
B¶ng 18: Ph¶n øng kÕt tña trong èng nghiÖm gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸
vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét tiªm gi¶i ®éc tè E. coli ®a gi¸
(hiÖu gi¸ huyÕt thanh ®a gi¸ kh¸ng ®éc tè E. coli)
Kh¸ng nguyªn
§Þnh tÝnh
§Þnh lîng
§èi chøng 1
§èi chøng 2
T2Hanco 1
+
1/16
-
-
T2Hanco 2
+
1/8
-
-
T2Hanco 3
+
1/4
-
-
T2Hanco 4
+
1/4
-
-
T2Hanco 5
+
1/8
-
-
T2Hanco 6
+
1/2
-
-
T2Hanco 7
+
1/4
-
-
T2Hanco 8
+
1/8
-
-
T2Hanco 9
+
1/4
-
-
T2Hanco 10
+
1/16
-
-
T2 Poli
+
1/16
-
-
§èi chøng 1: HuyÕt thanh kh¸ng E. coli + M«i trêng
§èi chøng 2: HuyÕt thanh ©m tÝnh + §éc tè
Qua b¶ng 18 chóng t«i thÊy, ph¶n øng gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ E. coli víi huyÕt thanh chuét ®Òu cho kÕt qu¶ d¬ng tÝnh, ngoµi ra cßn x¸c ®Þnh ®îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè, tøc lµ ®· cã sù kÕt hîp gi÷a ®éc tè vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu t¬ng øng. §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®· g©y ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch.
3.3.3.3. Ph¶n øng kÕt tña khuÕch t¸n kÐp trong th¹ch (ADP) gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè víi huyÕt thanh chuét ®îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè.
§Ó ph©n tÝch thªm vÒ ®éc tè E. coli trong hçn hîp ®éc tè, chóng t«i tiÕn hµnh ph¶n øng ADP theo kü thuËt Owchterlony. Thµnh phÇn tham gia ph¶n øng gåm cã, kh¸ng nguyªn ®éc tè ®îc bè trÝ ë giÕng trung t©m, cßn c¸c giÕng xung quanh lµ huyÕt thanh chuét miÔn dÞch ®îc pha lo·ng theo cÊp sè 2. KÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 19.
B¶ng 19: Ph¶n øng ADP gi÷a kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli ®¬n gi¸ vµ ®a gi¸ víi huyÕt thanh chuét miÔn dÞch gi¶i ®éc tè E. coli (hiÖu gi¸ huyÕt thanh ®a gi¸ kh¸ng ®éc tè E. coli)
Kh¸ng nguyªn
§Þnh tÝnh
HiÖu gi¸ kÕt tña
§èi chøng 1
§èi chøng 2
T2Hanco 1
+
1/4
-
-
T2Hanco 2
+
1/8
-
-
T2Hanco 3
+
1/4
-
-
T2Hanco 4
+
1/8
-
-
T2Hanco 5
+
1/4
-
-
T2Hanco 6
+
1/8
-
-
T2Hanco 7
+
1/4
-
-
T2Hanco 8
+
1/8
-
-
T2Hanco 9
+
1/4
-
-
T2Hanco 10
+
1/8
-
-
T2 Poli
+
1/16
-
-
* §èi chøng 1: HuyÕt thanh kh¸ng E. coli + M«i trêng
§èi chøng 2: HuyÕt thanh ©m tÝnh + §éc tè
H×nh 4. Ph¶n øng ADP gi÷a ®éc tè T2 víi kh¸ng huyÕt thanh
Ph¶n øng ADP d¬ng tÝnh mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n vÒ tÝnh kh¸ng nguyªn cña ®éc tè, ngoµi ra ta cßn x¸c ®Þnh ®îc hiÖu gi¸ kÕt tña, nghÜa lµ kh¸ng nguyªn ®éc tè g©y miÔn dÞch m¹nh.
KÕt qu¶ cña c¸c ph¶n øng huyÕt thanh trªn cho thÊy:
Gi¶i ®éc tè E. coli cã tÝnh kh¸ng nguyªn tèt, ®· kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch trªn chuét b¹ch.
Kh¸ng ®éc tè trong huyÕt thanh chuét ®îc miÔn dÞch gi¶i ®éc tè cã thÓ ®îc ph¸t hiÖn qua ph¶n øng kÕt tña víi kh¸ng nguyªn ®éc tè E. coli trong èng nghiÖm, qua ph¶n øng ADP trong gel th¹ch. Qua hai ph¶n øng ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®îc hiÖu gi¸ cña kh¸ng ®éc tè.
Mçi chñng E. coli cã kh¶ n¨ng s¶n sinh ®éc tè víi hµm lîng kh¸c nhau. §éc tè ®a gi¸ m¹nh h¬n vµ g©y miÔn dÞch tèt h¬n ®éc tè ®¬n gi¸.
3.4. Nghiªn cøu c¸c chÊt bæ trî lµm t¨ng miÔn dÞch
Chóng t«i sö dông c¸c chÊt bæ trî: ISA vµ IMS cña h·ng Septic, Al(OH)3 vµ alum cña SPI Pharma. Mçi chÊt bæ trî ®îc bæ sung vµo dÞch nu«i chøa ®éc tè ®· ®îc bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc (gäi lµ t¾t lµ kh¸ng nguyªn) víi tû lÖ thÝch hîp. Tríc tiªn chóng t«i tiÕn hµnh thö an toµn trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch 18 – 20 gam. KÕt qu¶ thu ®îc tr×nh bµy ë b¶ng 20.
B¶ng 20: TÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn cã chøa c¸c chÊt bæ trî kh¸c nhau
Kh¸ng nguyªn cã chÊt bæ trî
Tû lÖ chuét chÕt/tiªm theo ®êng tiªm
KÕt luËn
Díi da (1 ml)
Phóc xoang (0,5)
Nhò hãa ISA
6/10
7/10
Kh«ng ®¹t
Nhò hãa IMS
4/10
4/10
Kh«ng ®¹t
AL(OH)3
0/10
0/10
§¹t
Alum
0/10
0/10
§¹t
Tõ kÕt qu¶ thö an toµn, chóng t«i nhËn thÊy 2 s¶n phÈm cã bæ trî Al(OH)3 vµ alum khi bæ sung vµo kh¸ng nguyªn E. coli an toµn h¬n so víi s¶n phÈm cã bæ trî dÇu kho¸ng ISA, IMS. Tõ ®©y chóng t«i sö dông 2 s¶n phÈm nµy ®Ó tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm lµ chuét b¹ch.
Chóng t«i tiÕp tôc nghiªn cøu hiÖu lùc cña hai s¶n phÈm trªn b»ng c¸ch miÔn dÞch liÒu 0,4ml/con theo ®êng tiªm díi da trªn chuét b¹ch vµ so s¸nh víi ®èi chøng (®èi chøng lµ chuét miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). Sau khi tiªm 21 ngµy, tiÕn hµnh lÊy m¸u chuét, ch¾t huyÕt thanh, kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ b»ng ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh. KÕt qu¶ cô thÓ nh sau:
B¶ng 21: KiÓm tra tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn cã bæ sung c¸c chÊt bæ trî
ChÊt bæ trî
Nång ®é
HiÖu gi¸ tõng con
HiÖu gi¸ trung b×nh
Al(OH)3
10/00
1/128 1/64 1/128 1/128 1/128
1/115,2
20/00
1/256 1/128 1/256 1/256 1/128
1/204,8
30/00
1/128 1/256 1/128 1/256 1/128
1/179,2
40/00
1/128 1/256 1/128 1/256 1/64
1/166,4
Alum
0.50/00
1/128 1/64 1/128 1/128 1/64
1/102,4
10/00
1/256 1/128 1/128 1/256 1/128
1/179,2
20/00
1/128 1/512 1/128 1/256 1/128
1/230,4
30/00
1/128 1/256 1/128 1/256 1/64
1/166,4
§èi chøng (kh«ng cã chÊt bæ trî)
1/128 1/64 1/64 1/128 1/128
1/102,4
Nh×n chung chuét ®îc miÔn dÞch b»ng kh¸ng nguyªn cã chÊt bæ trî cã hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cao h¬n so chuét ®èi chøng, cô thÓ:
§èi víi chÊt bæ trî lµ Al(OH)3 ë mçi nång ®é kh¸c nhau th× g©y ra ®¸p øng miÔn dÞch kh¸c nhau trªn ®éng vËt thÝ nghiÖm. Trong ®ã nång ®é 20/00 cho kÕt qu¶ tèt nhÊt thÓ hiÖn qua hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ cña huyÕt thanh chuét lµ cao nhÊt (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/204,8). Nång ®é tèi u cña chÊt bæ trî alum còng lµ 20/00 (hiÖu gi¸ trung b×nh ®¹t 1/230,4).
Tõ nh÷ng kÕt qu¶ trªn, chóng t«i quyÕt ®Þnh chän alum bæ sung víi nång ®é 2 0/00 lµm chÊt bæ trî cho kh¸ng nguyªn vµ sö dông cho nh÷ng nghiªn cøu tiÕp theo.
3.5. Nghiªn cøu tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn
Sau khi ®· chän ®îc chÊt bæ trî thÝch hîp lµ alum 20/00 chóng t«i s¶n xuÊt 3 l« liªn tôc ®Ó kh¶o s¸t tÝnh an toµn cña kh¸ng nguyªn nµy trªn nhiÒu lo¹i ®éng vËt kh¸c nhau: chuét lang 250 - 300 gam , thá 1800 - 2000 gam vµ b¶n ®éng vËt lµ gµ hËu bÞ. Mçi loµi ®éng vËt cã mét liÒu lîng kh¸ng nguyªn kh¸c nhau, ®êng ®a thuèc vµo lµ tiªm díi da, riªng ®èi víi gµ ®êng ®a thuèc vµo lµ tiªm b¾p. Sau khi tiªm, chóng t«i tiÕn hµnh theo dâi c¸c ph¶n øng cña ®éng vËt thÝ nghiÖm vµ sè lîng ®éng vËt bÞ chÕt trªn tæng sè ®éng vËt ®îc tiªm. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm ®îc thèng kª ë b¶ng 22.
Qua b¶ng kÕt qu¶, chóng t«i thÊy r»ng víi c«ng thøc chÕ t¹o lµ kh¸ng nguyªn + alum 2 0/00, khi tiÕn hµnh thö an toµn víi ba l« s¶n xuÊt kh¸c nhau, ®Òu cho kÕt qu¶ an toµn trªn c¸c ®éng vËt thÝ nghiÖm. Cô thÓ lµ kh«ng cã trêng hîp nµo ®éng vËt thÝ nghiÖm bÞ chÕt hoÆc hoÆc ph¶n øng víi chÕ phÈm.
B¶ng 22: KÕt qu¶ thö tÝnh an toµn cña c¸c l« kh¸ng nguyªn trªn ®éng vËt
L« thÝ nghiÖm
Sè chuét lang ph¶n øng /sè tiªm
Sè thá ph¶n øng/sè tiªm
Sè gµ ph¶n øng/sè tiªm
LiÒu dd (ml)
LiÒu dd (ml)
LiÒu dd (ml)
LiÒu tiªm b¾p (ml)
1,0
2,0
3,0
1,0
2,0
3,0
2,0
3,0
4,0
2,0
3,0
4,0
L« 1
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/7
0/8
0/8
0/8
0/8
0/7
§C l« 1
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/4
0/4
0/4
0/4
0/5
0/4
L« 2
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/6
0/6
0/7
0/7
0/7
0/7
§C l« 2
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/3
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
L« 3
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/10
0/8
0/8
0/8
0/8
0/8
0/9
§C l« 3
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
0/4
Tæng TN
0/30
0/30
0/30
0/30
0/30
0/30
0/21
0/22
0/23
0/23
0/23
0/23
Tæng §C
0/15
0/15
0/15
0/15
0/15
0/15
0/11
0/12
0/12
0/12
0/13
0/12
Ghi chó: §éng vËt kh«ng cã ph¶n øng khi ®îc tiªm chÕ phÈm.
§èi chøng:M«i trêng + formol 30/00 + alum 20/00
3.6. Nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch cña kh¸ng nguyªn vµ nghiªn cøu thêi gian s¶n sinh miÔn dÞch sau khi tiªm
§Ó nghiªn cøu tÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch, chóng t«i tiÕn hµnh thÝ nghiÖm trªn chuét b¹ch 18-20 gam, víi sè lîng lµ 40 con cho mét lÇn thÝ nghiÖm. Cø mét tuÇn sau khi miÔn dÞch, tiÕn hµnh lÊy m¸u 10 con ®Ó kiÓm tra hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong m¸u cña c¸c chuét thÝ nghiÖm. ThÝ nghiÖm ®îc lÆp l¹i 3 lÇn. KÕt qu¶ thÝ nghiÖm cô thÓ nh sau:
B¶ng 23: TÝnh miÔn dÞch vµ thêi gian t¹o miÔn dÞch
Tiªm díi da 0,4ml/con
HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh chuét sau tiªm
1 tuÇn
2 tuÇn
3 tuÇn
4 tuÇn
HGKT thÝ nghiÖm lÇn 1
-
1/32
1/218
1/230
HGKT thÝ nghiÖm lÇn 2
-
1/34
1/230
1/230
HGKT thÝ nghiÖm lÇn 3
-
1/28
1/205
1/218
HGKT chuét ®èi chøng (chuét tiªm kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî)
-
1/28
1/128
1/115
B¶ng 23 vµ h×nh 5 cho thÊy sau khi miÔn dÞch mét tuÇn c¸c chuét thÝ nghiÖm cha cã sù ®¸p øng miÔn dÞch, sang tuÇn thø hai trong huyÕt thanh chuét ®· b¾t ®Çu cã kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i kh¸ng nguyªn E. coli nhng hiÖu gi¸ vÉn cßn thÊp (kho¶ng 1/32). ë tuÇn thø ba thø t hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ lµ cao nhÊt (kho¶ng 1/128 – 1/256).
KÕt qu¶ trªn cho thÊy, kh¸ng huyÕt thanh cña nh÷ng ®éng vËt thÝ nghiÖm ®îc miÔn dÞch kh¸ng nguyªn cã thªm chÊt bæ trî alum 2 0/00 cã hiÖu gi¸ cao h¬n so víi huyÕt thanh cña nh÷ng con ®èi chøng (®îc miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh«ng cã chÊt bæ trî). §iÒu nµy chøng tá kh¸ng nguyªn cã bæ sung thªm chÊt bæ trî alum 2 0/00 cã kh¶ n¨ng kÝch thÝch ®¸p øng miÔn dÞch tèt.
3.7. chÕ t¹o kh¸ng nguyªn thÝch hîp g©y miÔn dÞch cho gµ
Víi bé gièng chuÈn ®· ®îc chän läc vµ æn ®Þnh, chóng t«i tiÕn hµnh chÕ t¹o kh¸ng nguyªn ®Ó miÔn dÞch cho gµ. Chóng t«i tiÕn hµnh nu«i cÊy E. coli theo c«ng thøc m«i trêng vµ c«ng thøc nu«i cÊy ®· ®îc nghiªn cøu ë trªn, ®Ó chÕ t¹o kh¸ng nguyªn, phôc vô cho qu¸ tr×nh miÔn dÞch gµ. Cã 15 l« kh¸ng nguyªn ®· ®îc chÕ t¹o vµ ®îc kiÓm tra c¸c tÝnh chÊt vÒ: ®Ëm ®é vi khuÈn, ®é thuÇn khiÕt, v« trïng vµ an toµn. KÕt qu¶ ë b¶ng 24.
B¶ng 24: KiÓm tra chÊt lîng c¸c l« kh¸ng nguyªn thö nghiÖm
L« kh¸ng nguyªn
§Ëm ®é vi khuÈn
(CFU/ml)
KiÓm tra thuÇn khiÕt
KiÓm tra v« trïng
§é an toµn
§¸nh gi¸ chung
L« 1
8 x108
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 2
8.5 x108
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 3
1.5 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 4
2 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 5
1x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 6
3 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 7
1.5 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 8
2,5 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 9
1.5 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 10
2 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 11
3,5 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 12
1 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 13
8,5 x108
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 14
3 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
L« 15
2 x109
§¹t
§¹t
§¹t
§¹t
Theo kÕt qu¶ b¶ng 24: 15 l« kh¸ng nguyªn ®· s¶n xuÊt ®Òu ®¹t tiªu chuÈn vµ ®îc ®a vµo sö dông, g©y miÔn dÞch cho gµ.
3.8. nghiªn cøu quy tr×nh miÔn dÞch cho gµ
Chóng t«i chän ra 3 l« kh¸ng nguyªn ®· chÕ t¹o lµ: l« 6, l« 11 vµ l« 14 ®Ó tiÕn hµnh thö nghiÖm víi 3 qui tr×nh miÔn dÞch trªn 3 ®µn gµ m¸i ®Î, mçi ®µn 10 con. LÊy m¸u gµ kiÓm tra HGKT trong huyÕt thanh gµ theo ®Þnh kú. KÕt qu¶ thö nghiÖm miÔn dÞch ®îc tr×nh bµy trong b¶ng 25.
B¶ng 25: KÕt qu¶ thö nghiÖm c¸c qui tr×nh miÔn dÞch trªn gµ
Qui tr×nh miÔn dÞch
Qui tr×nh 1
Qui tr×nh 2
Qui tr×nh 3
HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh gµ (sau khi miÔn dÞch)
TuÇn 1
1/3,2
1/4,3
1/2
TuÇn 2
1/21,6
1/28,8
1/26,4
TuÇn 3
1/32
1/67,2
1/58,6
TuÇn 4
1/57,6
1/208
1/121,2
TuÇn 5
1/121,6
1/236,8
1/224
TuÇn 10
1/120,4
1/244,2
1/211,2
TuÇn 12
1/116,2
1/251,4
1/121
TuÇn 15
1/56,8
1/121
1/62,4
Sau tiªm nh¾c l¹i
1/57,2
1/265,6
1/112,2
Møc ®é ph¶n øng ®èi víi gµ
4-5 giê sau mçi lÇn tiªm miÔn dÞch c¬ së
Gµ b¾t ®Çu mÖt, gi¶m ¨n trong vßng 05 ngµy
Gµ b¾t ®Çu mÖt, gi¶m ¨n trong vßng 02 ngµy
Gµ b¾t ®Çu mÖt, gi¶m ¨n trong vßng 04 ngµy
Sau khi tiªm miÔn dÞch cao ®é
3% gµ bÞ chÕt, c¶ ®µn mÖt mái, gi¶m ¨n
Gµ mÖt mái, gi¶m ¨n, sau 3 ngµy khoÎ l¹i b×nh thêng
Gµ mÖt mái, gi¶m ¨n, sau 3 ngµy khoÎ l¹i b×nh thêng
Sau tiªm nh¾c l¹i
Gµ mÖt mái, gi¶m ®Î ®Õn 90% trong 02 ngµy, gi¶m ¨n
Gµ mÖt mái, gi¶m ®Î ®Õn 30% trong 01 ngµy.
Gµ mÖt mái, gi¶m ®Î ®Õn 50% trong 02 ngµy.
Qua kÕt qu¶ thö 3 qui tr×nh ë trªn chóng t«i thÊy qui tr×nh 2 cho kÕt qu¶ miÔn dÞch cao nhÊt vµ æn ®Þnh nhÊt nªn qui tr×nh nµy ®îc chän lµm qui tr×nh miÔn dÞch chÝnh thøc.
Qui tr×nh miÔn dÞch kÌm theo phô lôc (phô lôc 01)
3.9. x¸c ®Þnh hµm lîng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ
Sau khi chän ®îc qui tr×nh miÔn dÞch thÝch hîp, tiÕn hµnh tiªm miÔn dÞch cho ®µn gµ ®Î trøng dïng lµm nguyªn liÖu s¶n xuÊt chÕ phÈm kh¸ng thÓ lßng ®á trøng. Chóng t«i chän ra 5 l« kh¸ng nguyªn ®· chÕ t¹o lµ: l« 4, l« 6, l« 8, l« 11 vµ l« 14 ®Ó miÔn dÞch cho 5 ®µn gµ m¸i ®Î. Theo dâi hµm lîng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ. Sö dông hai ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh vµ ADP ®Ó x¸c ®Þnh hµm lîng kh¸ng thÓ (ph¶n øng ngng kÕt nhanh x¸c ®Þnh hµm lîng kh¸ng thÓ kh¸ng víi kh¸ng nguyªn th©n E. coli, ph¶n øng ADP x¸c ®Þnh hµm lîng kh¸ng thÓ kh¸ng ®éc tè E. coli). KÕt qu¶ ®Þnh lîng hµm lîng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ trong lßng ®á trøng gµ t¬ng øng víi c¸c l« kh¸ng nguyªn miÔn dÞch ®îc tr×nh bµy trong b¶ng 26.
Nh vËy, víi c¸c l« kh¸ng nguyªn kh¸c nhau, sau khi miÔn dÞch cho gµ trong giai ®o¹n thu ho¹ch trøng lµm nguyªn liÖu, hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ngng kÕt trong huyÕt thanh gµ cã hµm lîng lu«n æn ®Þnh ë 1/128 ®Õn 1/281,6; hiÖu gi¸ ADP dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16. Hµm lîng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ kh«ng chªnh lÖch nhiÒu (hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ngng kÕt trung b×nh trong lßng ®á trøng dao ®éng tõ 1/118,2 ®Õn 1/243,2; hiÖu gi¸ ADP dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16 ).. §iÒu ®ã chøng tá kh¸ng thÓ cña gµ sau khi ®¸p øng miÔn dÞch ®îc truyÒn nhiÒu vµo trong lßng ®á trøng. §ã chÝnh lµ ®iÒu kú diÖu vµ u viÖt cña lßng ®á trøng gµ.
B¶ng 26: Hµm lîng kh¸ng thÓ trong huyÕt thanh vµ lßng ®á trøng gµ
L« kh¸ng nguyªn
HGKT trung b×nh trong huyÕt thanh
HGKT trung b×nh trong lßng ®á trøng
Ngng kÕt nhanh
ADP
Ngng kÕt nhanh
ADP
L« 4
1/ 281,6
1/16
1/243,2
1/8
L« 6
1/128
1/8
1/118,4
1/8
L« 8
1/230,4
1/16
1/192
1/16
L« 11
1/256
1/8
1/217,6
1/16
L« 14
1/268,8
1/8
1/243,2
1/8
3.10. nghiªn cøu qui tr×nh s¶n xuÊt
Trøng thu ho¹ch tõ gµ miÔn dÞch ®îc chóng t«i chÕ thö s¶n phÈm theo 5 quy tr×nh s¶n xuÊt kh¸c nhau, chän ®îc QTSX4 lµ tèi u, ®¹t yªu cÇu vÒ c¸c tiªu chuÈn: vËt lý, v« trïng, HGKT x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ngng kÕt ®¹t tõ 1/80-1/100, HGKT x¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ADP ®¹t tõ 1/8 - 1/16.
Quy tr×nh s¶n xuÊt kÌm theo phô lôc (phô lôc 02)
3.11. Nghiªn cøu qui tr×nh kiÓm nghiÖm vµ b¶o qu¶n chÕ phÈm
3.11.1. Kh¶o s¸t chØ tiªu c¶m quan cña s¶n phÈm
Theo dâi c¸c chØ tiªu c¶m quan 03 l« s¶n phÈm; mçi l« 20 mÉu trong vßng 06 th¸ng, chóng t«i thÊy cã sù kh¸c biÖt râ rÖt gi÷a c¸c mÉu s¶n phÈm ë ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n kh¸c nhau. ë ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é phßng kho¶ng 25oC, tÊt c¶ c¸c mÉu s¶n phÈm sau 01th¸ng ®· chuyÓn mµu tõ vµng sang tr¾ng ngµ, cã hiÖn tîng ph©n líp, sau 02 th¸ng cã l¾ng cÆn. ë nhiÖt ®é b¶o qu¶n 2-8oC trong 06 th¸ng tÊt c¶ c¸c mÉu s¶n phÈm ®Òu ®¹t yªu cÇu c¶m quan, kh«ng thay ®æi vÒ mµu s¾c s¶n phÈm, ®é ®ång nhÊt, kh«ng v¸ng, kh«ng cÆn. VËy, s¶n phÈm b¶o qu¶n ë 2-8oC lµ ®¹t yªu cÇu.
3.11.2. Kh¶o s¸t ®é v« trïng cña s¶n phÈm
Dïng 3 l« s¶n phÈm, mçi l« 20 mÉu ®Ó kiÓm tra v« trïng theo tiªu chuÈn ViÖt Nam (TCN) (Dîc ®iÓn ViÖt Nam II, TËp 3, NXB Y häc, trang 498)
S¶n phÈm ®îc kiÓm tra trªn c¸c m«i trêng sau: NA (nutrient agar), NB (nutrient broth), BA (blood agar), SA (sabouraud agar), Thioglycolat
C¸c m«i trêng kiÓm tra s¶n phÈm ®îc ®Ó trong tñ Êm 370C, theo dâi Ýt nhÊt 4 ngµy, riªng th¹ch nÊm SA ®Ó ë nhiÖt ®é phßng víi thêi gian theo dâi Ýt nhÊt 7 ngµy.
S¶n phÈm ®îc b¶o qu¶n ë 2-80C vµ cø sau 1 th¸ng th× kiÓm tra v« trïng 01 lÇn, kh¶o s¸t trong 06 th¸ng. KÕt qu¶ tr×nh bµy trong b¶ng 27.
3.11.3. Kh¶o s¸t hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm
X¸c ®Þnh b»ng ph¶n øng ngng kÕt nhanh trªn phiÕn kÝnh vµ ph¶n øng ADP gi÷a s¶n phÈm ®îc b¶o qu¶n ë 2-80C víi kh¸ng nguyªn vµ ®éc tè E. coli t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau, kh¶o s¸t trong 6 th¸ng. KÕt qu¶ kh¶o s¸t ®é v« trïng vµ hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trªn b¶ng 27.
Tõ b¶ng 27 ta thÊy trong ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n 2-80C, ®é v« trïng cña s¶n phÈm ®îc b¶o ®¶m trong 05 th¸ng. Sau 05 th¸ng cã 04 mÉu trong tæng sè 60 mÉu cña c¶ hai l« cã t¹p trïng nhng kh«ng ph¸t hiÖn cã nÊm trong s¶n phÈm. HiÖu gi¸ kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm kh«ng thay ®æi trong suèt thêi gian b¶o qu¶n.
B¶ng 27: KÕt qu¶ kh¶o s¸t chØ tiªu v« trïng vµ hgkt trong thêi gian b¶o qu¶n
L« SX
Thêi gian theo dâi
HGKT
KÕt qu¶ kiÓm tra v« trïng
Ngng kÕt
ADP
NA
NB
BA
SA
Thio
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
L«
02/09/08
(n = 20)
T0
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T1
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T2
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T3
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T4
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T5
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T6
1/100
1/16
20
0
18
2
20
0
20
0
20
0
L«
15/11/08 (n = 20)
T0
1/80
1/8
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T1
1/80
1/8
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T2
1/80
1/8
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T3
1/80
1/8
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T4
1/80
1/8
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T5
1/80
1/8
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T6
1/80
1/8
20
0
19
1
20
0
20
0
20
0
L«
28/01/09 (n = 20)
T0
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T1
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T2
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T3
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T4
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T5
1/100
1/16
20
0
20
0
20
0
20
0
20
0
T6
1/100
1/16
20
0
19
1
20
0
20
0
20
0
3.11.4. Kh¶o s¸t ®é an toµn cña s¶n phÈm
B¶ng 28: §é an toµn cña s¶n phÈm trªn chuét b¹ch vµ thá
§éng vËt thÝ nghiÖm
§êng tiªm
Ngµy 1
Ngµy 2
Ngµy 3
Ngµy 4
Ngµy 5
Ngµy 6
Ngµy 7
KÕt qu¶
Chuét b¹ch
5 con
Tiªm díi da
LiÒu 0,4 ml/con
LiÒu 0,4 ml/con
LiÒu 0,4 ml/con
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% chuét sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
5 con
Tiªm phóc xoang
LiÒu 0,4 ml/con
LiÒu0,4 ml/con
LiÒu 0,4 ml/con
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% chuét sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
Thá
3 con
Tiªm díi da
LiÒu
3 ml/con
LiÒu
3 ml/con
LiÒu3 ml/con
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% thá sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
3 con
Tiªm phóc xoang
LiÒu
5 ml/con
LiÒu
5 ml/con
LiÒu
5 ml/con
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% thá sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
B¶ng 29: §é an toµn cña s¶n phÈm trªn lîn
§éng vËt thÝ nghiÖm
§êng tiªm
Ngµy 1
Ngµy 2
Ngµy 3
Ngµy 4
Ngµy 5
Ngµy 6
Ngµy 7
KÕt qu¶
Lîn <5 kg
( 20- 30 ngµy tuæi)
10con
Tiªm b¾p thÞt
LiÒu 2 ml/kgTT
LiÒu2 ml/kgTT
LiÒu2 ml/kgTT
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
10 con
Tiªm phóc xoang
LiÒu 4 ml/kgTT
LiÒu 4 ml/kgTT
LiÒu4 ml/kgTT
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
Lîn
>5 kg
(>30 ngµy tuæi)
10 con
Tiªm b¾p thÞt
LiÒu 1,5ml/kgTT
LiÒu 1,5ml/kgTT
LiÒu 1,5ml/kgTT
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
10 con
Tiªm phóc xoang
LiÒu 3 ml/kgTT
LiÒu 3 ml/kgTT
LiÒu 3 ml/kgTT
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
B×nh thêng
100% lîn sèng khoÎ m¹nh b×nh thêng
KÕt qu¶ kiÓm tra chØ tiªu hiÖu lùc cña s¶n phÈm
+ Ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ b»ng ph¶n øng ngng kÕt trùc tiÕp gi÷a s¶n phÈm víi kh¸ng nguyªn E. coli vµ b»ng ph¶n øng ADP gi÷a s¶n phÈm vµ ®éc tè E. coli.
Pha lo·ng kh¸ng thÓ trong s¶n phÈm b»ng níc muèi sinh lý theo ®é pha lo·ng kh¸c nhau.
Víi ph¶n øng ngng kÕt nhanh, lÊy mét lîng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét lîng kh¸ng nguyªn E. coli b»ng nhau, trén ®Òu, ®Ó ë nhiÖt ®é kho¶ng 250C. §äc kÕt qu¶ sau 3 - 5 phót b»ng m¾t thêng.
Víi ph¶n øng ADP còng lÊy mét lîng kh¸ng thÓ ®· pha ë mçi hiÖu gi¸ vµ mét lîng ®éc tè E. coli nhá vµo c¸c giÕng, trong ®ã ®éc tè E. coli nhá vµo giÕng trung t©m, kh¸ng thÓ nhá vµo c¸c giÕng xung quanh. KÕt qu¶ ®äc sau 72 giê.
§èi chøng ©m lµm t¬ng tù bíc trªn nhng thay thÕ kh¸ng thÓ cña s¶n phÈm b»ng níc sinh lý.
§èi chøng d¬ng lµm t¬ng tù bíc trªn nhng thay thÕ kh¸ng thÓ cña s¶n phÈm b»ng kh¸ng thÓ E. coli ®· biÕt.
KÕt qu¶: chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®¹t hiÖu gi¸ ngng kÕt ë ®é pha lo·ng ≥1/50, hiÖu gi¸ ADP ë ®é pha lo·ng ³ 1/4.
+ KÕt qu¶ kiÓm tra chØ tiªu hiÖu lùc cña s¶n phÈm trªn chuét:
Dïng 20 con chuét b¹ch träng lîng trung b×nh mçi con 18 - 20g, khoÎ m¹nh, chia lµm 2 nhãm:
Nhãm 1: 10 con, mçi con tiªm 0,4 ml kh¸ng thÓ vµo phóc xoang. Sau 24 giê tiªm lÇn hai cïng liÒu.
Nhãm 2: 10 con kh«ng tiªm lµm ®èi chøng.
Sau 48 giê kÓ tõ khi tiªm kh¸ng thÓ lÇn hai, c«ng cêng ®éc cho c¶ hai nhãm chuét víi liÒu tiªm díi da mçi chuét 0,2 ml dÞch nu«i cÊy E. coli ®a gi¸ nu«i cÊy 24 giê (10 chñng E. coli gièng sau khi nu«i cÊy 24h, ®em trén ®Òu víi tû lÖ b»ng nhau). Theo dâi chuét trong 7 ngµy, ®¸nh gi¸ kÕt qu¶. TÝnh hiÖu sè cña sè lîng chuét sèng sãt cña nhãm 1 (nhãm ®îc tiªm miÔn dÞch b»ng kh¸ng thÓ lßng ®á trøng) vµ sè lîng chuét sèng sãt cña nhãm 2 (nhãm ®èi chøng). KÕt qu¶ ë b¶ng 30.
B¶ng 30: HiÖu lùc cña s¶n phÈm trªn chuét
Nhãm thÝ nghiÖm
Sè lîng chuét chÕt/sè chuét tiªm
Kh¶ n¨ng b¶o hé
(% sè chuét sèng)
Nhãm 1
0/10
100%
Nhãm 2
8/10
20%
Qua kÕt qu¶ trªn ta thÊy, s¶n phÈm cã kh¶ n¨ng b¶o hé tèt ®èi víi chuét thÝ nghiÖm (100%), trong khi nhãm ®èi chøng tû lÖ chuét sèng sãt sau khi c«ng cêng ®éc chØ ®¹t 20%.
KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ
KÕt luËn
§· thu thËp ®îc 340 mÉu bÖnh phÈm lîn èm do tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu ë 5 tØnh ®¹i diÖn cho 3 miÒn B¾c - Trung - Nam. Tõ 340 mÉu bÖnh phÈm nµy ®· sµng läc vµ tuyÓn chän ®îc 10 chñng E. coli ®iÓn h×nh cã ®éc lùc m¹nh, tÝnh kh¸ng nguyªn tèt ®Ó lµm gièng.
§· x¸c ®Þnh ®îc ®éng th¸i sinh trëng cña 10 chñng E. coli ph©n lËp ®îc. C¸c chñng E. coli nµy t¨ng trëng cùc ®¹i sau 24 giê nu«i cÊy sau ®ã gi¶m dÇn, trong khi pH cña m«i trêng nu«i cÊy gi¶m cùc tiÓu sau 24 giê nu«i cÊy sau ®ã t¨ng dÇn.
ViÖc lµm bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc kh¸ng nguyªn b»ng formol 30/00 ë 37oC trong 24h cho hiÖu qu¶ tèt. Sau khi bÞ bÊt ho¹t vµ gi¶i ®éc, ®éc lùc bÞgi¶m ®i nhng vÉn gi÷ ®îc tÝnh kh¸ng nguyªn.
Alum 20/00 lµ chÊt bæ trî kh¸ng nguyªn an toµn vµ lµm t¨ng miÔn dÞch.
§· nghiªn cøu ®îc qui tr×nh miÔn dÞch tèi u cho gµ ®Ó thu ®îc hµm lîng kh¸ng thÓ cao nhÊt trong lßng ®á trøng. Hµm lîng kh¸ng thÓ trong lßng ®á trøng kh¸ng víi kh¸ng nguyªn th©n E. coli lu«n æn ®Þnh ë 1/118,2 ®Õn 1/243,2 vµ hµm lîng kh¸ng thÓ kh¸ng víi ®éc tè E. coli dao ®éng tõ 1/8 ®Õn 1/16.
§· nghiªn cøu ®îc qui tr×nh s¶n xuÊt kh¸ng thÓ, qui tr×nh kiÓm nghiÖm vµ b¶o qu¶n chÕ phÈm. ChÕ phÈm kh¸ng thÓ s¶n xuÊt ra cã hiÖu gi¸ kh¸ng thÓ ngng kÕt ®¹t tõ 1/80 ®Õn 1/100, hiÖu gi¸ ADP ®¹t ³ 1/4. S¶n phÈm ®¹t c¸c tiªu chuÈn vÒ vËt lý, v« trïng, an toµn vµ hiÖu lùc. NhiÖt ®é b¶o qu¶n chÕ phÈm tèt nhÊt lµ tõ 20C - 80C, thêi gian b¶o qu¶n lµ 5 th¸ng.
KiÕn nghÞ
TiÕp tôc kh¶o s¸t chÕ phÈm kh¸ng thÓ ®îc t¹o ra trªn lîn ®Ó x¸c ®Þnh kh¶ n¨ng b¶o vÖ cña chÕ phÈm ®èi víi lîn m¾c bÖnh vµ ®a ra liÒu phßng vµ ®iÒu trÞ bÖnh.
CÇn s¶n xuÊt thö nghiÖm mét sè l« chÕ phÈm ®Ó ®a ra kh¶o nghiÖm trªn thùc ®Þa tríc khi s¶n xuÊt ®¹i trµ vµ ®a chÕ phÈm kh¸ng thÓ nµy vµo phßng vµ trÞ bÖnh bÖnh tiªu ch¶y vµ sng phï ®Çu do E. coli g©y ra.
Tµi liªu tham kh¶o
TiÕng viÖt
§Æng Xu©n B×nh, TrÇn ThÞ H¹nh (2003), "Kh¶o s¸t sù biÕn ®éng hµm lîng Globulin miÔn dÞch trong s÷a ®Çu cña lîn n¸i khi sö dông chÕ phÈm sinh häc phßng bÖnh tiªu ch¶y lîn con", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp X, (1), tr.42-49.
§Æng Xu©n B×nh (2004), Vai trß cña vi khuÈn Escherichia coli vµ Clostridium Perfringens trong bÖnh tiªu ch¶y ë lîn con theo mÑ, c¸c biÖn ph¸p phßng trÞ, LuËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp, ViÖn Khoa häc Kü thuËt N«ng nghiÖp ViÖt Nam, Hµ Néi.
T« Minh Ch©u, NguyÔn Ngäc H¶i (1999), "Bíc ®Çu ph©n lËp vµ ®Þnh danh E.coli g©y bÖnh phï ®Çu ë lîn con sau cai s÷a", Khoa häc kü thuËt n«ng l©m nghiÖp, (3), tr.60-63.
§ç Trung Cø, TrÇn ThÞ H¹nh, NguyÔn Quang Tuyªn (2000), "Sö dông chÕ phÈm sinh häc Biosubtyl ®Ó phßng trÞ bÖnh tiªu ch¶y ë lîn con tríc vµ sau cai s÷a", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp VII, (2), tr.58-62.
§oµn ThÞ Kim Dung (2003), Sù biÕn ®æi mét sè vi khuÈn hiÕu khÝ ®êng ruét, vai trß cña E.coli trong héi chøng tiªu ch¶y cña lîn con theo mÑ, c¸c ph¸c ®å ®iÒu trÞ, LuËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp, ViÖn Thó y, Hµ Néi.
§µo Träng §¹t, Phan Thanh Phîng, Lª Ngäc Mü (1995), BÖnh ®êng tiªu hãa ë lîn, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.43-86.
NguyÔn Ngäc H¶i, T« Minh Ch©u, M.Carles, A.Tripodi vµ G.Bodin (2000), "T×m hiÓu nguyªn nh©n cña héi chøng thÇn kinh - phï m¾t ë heo cai s÷a", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp VII, (2), tr.27-35.
Ph¹m Kh¾c HiÕu, Bïi ThÞ Tho (1996), "KÕt qu¶ kiÓm tra tÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cña E.coli ph©n lËp tõ lîn con bÞ bÖnh ph©n tr¾ng t¹i c¸c tØnh phÝa B¾c trong 20 n¨m qua (1975 - 1995)", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp III, (4), tr.63-66.
Lý Liªn Khai (2001), "Ph©n lËp x¸c ®Þnh ®éc tè ruét cña c¸c chñng E.coli g©y bÖnh tiªu ch¶y cho heo con", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp VIII, (2), tr.13-18.
NguyÔn ThÞ Néi, Vò Ngäc L©m, Ph¹m Kh¾c Vîng (1978), "Nghiªn cøu Escherichia coli trong phßng thÝ nghiÖm. Vi trïng Escherichia coli ®éc trong bÖnh lîn con Øa ph©n tr¾ng vµ ®é nhiÔm khuÈn cña bÖnh. HiÖu lùc cña vacxin E.coli ®èi víi lîn con Øa ph©n tr¾ng trong s¶n xuÊt", KÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc kü thuËt Thó y 1968-1978, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.207-225.
Sö An Ninh (1995), C¸c chØ tiªu sinh lý, sinh hãa m¸u, níc tiÓu vµ h×nh th¸i ®¹i thÓ mét sè tuyÕn néi tiÕt ë lîn con m¾c bÖnh ph©n tr¾ng, LuËn ¸n tiÕn sÜ n«ng nghiÖp, Trêng §¹i häc N«ng nghiÖp I Hµ Néi.
NguyÔn Kh¶ Ngù, Lª V¨n T¹o, §ç Ngäc Thóy, NguyÔn Ngäc Nhiªn (1999), "X¸c ®Þnh ®éc lùc vµ chän chñng vi khuÈn E.coli ph©n lËp tõ lîn con m¾c bÖnh phï ®Çu, chÕ t¹o thö nghiÖm vacxin phßng bÖnh", B¸o c¸o khoa häc Ch¨n nu«i Thó y 1998 - 1999, HuÕ, tr.440-453.
Cï H÷u Phó, NguyÔn Ngäc Nhiªn, Vò B×nh Minh, §ç Ngäc Thóy (1999), KÕt qu¶ ph©n lËp vi khuÈn E.coli vµ Salmonella spp ë lîn m¾c tiªu ch¶y, x¸c ®Þnh mét sè ®Æc tÝnh sinh vËt hãa häc cña chñng vi khuÈn ph©n lËp ®îc vµ biÖn ph¸p phßng trÞ, B¸o c¸o khoa häc ch¨n nu«i thó y 1998-1999, tr.189-196.
NguyÔn Ngäc Phôc (2005), C«ng t¸c thó y trong ch¨n nu«i lîn, Nxb Lao ®éng - x· héi, tr.60-67.
Lª V¨n T¹o vµ cs (1995), "HiÖu qu¶ sö dông vacxin E.coli cho uèng phßng bÖnh ph©n tr¾ng lîn con", N«ng nghiÖp C«ng nghiÖp Thùc phÈm, (11), tr.432-433.
Lª V¨n T¹o, NguyÔn Kh¶ Ngù (1996a), "X¸c ®Þnh kh¶ n¨ng dung huyÕt vµ kh¸ng kh¸ng sinh cña vi khuÈn E.coli ph©n lËp tõ lîn con tríc vµ sau cai s÷a bÞ bÖnh Colibacillosis ë ®ång b»ng s«ng Cöu Long", N«ng nghiÖp, C«ng nghiÖp, Thùc phÈm, (2), tr.493-494.
Lª V¨n T¹o (1996b), "CÊu tróc Fimbriae, serotype b¸m dÝnh K88 cña vi khuÈn E.coli vµ vai trß cña nã trong qu¸ tr×nh g©y bÖnh ph©n tr¾ng lîn con", N«ng nghiÖp, C«ng nghiÖp, Thùc phÈm, (2), tr.62-63.
NguyÔn Nh Thanh, NguyÔn B¸ Hiªn, TrÇn ThÞ Lan H¬ng (2001), Vi sinh vËt thó y, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.72-101.
§ç Ngäc Thóy, Darren Trott, Alan Frost, Kirsty Town Send, Cï H÷u Phó, NguyÔn Ngäc Nhiªn, ¢u Xu©n TuÊn, NguyÔn Xu©n Huyªn, V¨n ThÞ Hêng, Vò Ngäc Quý (2002), "TÝnh kh¸ng kh¸ng sinh cña c¸c chñng Escherichia coli ph©n lËp tõ lîn con tiªu ch¶y ë mét sè tØnh miÒn B¾c ViÖt Nam", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp IX, (2), tr.21-31.
Tæng côc Thèng kª (2008), Niªn gi¸m thèng kª n¨m 2008, Nxb Thèng kª, Hµ Néi, tr.107-110.
§oµn Xu©n Tróc (2003), Sæ tay kü thuËt ch¨n nu«i lîn trang tr¹i, Nxb N«ng nghiÖp, Hµ Néi, tr.3-4.
T¹ ThÞ VÞnh, §Æng ThÞ Hße (2002), "Mét sè kÕt qu¶ sö dông c¸c chÕ phÈm sinh häc ®Ó phßng trÞ bÖnh tiªu ch¶y ë lîn con", Khoa häc kü thuËt Thó y, tËp IX, (4), tr.54-56.
TiÕng anh
Aarestrup, M.F., Jorsal, S.E., Ahrens, P., Jensen, N.E., and Meyling, A. (1997), "Molecular characterization of Escherichia coli strains isolated from pigs with edema diseas", J. Clin. Microbiol., (35), pp.20-24.
Akita, E.M., and S.Nakai, S. (1993), "Comparison of four purification methols for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain", Journal of Immunological methols, (160), pp.207-214.
Bakker, D., Willemsen, P.T.J., Simons, L.H., van Zijderveld, F.G., de Graaf, F.K. (1992), "Characterization of the antigenic and adhesive properties of FaeG, the major subunit of K88 fimbriae", Mol. Microbiol, (6), pp.247-255.
Bertschinger, H.U., and Pohlenz, J., (1983), "Bacterial colonization and morphology of the intestine in porcine Escherichia coli enterotoxemia (edema disease)", Vet. Pathol., ( 20), pp.99-110.
Biehl, L.G., and Hoefling, D.C. (1986), "Diagnosis and treatment of diarrhea in 7-to 14 day old pigs", J. Am. Vet. Assoc., (188), pp.1144-1146.
Blanco, J., Gonzalez, E.A., Bernardez, I., Rigueiro, B. (1983), "Differential biological activity of Vero cytotoxins (VT) released by human and porcine Escherichia coli strains". FEMS. Microbiol. Lett., ( 20), pp.167-170.
Bosworth, B.T., Samuel, J.E., Moon, H.W., O’ Brien, V.M., and Whipp, S.C. (1996), "Vaccination with Genetically Modified Shiga - Like toxin IIe prevents Edema Disease in Swine", Infection and Immunity, pp.55-60.
Butler, J.E. (1973), "Synthesis and distribution of immunoglobulins", J.Am.Vet. Med. Assoc., (163), pp.795-800.
Cavalieri, S.J, Snynder, I.S. (1982), "Cytotoxin activity of a partially purifield Escherichia coli alpha - haemolysin", J. Med. Microbiology, (15), pp.11-21.
Choi, B.K., and Schifferli, D.M. (2001), "Characterization of FasG segments required for 987P fimbria-mediated binding to piglets glycoprotein receptors", Infect. Immun., (69), pp. 6625-6632.
Cox, E., Houvenagel, A. (1993), "Comparison of the invitro adhesion of K88, K99, F41 and 987P positive Escherichia coli to intestinal villi of 4 to 5 week old pigs", Vet. Microbiol., (34), pp.7-18.
Dean, E.A. (1990), "Comparison of receptors for 987P pili of enterotoxigenic Escherichia coli in the small intestines of neonatal and older pigs", Infect. Immun., (58), pp.4030-4035.
Dean, E.A., Samuel, J.E. (1994), "Age-related resistance to 987P fimbria-mediated colonization correlates with specific glucolipid receptors in intestinal mucus in swine" Infect. Immun., (62), pp.4789-4794.
Deprez, P., De Cupere, F., Muylle, E., and Zobisch, H. (1992), "The use of egg powder antibodies in the prevention of post weaning colibacillosis", Proc. Int. Congr. Pig. Vet.Soc., (12), pp.251.
Fairbrother, J.M., Bestchinger, H.U., Nielsen, O.N., Pohlenz, J.F. (1992), Escherichia coli infections, diseases of swine. Seventh Edition. Wolfe publishing Ltd - Australian 1992, pp.489-497.
Fekete, P.Z., Gerardin, J., Jaccquemin, E., Mainil, J.G., Nagy, B. (2002), "Replicon typing of F18 fimbriae encoding plasmids of enterotoxigenic and verotoxigenic Escherichia coli strains from porcine post-weaning diarrhoea and oedema disease", Vet. Microbiol., (85), pp.275-284.
Francke, S., Harmsen, D., Caprioli, A., Pierrard, D., L.H., Karch, H. (1995), "Clonal relatedness off Shiga-like toxin producing Escherichia coli O101 strains of human and porcine origin". J. Clin. Microbiol., (33), pp.3174–3178.
Frydendahl, F., (2002), "Prevalence of serogroups and virulence genes in E. coli associated with postweaning diarrhoea and edema disease in pigs and a comparison of diagnostic approaches", Vet. Microbiol., (85), pp.169-182.
Gannon, V.P.J., Gyless, C.L., (1990), "Characteristics of the Shiga-like toxin produced by Escherichia coli associated with porcine oedema disease". Vet. Microbiol., (24), pp.97-100.
H. Imberechts, P. Deprez, E. Van Driessche and P. Pohl. (1997), "Chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae of Escherichia coli inhibit shedding of F18 positive E. coli by experimentally infected pigs", Veterinary Microbiology., (54), pp.329-341.
Holm, A., and Poulsen, H.D. (1996), "Swine nutrition management update: ZinC oxide in treating E.coli diarrhea in pigs after weaning", Compend. Cont. Educ. Pract. Vet., (18), pp.8.
Hung, Vu Khac (2004), Escherichia coli - Prevalence and comparison of virulece factors in strains isolated from pigs with diarrhoea in Slovak Republic, Ph.D. Thesis, University of Veterinary medicine, Kosice Slovak Republic.
H Yokoyama, R C Peralta, R Diaz, S Sendo, Y Ikemori, Y. (1992), "Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental enterotoxigenic Escherichia coli infection in neonatal piglets", Infect Immun., (3), pp.998-1007.
Isaacson, R.E., and Start, G.L. (1992), "Analysis of K99 plasmids from enterotoxigenic Escherichia coli", FEMS. Microbiol, Lett., (90), pp.141-146.
Jacobs, A.A.C. and de Graaf, F.K. (1985), "Production of K88, K99 and F41 fimbriae in relation to growth phage and rapid procedure for adhesion purification", FEMS. Micribiol, Lett., (26), pp.15-19.
Johansen, M., Andresen, L.O., Jorsal, S.E., Thomsen, L.K., Waddell, T., and Gyles, C.L. (1996), "Vaccination against oedema diseas", Proc. Int. Congr. Pig. Vet. Soc., (14), pp.378.
Khan, A.S., Johnston, N.H., Goldfine, H. and Schifferli. (1996), "Porcine 987P glucolipid receptors on intestinal brush borders and their cognate bacterial ligands", Infect. Immun., (64), pp.3688-3693.
Konowalchuk, J., Speirs, J.I., Stavric, S. (1977), "Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli". Infect. Immun., (18), pp.775-779.
Kwon, D., Choi, C., Jung, T., Chung, H.K., Kim, J.P., Bae, S.S. (2002), "Genotypic prevalence of the fimbrial adhesins (F4, F5, F6, F41 and F18) and toxin (LT, STa, STb, and Stx 2e) in Escherichia coli isolated from postweaning pigs with diarrhoea or oedema disease in Korea", Vet. Red., (12), pp.35-37.
Mainil, J. (1999), "Shiga/Verocytotoxin and Shiga/Verotoxigenic Escherichia coli in animal". Vet. Res., (30), pp.235-257.
Marquers, L.R.M., Peiris, J.S.M., Cryz, S.J., O’Bien, A.D. (1987), "Escherichia coli strains isolated from pigs with oedema disease produce a variant of Shiga-like toxin II". FEMS. Microbiol. Lett., (44), pp.33-38.
Mooi, F.R., Wouters, C., Wijfjes, A., de Graaf, F.K. (1982), "Construction and characterization of mutants impaired in the biosynthesis of the K88ab antigen", J. Bacteriol., (150), pp.512-521.
Nagy, B. (1986), Vaccines against toxigenic Escherichia coli disease in animals, In Development of Drugs and Vaccines against Diarrhea,11th Nobel Conf Stockholm, 1985. Lund: Stdentlitteratur, pp.53.
Nagy, B., Fekete, P.Z. (1999), "Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in farm animals", Vet. Res., (30), pp. 259 - 284.
Pohl, P., Mainil, J. (1995), "F17 positive Escherichia coli", Vet. Rec., (137), pp.623-624.
Ronald R Marquardta, L.Z Jina , Jung-Woo Kima , Lin Fanga, Andrew A Frohlicha, Samuel K. (1998)," Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli K88+ infection in neonatal and early-weaned piglets", FEMS Immunology & Medical Microbiology., pp.11-13.
Sandefur, P.D., Peterson, J.W. (1976), "Isolation of skin permeability factors culture filtrates of Salmonella typhimurium". Infection and Immunity, (14), pp.671-679.
Sarmiento, J.I. (1983), Environmental temperature: A predisposing factor in the enterotoxigenic Escherichia coli induced diarrhea of the newborn pig, M.S. Thesis, Univ. Guel.Ph, Ont.
Sarrazin, E., and Bertschinger, H.U. (1997), "Role of fimbriae F18 for actively acquired immunity against porcine enterotoxigenic Escherichia coli. Escherichia coli", Vet. Microbiol., (54), pp.133-144.
Simons, B.L., Mol, O., van Breemen, J.F.L., Oudega, B. (1994), "Morphological appearance of K88ab fimbriae and optical diffraction analysis of K88 paracrystalline structures", FEMS. Microbiol. Lett., (118), pp.83-88.
Smith, H.W. (1963), "The haemolysisns of Escherichia coli", J. Pathol. Bacterial., pp.197-212.
Soderlind, O., Thafvelin, B., and Mollby, R. (1998), "Virulence factors in Escherichia coli strains isolated from Swedish pigs with diarrhea", J. Clin. Microbiol., (26), pp.879-884.
Sydler, T., Buergi, E., Bertschinger, H. U., and Pospischil, A. (1996), "Edema disease in adult swine", Proc. Int. Congr. Pig.Vet. Soc., (14), pp.272.
Thomlinson, J.R., and Lawrence, T.J.L. (1981), "Dietary manipulation of gastric pH in the prophylaxis of enteric disease in weaned pigs: Some field observations", Vet. Rec., (109), pp.120-122.
Wittig, W., Klie, H., Gallien, P., Lehmann, S., Timm, M., and Tschape, H. (1995), "Prevalence of the fimbrial antigens F18 and K88 and of enterotoxins and verotoxins among Escherichia coli isolated from weaned pigs", Zbl. Bakt., (283), pp. 95-104.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- luan van cao hoc Tr7847n V259n Khnh.doc