I. Đặt vấn đề:
Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC -
embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống
citrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiên
cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát
sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng,
nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể
(Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản
nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mô sẹo
phôi hoá ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ra
nhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn,
không hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000).
Để tạo callus phôi hoá có nguồn gốc từ phôi tâm
(Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể nuôi cấy noãn
đã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phôi hoá còn được
tạo ra khi nuôi cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15
tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo,
1980). Ngoài ra callus phôi hoá đã được tạo ra từ nuôi cấy
mô hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka and
Omura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây
(Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy đầu
nhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giống
citrus khác nhau để tạo callus phôi hoá và tái sinh cây
(Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả cho
thấy các loài C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quả
tạo callus và tái sinh phôi tốt nhất.
Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là xây dựng quy trình
tạo nguồn mô sẹo phôi hoá, từ đó tạo phôi vô tính và tái
sinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống không hạt
và vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.
II. Nguyên liệu và phương pháp:
a/ Nguyên liệu:
Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khác
nhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du,
Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), Quýt
Chum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt lai
Murcott đã được sử dụng trong nghiên cứu.
Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi
khác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầu
nhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoa
được thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành
quả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3,
đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵ
cái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sau
thụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau. Noãn được nuôi cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa
chứa 16 noãn.
Mỗi lô thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quả
non có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tôi tiến hành tách bỏ vỏ
lụa ở bên ngoài của hạt non, sau đó tách loại bỏ phôi non
rồi mới cấy vào đĩa môi trường. Tất cả các thao tác trên
được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.
22 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1836 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hoá và phôi vô tính từ nuôi cấy noãn ở một số giống cây ăn quả có múi, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO PHÔI HOÁ VÀ PHÔI
VÔ TÍNH TỪ NUÔI CẤY NOÃN Ở MỘT SỐ GIỐNG
CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI
Hà Thị Thuý1, Trần Thị Hạnh1,Nguyễn Hồng Chiên1,
Đỗ Năng Vịnh1, Vũ Văn Vụ2
1 Viện di truyền nông nghiệp, 2 Đại học Quốc gia Hà Nội
I. Đặt vấn đề:
Hiện nay, nuôi cấy mô sẹo phôi hoá (ký hiệu EC -
embryogenic callus) là một kỹ thuật cơ bản trong tạo giống
citrus. Callus phôi hoá đã được sử dụng trong nhiều nghiên
cứu khác nhau như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu phát
sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng,
nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể
(Grosser et al, 2000), nghiên cứu chuyển gen và bảo quản
nguồn gen (Kunitake and Mu, 1995).Tái sinh cây từ mô sẹo
phôi hoá ở các giống cam, Grosser và cộng sự đã tạo ra
nhiều dạng đột biến ổn định, như chín sớm hoặc muộn hơn,
không hạt, chất lượng được nâng cao (Grosser et al., 2000).
Để tạo callus phôi hoá có nguồn gốc từ phôi tâm
(Nucellar) in vitro ở citrus người ta có thể nuôi cấy noãn
đã thụ tinh hoặc chưa thụ tinh. Callus phôi hoá còn được
tạo ra khi nuôi cấy các hạt lép của quả chín từ 8 đến 15
tháng tuổi kể từ khi hoa tung phấn (Starrantino and Russo,
1980). Ngoài ra callus phôi hoá đã được tạo ra từ nuôi cấy
mô hoặc cơ quan khác như từ bao phấn (Hidaka and
Omura, 1989), từ chân nhuỵ cái (Style) ở chanh tây
(Limon). Carimi và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy đầu
nhuỵ cái (Stigma) và chân nhị cái (Style) của nhiều giống
citrus khác nhau để tạo callus phôi hoá và tái sinh cây
(Carimi et al., 1995; De Pasquale et al. 1994). Kết quả cho
thấy các loài C.limon, C.medica và Cam ngọt cho kết quả
tạo callus và tái sinh phôi tốt nhất.
Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là xây dựng quy trình
tạo nguồn mô sẹo phôi hoá, từ đó tạo phôi vô tính và tái
sinh cây phục vụ cho nghiên cứu chọn tạo giống không hạt
và vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.
II. Nguyên liệu và phương pháp:
a/ Nguyên liệu:
Các giống cây ăn quả có múi địa phương và nhập nội khác
nhau như: Bưởi Phúc Trạch (Citrus grandis), Cam Vân Du,
Olinda Valencia, Navel, Cam Sành (C. nobilis), Quýt
Chum, Quýt Đường canh (C. reticulata) và quýt lai
Murcott đã được sử dụng trong nghiên cứu.
Mẫu nuôi cấy: noãn trước và sau thụ phấn ở các độ tuổi
khác nhau (từ 1 đến 8 tuần tuổi). Cách làm như sau: Bầu
nhuỵ lấy nuôi cấy một ngày trước khi hoa nở. Sau khi hoa
được thụ phấn, nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành
quả non. Quả non của các giống trên được thu hái ở 1, 2, 3,
đến 8 tuần tuổi kể từ sau khi hoa tung phấn. Từ bầu nhuỵ
cái và quả non đã được khử trùng, tách lấy noãn (noãn sau
thụ phấn phát triển thành hạt non) để nuôi cấy trên các môi
trường khác nhau.
Noãn được nuôi cấy trên đĩa Petri, mỗi đĩa chứa 16 noãn.
Mỗi lô thí nghiệm với 60 quả hoặc bầu nhuỵ. Riêng với quả
non có độ tuổi 6, 7, 8 tuần, chúng tôi tiến hành tách bỏ vỏ
lụa ở bên ngoài của hạt non, sau đó tách loại bỏ phôi non
rồi mới cấy vào đĩa môi trường. Tất cả các thao tác trên
được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi.
b/ Môi trường và điều kiện nuôi cấy nuôi cấy:
Theo kết quả nghiên cứu nuôi cấy bầu nhuỵ và noãn ở quả
non của một số giống citrus thì môi trường MT (Murashige
& Tucker) là môi trường thích hợp nhất cho tạo callus phôi
hoá (Đỗ Năng Vịnh, 2002). Vì vậy chúng tôi tiến hành thí
nghiệm nuôi cấy noãn và hạt non trên nền môi trường này.
+Môi trường tạo callus phôi hoá:
- MT + các nồng độ khác nhau của Kinetine: 0,25; 0,5;
0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 ( mg/l) + 500mg/l Malt
extract + 50g/l đường + 5,0g/l thạch.
- MT + các nồng độ khác nhau của BAP: 0,25; 0,5; 0,75;
1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0 (mg/l) + 500mg/l Malt extract +
50g/l đường + 5,0g/l thạch.
+ Môi trường lỏng lắc nhân sinh khối callus phôi hoá: MT
+ BAP (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) + 30g/l đường + 500mg/l
Malt extract + 1,0g/l glutamin
+ Môi trường tạo phôi:
• G1: MT + 1,0mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch
• G2: MT + 1,5mg/l GA3 + 30g/l đường + 5,0g/l thạch
• BG: MT + 1,0mg/l GA3 + 0,2mg/l BAP + 5,0g/l thạch
+ Môi trường nẩy mầm phôi vô tính: MS hoặc MT + 30g/l
đường, không có chất điều hoà sinh trưởng.
Môi trường được chỉnh đến pH= 5,8. Noãn được nuôi trên
đĩa petri (15mm dày x 60mm đường kính) chứa 12 ml môi
trường thạch, để trong tối.
Nhân mô sẹo phôi hoá: mô sẹo được nhân trên môi trường
đặc (thời gian 1tháng), sau đó chuyển sang môi trường lỏng
( 2 tuần ) rồi lại nhân tiếp trên môi trường đặc. Nhân mô
sẹo trong tối ở nhiệt độ (25 - 27oC). Quá trình phôi hoá của
mô sẹo và nảy mầm của phôi xảy ra trong điều kiện có
chiếu sáng 2400 Lx và thời gian chiếu sáng là 8 h/ngày.
III. Kết quả và thảo luận
1.Tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng
Để tạo vật liệu nuôi cấy vô trùng, chúng tôi tiến hành khử
trùng quả non với hai loại hoá chất Ca(ClO)2 ở nồng độ 6%
và HgCl2 ở nồng độ 0,01%. Kết quả cho thấy với các chất
khử trùng khác nhau và trong khoảng thời gian khác nhau
thì tỉ lệ tạo mẫu sạch là khác nhau.
Khử trùng bằng Ca(ClO)2 ở nồng độ 6% trong thời gian 10
và 15 phút cho tỉ lệ mẫu sạch tương ứng là 62,4% và
87,8%. Khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,01% trong thời
gian 5 và 10 phút, tỉ lệ tạo mẫu sạch tương ứng là 65,5% và
93%. Như vậy, khử trùng bằng HgCl2 cho tỉ lệ mẫu sạch rất
cao nhưng sau đó mẫu nhanh chóng bị thâm đen. Hiện
tượng này không thấy xuất hiện khi khử trùng bằng
Ca(ClO)2. Vì vậy chúng tôi đã chọn chất khử trùng thích
hợp cho quả non là Hypoclorit canxi - Ca(ClO)2 ở nồng độ
6% trong thời gian 15 phút.
2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi noãn bầu nhuỵ trước
và sau thụ phấn lên khả năng tạo callus phôi hoá(EC).
Trước khi hoa nở 1-2 ngày (trước khi thụ phấn) noãn được
tách ra để nuôi cấy. Sau khi hoa được thụ phấn, cánh hoa
và nhuỵ cái rụng, bầu nhuỵ phát triển thành quả non. Kích
thước của noãn tăng dần, sự tăng kích thước là kết quả của
quá trình phân bào xảy ra ở các mô khác nhau, trong đó có
lớp tế bào phôi tâm (nucellar), phôi hữu tính nhị bội và nội
nhũ tam bội thể. Kết quả noãn phát triển thành hạt non.
Sau khoảng 2-5 tháng nuôi cấy, chúng tôi quan sát phản
ứng tạo callus phôi hoá từ noãn và hạt non ở các giống
khác nhau. Đối với nuôi cấy noãn trước thụ phấn, chúng tôi
chỉ thu được callus dạng cứng, màu vàng mà không thu
được callus phôi hoá ở tất cả các giống. Đối với hạt non (từ
quả non) có độ tuổi từ 1-8 tuần tuổi, chúng tôi đã thu được
callus phôi hoá ở các giống cam Vân du, cam Sành, quýt
Đường canh và quýt Chum. Riêng với giống bưởi Phúc
Trạch, chúng tôi chưa thành công trong việc tạo callus phôi
hoá mà chỉ thu được dạng callus cứng, màu vàng trắng.
Mô sẹo phôi hoá tạo được từ noãn (hoặc noãn đã được
phân hoá thành hạt non) đã được nhiều tác giả khẳng định
là có nguồn gốc từ mô phôi tâm (Buttton and
Bornman,1971; Gmitter and Moore,1986). Trong một số
trường hợp, mô sẹo phôi hoá đã được tạo ra từ nội nhũ,tuy
nhiên tỷ lệ cây tái sinh từ nội nhũ hạt non rất thấp (Gmitter
et al.,1991).
Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm ở các giống khác nhau, kết quả
thu được được thể hiện ở bảng 1, Biểu đồ 1.
Bảng 1. Ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy lên sự phát sinh
callus phôi hoá
Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy lên sự phát
sinh callus
Hình ảnh các dạng mô sẹo nhận được từ nuôi cấy mô noãn
sau thụ phấn từ 1-8 tuần tuổi
Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ tạo callus
phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 6 đối với cam Vân Du (12,5%)
và rất thấp ở các độ tuổi 3 (0,9%), tuổi 1 (1,3%), tuổi 2
(1,7%), tuổi 4 (1,35%) và tuổi 5 (1,46) ; Với Cam Sành tỉ lệ
tạo mô sẹo phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 2 (35,5%) và thấp
nhất ở tuổi 3, 4 (tương ứng là 3,6%; 4,2%); ở quýt Chum tỉ
lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 1 (58,2%) và thấp
nhất ở tuổi 8 (5,6%); Cũng giống như quýt Chum, ở quýt
Đường Canh tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở tuổi 1
(63,5%), tỉ lệ này cũng khá cao ở tuổi 7 và tuổi 8 (56,7% và
59,5%).
3. Vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng đối với tạo
callus phôi hoá ở một số giống citrus.
Môi trường MT được nhiều tác giả sử dụng trong nghiên
cứu nuôi cấy mô ở cây ăn quả có múi (Murashige and
Tucker, 1969; Gmitter et al.,1990; Kunitake and Mu,1995).
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với hai loại
phytohormon khác nhau là Kinetine và BAP ở các nồng độ
khác nhau để tìm ra chủng loại và nồng độ phytohormon
thích hợp nhất cho việc tạo callus phôi hoá ở các giống
khác nhau. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở biểu đồ 2
và 3.
Kết quả cho thấy Kinetine có hiệu quả tương đối thấp lên
quá trình tạo callus phôi hoá ở cả 4 giống trên. Tỉ lệ tạo
callus phôi hoá đạt cao nhất mới là 15,3% (nồng độ 2,0mg/l
K) ở giống quýt Đường canh. Với các giống còn lại tỉ lệ
này còn thấp hơn: cam Vân du 9,5% (nồng độ 1,25mg/l K),
cam Sành 10,8% (0,75mg/l K), quýt Chum 13,1%
(0,25mg/l K). Trong khi đó, BAP cho tỉ lệ tạo callus phôi
hoá cao hơn so với Kinetine ở cả 4 giống trên. Tỉ lệ tạo
callus phôi hoá cao nhất là ở giống quýt Đường canh 33,2%
(ở nồng độ 0,5mg/l BAP); tiếp đó là các giống cam Vân du
31,9% (2,0mg/l BAP), cam Sành 29,3% (2,0mg/l BAP),
quýt Chum 27,6% (1,0mg/l BAP). Điều này cho thấy BAP
là loại phytohormon thích hợp cho việc tạo callus phôi hoá
ở một số giống citrus. Các giống cam Vân du và cam Sành
tỏ ra thích hợp với BAP ở nồng độ cao (2mg/l), tuy nhiên,
quýt Chum và quýt Đường canh lại thích hợp ở nồng độ
thấp hơn.
Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của Kinetine đến tỉ lệ tạo callus phôi
hoá ở các giống khác nhau
Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của BAP đến tỉ lệ tạo callus phôi
hoá ở các giống khác nhau
4. Nghiên cứu quy trình nhân sinh khối callus phôi hoá
bằng nuôi cấy lỏng lắc
Mô sẹo thường có biểu hiện lão hoá khá nhanh khi nuôi cấy
trên môi trường thạch trong thời gian dài. Biểu hiện của lão
hoá là tế bào chuyển màu vàng nhạt sang vàng đậm, tiếp
theo là nâu hoá. Tốc độ tăng sinh khối của callus trên môi
trường đặc chậm. Tế bào có thể có biểu hiện khác là phân
hoá thành các dạng khác nhau về cấu trúc và hình thái.
Tính đồng nhất của quần thể tế bào do vậy bị giảm. Để
khắc phục tình trạng này chúng tôi nghiên cứu nhân sinh
khối mô sẹo phôi hoá theo phương thức luân chuyển như
sau: ban đầu sinh khối được nhân trên môi trường đặc,tiếp
sau môi trường lỏng lắc,tiếp theo EC lại được cấy chuyển
để nhân trên môi trường đặc.Như vậy, EC sẽ được nhân
theo chu kỳ đặc,lỏng kế tiếp nhau.
Sau khi thu được sinh khối EC ban đầu từ các giống địa
phương cam Vân du, Cam Sành, Quýt Chum, Quýt Đường
canh và một số giống nhập ngoại: Murcott, Olinda
Valencia, Navel N14-10 trên MT thạch. Chúng tôi tiến
hành thí nghiệm nhân callus phôi hoá trên môi trường lỏng
lắc nhằm mục đích tạo ra dạng callus phôi hoá đồng đều về
kích thước và độ tuổi. Thời gian nuôi cấy callus phôi hoá
trên môi trường lỏng lắc từ 14-20 ngày. Qua theo dõi chúng
tôi nhận thấy rằng sau nuôi cấy14-20 ngày sinh khối callus
đạt được cao, có màu trắng, mịn, gồm các tế bào đơn hoặc
các cụm tế bào nhỏ tách rời, tương đối đồng đều về mặt
kích thước và hình dạng.Kết quả nuôi cấy theo chu kỳ này
cho phép tạo ra khối lượng lớn sinh khối mô sẹo phôi hoá
đồng nhất trong thời gian ngắn.Nuôi cấy trên môi trường
lỏng lắc cho thấy Môi trường MT bổ sung Malt extract
500mg/l, đường 3%, và BAP thích hợp với nhân nhanh
sinh khối mô sẹo phôi hoá.Tuy nhiên các giống khác nhau
thích hợp với các nồng độ khác nhau của BAP.
4. Nghiên cứu tạo phôi vô tính từ callus phôi hoá ở các
giống khác nhau.
Callus phôi hoá thu nhận từ nuôi cấy trên môi trường đặc
và môi trường lỏng của các giống đã được chuyển vào môi
trường tạo phôi. Sau khoảng 2 tháng chúng tôi nhận được
phôi vô tính có lá mầm phát triển. Một số phôi có cấu trúc
tương tự như phôi 2 lá mầm của hạt hữu tính .Với hai giống
cam Vân du và N14-N10, môi trường tạo phôi thích hợp
nhất là môi trường G1. ở môi trường này, phôi vô tính thu
được có dạng hai lá mầm hoàn chỉnh, đơn nhất, kích thước
tương đối đồng đều (Ảnh 7). Trên môi trường G2 và BG,
phôi vô tính thu được có dạng cụm phôi, nhiều lá mầm và
phát sinh nhiều dạng hình thái phôi không rõ ràng (Ảnh 8).
Việc nghiên cứu tạo ra tính đồng nhất của mô sẹo phôi hoá
và những điều kiện môi trường tối ưu để tạo hàng loạt phôi
vô tính có độ đồng đều cao từ các giống citrus khác nhau
cần được tiếp tục nghiên cứu.
6. Nghiên cứu sự nảy mầm của phôi vô tính.
Phôi vô tính thu được từ hai giống cam Vân du và N14-10
được cấy trên hai loại môi trường cơ bản MS và MT không
có phytohormon để phôi nảy mầm thành cây con. Sau 15
ngày, chúng tôi thu được kết quả như sau: trên môi trường
MT phôi có tạo rễ nhưng rễ vẫn còn ngắn và có dạng cụm
rễ. Với dạng rễ như thế, ở cam quýt, cây sẽ khó sống khi
đem ra trồng ở vườn ươm. Ngược lại, trên môi trường MS
phôi ra rễ rất nhanh và sớm tạo cây con hoàn chỉnh,khoẻ
mạnh,chỉ có một rễ ở mỗi phôi (ảnh 9 và 10).Cây con ra
vườn ươm đạt tỷ lệ sống trên 90 %.
IV. Kết luận:
Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu ở trên chúng tôi rút ra
một số kết luận sau:
1. Tỷ lệ tạo callus phôi hoá từ nuôi cấy noãn và hạt non
phụ thuộc vào tuổi quả. Cam Vân Du ở 6 tuần tuổi, cam
Sành 2 tuần tuổi, quýt Chum và quýt Đường Canh ở tuần
tuổi 1,7 và 8 cho tỷ lệ tạo callus phôi hoá cao nhất. Đối với
noãn chưa qua thụ phấn chúng tôi chưa thu được dạng
callus phôi hoá.
2. Môi trường thích hợp cho tạo callus phôi hoá là môi
trường MT bổ sung Malt extract 500mg/l, đường 5%, thạch
5g/l và BAP với nồng độ khác nhau ở các giống khác nhau.
Với cam Vân du tỉ lệ tạo callus phôi hoá đạt cao nhất ở
nồng độ 2,0mg/l; cam Sành 2,0mg/l; quýt Chum 1,0mg/l và
quýt Đường canh 0,5mg/l.
3. Nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc cho thấy Môi
trường MT bổ sung Malt extract 500mg/l, đường 3%, và
BAP thích hợp với nhân nhanh sinh khối mô sẹo phôi
hoá.Tuy nhiên các giống khác nhau thích hợp với các nồng
độ khác nhau của BAP.
4. Callus phôi hoá có xu hướng tạo phôi vô tính trên môi
trường có hàm lượng BAP thấp. Trên môi trường có BAP
nồng độ cao hơn các phôi có xu hướng phát triển không
bình thường.
5. Phôi vô tính với lá mầm phát triển đã nảy mầm thành
cây con khoẻ mạnh khi được nuôi cấy trên môi trường MS
không có chất điều hoà sinh trưởng.
Summary:
Induction of somatic embryogenic callus and somatic
embryos derived from ovule cultures of local citrus
cultivars
Ha Thi Thuy 1, Tran Thi Hanh 1,Nguyen Hong Chien,
Do Nang Vinh 1 ,Vu Van Vu2
Institute of Agricultural Genetics 1, Hanoi National
University 2
Somatic embryogenic callus derived from nucellar cells
have been induced by ovule culture of local Citrus cultivars
including orange Van du (C.sinensis), mandarins Quyt
Chum,Duong Canh( C. reticulata) and Cam Sanh ( Citrus
nobilis).Ovaries and immature fruits (1-8 weeks after
anthesis) are surface disinfected and cut open under
aseptical condition.The ovules are excised and cultured on
the MT culture media with different concentrations of
Kinetine and BAP.The embryogenic callus (EC) induction
rates are quite different and depending both on genotypes
and cultured media.The induced callus have been
propagated by periodically cultures on solid and liquid
media.The suitable media for EC induction and propagation
have been developed for each studied
cultivars.Embryogenic callus were profusely developed
into well-formulated somatic embryos which are developed
into microplants in MT medium without growth
regulator.The percentage of plants survive after transfered
to the soil is very high.
Embryogenic callus is currently used in our laboratory for
different researches: embryogenesis in bioreactor,tetraploid
induction in vitro by colchicine treatement,development of
disease-free materials and for study on obtaining seedless
somaclones derived from local cultivars.
Tài liệu tham khảo:
1. Đỗ Năng Vịnh (2002). "Công nghệ sinh học cây trồng
" Nhà xuất bản NN
2. Button J., Bornman C.H. (1971). Development of
nucelar plantsfrom unpollinated and unfertilised ovules of
Washington Navel orange in vitro, J. South Afric. Bot., 37:
127-134.
3. Cameron. J.W and Reuther. H.B. (1968). Genetics,
Breeding, and nucellar Embryony. In "The Citrus Industry"
H.B. Reuther Edited: 325 - 370.
4. Carimi. F, De Pasquale and Grescimanno F. G.
(1995). Somatic embryo- genesis in citrus from styles
culture. Plant sciences. 105, 81- 86
5. De Pasquale F, F. Carimi and Grescimanno F. G.
(1994). Somatic embryo genesis from styler of different
cultivars of Citrus limon (L.) Burm. Aust. J. Bot.42.587-
594
6. Gmitter. F.G.Fr and G.A.Moore (1986). Plant
regeneration from undeveloped ovules, and embryonic calli
of citrus- Embryo production germination, and plant
survival, J. Plant celltissue organ cultrue, 6, 139- 147
7. Gmitter F.G., Ling X.B., Deng X.X. (1991). Induction
of triploid Citrus plants from endosperm calli in vitro.
Theor. Applied Genet(In press).
8. Grosser J.W, Ollitrault P. and Olivares-Fuster O.,
(2000). Somatic hybridization in Citrus: An effective tool
to facilitate variety improvement. In Vitro Cell. Dev. Biol-
Plant 36: 434 - 449. November - December 2000, Society
for in vitro Biology.
9. Hidaka T, Omura M (1989). Control of embryogenesis
in Citrus cell culture. Regeneration from protoplasts and
attempts to establish a callus bank. Bull fruit tree Ré Stn
Ser B ( Okitsssu) 16: 1-17 ( in Japanese)
10. Kuntake H., Mu M. (1995). Somatic embryogenesis
in Citrus Species. Biotechnology in Argiculture and
forestry, vol. 30.
11. Murashige. T and D.P. H. Tucker, 1969. Growth
factor requirements of citrus tissue cullture, Proc. 1ST Int.
Citrus symp. 3, 1155 -1161
12. . Symposium sur Mandarines - 5 au 11 mars, Corse,
France - INRA: 19.
13. Starrantino. A and F. Russo.1980. Seedling from
undeveloped ovules of ripe fruit of polyembryonic citrus
cultivars. Horst. Science.15. 296- 297
Người thẩm định nội dung khoa học: Ts. Đoàn Duy Thanh
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- 103_1955.pdf