Đề tài Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính protease đông tụ sữa từ Aspergillus awamori và ứng dụng trong sản xuất phomat

liposom cho vào sữa cừu đã được thanh trùng có tác dụng đối với phomat Machego, khi chín làm tăng hàm lượng protein, không gây vị đắng chất lượng cao hơn[22]. Channe Prakash S. và cộng sự (1998) đã cố định protease đông tụ sữa từ chủng Aspergillus niger MC4 lên glycidyl methacrylate-pentaerythritol triacrylate copolymer GP4 để thuỷ phân liên tục kappa-casein ứng dụng trong sản xuất phomat Người ta đã tách từ phomat Cheddar chất lượng tốt loại lactobaccillus các protease và nghiên cứu ảnh hưởng của các protease này tới vị phomat. Tất cả các vi sinh vật này có hoạt lực protease thấp không phụ thuộc vào nhiệt độ và pH trong quá trình sản xuất phomát này, không bị NaCl làm ảnh hưởng[12]. Protease từ nấm mốc đã được nghiên cứu rộng rãi, theo Sannabathi và Srinivasan [21] thì enzym protease của các giống A. nidulans, A. glaucus, Syncephalasrum raccemosum và Cladosporium herbarum có khả năng thuỷ phân protein lớn hơn renin và enzym này còn chịu được nhiệt độ cao. Ngoài ra người ta còn nghiên cứu đặc tính protease làm đông tụ sữa của các giống A. candidus, A. niger, Rhizophus oligosporuos. Theo Nakanishi thì Nhật bản đã sử dụng enzym protease từ A. oryzae làm động tụ sữa trong sản xuất phomat. Người ta đã so sánh hương vị của phomat oryzae với phomat Gouda làm từ renin và đã nhận sau 4 tuần ngâm chín của phomat oryzae bằng phomat Gouda đã ngâm chín sau 16 tuần, thấy tổng các axit béo bay hơi, tổng các hợp chất chứa sunfua, CO2 của phomat oryzae đều cao hơn phomat Gouda, tất cả các hợp chất trên đều tạo cho phomat oryzae hương vị quyễn rũ hơn Gouda. Trong những năm gần đây, đã có nghiên cứu cho rằng enzym từ Endothia parasitica, Mucor pusilus var. Lindt, Murco michei là một đối tượng có thể thay thế renin. Mỹ đã cho rằng đây là chất thay thế an toàn và phù hợp cho renin trong tiêu chuẩn sản xuất phomat. Enzym protease thu được từ Endothia parasitica đã được sử dụng làm phomat, người ta nhận thấy rằng enzym này làm tăng nhanh quá trình chín của phomat Cheddar, hoạt độ phân giải protein mạnh hơn renin trong đông tụ phomat Edam, Tilsit và phomat béo và trong sản phẩm xuất hiện vị đắng khi lượng enzym này vượt quá 70% so với renin. Moris và Mc Kenzie[13] nhận thấy rằng nếu sử dụng 75% enzym và 25% renin thì chất lượng phomat sau 3 tháng ngâm chín có chất lượng tốt, hương vị quyễn rũ và so với renin thì chất lượng loại phomat này là tương đương. Ngay từ năm 1976, người ta đã sản xuất được phomat Domiati từ chế phẩm renin vi sinh vật từ Endothia parasitica. Enzym từ Mucor pusilus var. Lindt có hoạt độ đông tụ gần giống với renin, khi sử dụng enzym này làm phomat Edam và Gouda có gia nhiệt trong quá trình tách whey đã cho hương vị ưa thích hơn phomat làm từ renin. Martens[16] nhận thấy rằng Gouda làm từ Mucor pusilus var. Lindt đã có chất lượng tương đương với phomat làm từ 50% pepxin-50% renin, ngoài ra người ta nhận thấy vị đắng không còn đáng kể sau khi ngâm chín 14 tháng. Enzym protease làm từ Murco michei đã được Europe kiểm tra và công nhận đạt chất lượng là enzym thay thế renin. Khi người ta đã so sánh xác suất của 15 lô phomat Emmental làm từ enzym này rất giống chất lượng phomat này làm từ renin, không có vị đắng, an toàn và phù hợp cho làm phomat Emmental. Thomason và cộng sự đã sử dụng Murco michei protease trong sản xuât phomat Edam, Tilsit và phomat béo qua nghiên cứu đã nhận thấy phomat làm từ enzym này có hiệu quả động tụ sữa cao, chất lượng tốt chín nhanh, không có vị đắng. Phomat Domia được sản xất từ Murco michei có độ thuỷ phân protein cao và có hàm lượng nitơ hoà tan trong hạt sau khi đông tụ cao hơn ở renin. Người ta đã tiến hành nghiên cứu số lượng lớn phoat Cheddar làm từ enzym này và nhận thấy phomat có chất lượng rất tốt, tương đương chất lượng làm từ renin sau khi chín tới. Ngoài ra phomat làm từ enzym này có hương thơm và kết cấu hấp dẫn. Thông thường trong thực tế sản xuất người ta kết hợp các loại emzym từ vi sinh vật khác nhau có khả năng đông tụ phomat theo tỉ lệ nhất định làm cho phomat có hương vị đặc trưng hấp dẫn. Sơ lược về phương pháp sản xuất sản xuất phomat Giới thiệu chung về phomat Phomat có đến hàng nghìn loại khác nhau, rất đa dạng về chủng loại tuy theo đặc điểm mùi vị, hình dáng, hàm lượng chất béo chúng được phân loại theo các cách sau đây[18]: Phân loại theo tác nhân đông tụ cazein hay axit, cũng có loại vừa là kết quả của sự đông tụ cazein bằng cả renin và axit ví dụ như Cottage. Phân loại về hàm lượng nước như phomat cứng ví dụ như Cheddar có hàm ẩm Ê 39%, phomat Havarti có hàm lượng nước Ê50% hoặc loại có hàm lượng nước từ 78-87% thuộc loại phomat mềm. Emmenthat có hàm lượng nước W<56%, Phân loại dựa theo vi khuẩn sử dụng khi ngâm chín phomat như: đa số các loại phomat đều chín nhờ vi khuẩn lactic, phomat Camebert chín nhờ nấm mốc trắng, phomat Gorgonzola và Rocquefort chín nhờ nấm mốc xanh. Phân loại theo cấu trúc phomat, kích thước các lỗ và các loại không có lỗ. Giới thiệu chung về sữa. Sữa là một tập hợp nhiều thành phần, hàm lượng các thành phần cơ bản của sữa có thể giao động trong một phạm vi khá rộng tuỳ thuộc vào sự khác biệt về giống, về điều kiện chăn nuôi. Hợp phần chính của sữa là nước chiếm khoảng 85,5-89,5% bao gồm nước tự do và nước liên kết. Trong thành phần chất khô người ta tìm thấy khoảng 100 chất bao gồm protein, lipit, lactoza, chất khoáng, vitamin, sắc tố, chất khí Protein là một phần quan trọng của sữa, chiếm khoảng 3,4 % trọng lượng của sữa. Protein của sữa bao gồm chủ yếu là cazein, lactalbumin và lactoglobulin. Cazein chứa khoảng 83% protein của sữa. Trong sữa hàm lượng cazein này giao động từ 2,3-2,9% theo khối lượng. Điểm này cazein khác hẳn với lactalbumin và lactoglobulin. Cazein là một protein hoàn thiện, có 3 dạng cazein trong sữa là αs, β và k-cazein chúng khác nhau về lượng phôspho trong phân tử, không nói đến cazein thì nói đến cả 3 loại, trong đó αs- cazein chiếm khoảng 43-65%, β-cazein là 19-35%. Cazein tồn tại ở dạng keo trong sữa, chúng có mức độ phân tán lớn do khả năng hydrat hoá cao và khả năng liên kết của cazein với chất béo. αs- cazein là một hợp phần của cazein, mỗi phân tử của nó có một đầu kị nước và một đầu ưa nước, αs- cazein rất nhạy cảm với ion Ca2+; β-cazein có hai đầu kị nước so với hai phân tử ở giữa, β-cazein không nhạy cảm với Ca2+ ở nhiệt độ thấp; k-cazein có đầu cuối N kị nước còn đầu cuối C chứa nhiều gluxit và ưa nước[14]. Tất cả các loại cazein đều bị photphoril hoá ở những mức độ khác nhau trên gốc Serin và Treonin. Do sự phân bố không đều các diện tích và các mạch bên không cực dọc theo các chuỗi polypeptit nên các cazein tự thân đã có độ tập hợp rất cao. Trong sữa, cazein ở dạng cazenat canxi và cazenat này lại kết hợp với photphat canxi tạo thành phức photphat canxi cazenat (các mixen). Muối canxi của αs- cazein, β-cazein không hoà tan trong nước trong khi muói của canxi của cazein dễ hoà tan trong nước. Chính vì sự phân bố của k-cazein ở mặt ngoài của mixen sẽ tan trong nước như một dạng của dung dịch keo. Đông tụ cazein bằng axit; các phân tử nước cũng liên kết các điện tích của cazein và góp phần duy trì các mixen trong dung dịch. Khi giảm độ pH (do kết quả quá trình lên men tạo ra axit lactic hoặc do axit do con người chủ động đưa vào) các ion H+ của axit sẽ liên kết với mixen mang điện tích âm và làm giảm điện tích của mixen cazein. Khi tới giới hạn, các mixen caze in sẽ đông tụ. Theo lý thuyết điểm dẳng điện pI của cazein là 5,1-5,3. Trong dung dịch nước như điều kiện của sữa, cazein động tụ tốt nhất ở pH 4,5-4,7. Khi cho dư axit, cazein động tụ sẽ tái hoà tan, tạo thành muối và axit. Cazein dễ bị động tụ dưới tác nhân axit, muối, trong môi trường pH thấp. Sự kết tủa cazein trong môi trường axit về bản chất khác sự kết tủa trong môi trường pH thấp, khi tác dụng với axit thì ion canxi của cazein bị tách ra, liên kết muối phức bị phá huỷ tạo kết tủa, kết tủa thu được trong môi trường axit này người ta không thấy có mặt của canxi. Hay nói cách khác là kết tủa cazein trong môi trường axit mang đặc tính của một phản ứng hoá học còn khi tăng nồng độ H+ trong sữa thì mối liên kết giữa nước và các tiểu phần cazein sẽ yếu đi, lớp vỏ solvat mỏng đi đẫn đến sự tích điện giảm xuống, các tiểu phân keo kết hợp với nhau taoh thành sự đông tụ cazein. Đông tụ bằng enzym-renin: dưới tác dụng của renin, cazein–k bị thuỷ phân phá huỷ lớp vỏ háo nước mặt khác cazein–k thông thường phân bố ở mặt ngoài của mỗi mixen do vậy khi mất lớp vỏ háo nước này các ion Ca2+ dễ dàng tiếp xúc với αs- cazein và paracazein làm chúng kết tủa tạo gel. Sự đông tụ của cazein là kết quả sự tạo thành cầu canxi giữa các phân tử cazein cũng như tương tác kị nước giữa các cazein α, β và k. Có thể nói tác động của renin đối với cazein bao gồm 3 bước: Bước 1: renin tấn công lên liên kết peptit ở vị trí Phe105 và Met105 của phân tử cazein-k để tạo thành hai đoạ paracazein -k không tan liên kết với mixen gốc và cazein gluco peptit hoà tan. Paracazein sẽ tương tác kị nước với α và β để tạo thành gel, do tính chất này mà người ta ứng dụng cố định k-cazein với enzym trên gel alginate-Ca, để nâng cao chất lượng hiêu quả trong công nghiệp sản xuất phomat. Bước 2: tạo thành tập hợp. Bước 3: tác động của renin với các cấu tử cazein xảy ra khi ngâm chí phomat. Tốc độ của 3 bước này phụ thuộc chủ yêu svào nhiệt độ và pH. Riêng đối với bước thứ hai thì còn chịu ảnh hưởng của nồng độ canxi, các tính chất của mixen cazein có hoặc lhống có liên kết với serum protein bền tính. Sau khi kết tủa cazein, trong phần nước sữa còn lại chứa α lactabumin, β lactoglobulin và một lượng nhỏ protein albumin. Lactabumin chiếm khoảng 0,5-1% theo khối lượng, 14% so với lượng protein chung, trong phân tử không chứa Ca và P. Lactabumin có 3 dạng là α, β, γ điểm đẳng điện pI là 4,5. Tại pH môi trường xấp xỉ điểm đảng điện lactabumin không bị đông tụ bởi chúng có hoạt độ hydrat hoá lớn. Nhưng khi dưới tác động ở > 700C thì lactabumin bị đông tụ tạo thành dạng bông và không bị đông tụ bởi renin và pepxin. Lactoglobulin chiếm khoảng 0,1% theo khối lượng, 3% so với lượng protein chung. Lactoglobulin có 3 dạng β lactoglobulin epglobulin và pseudoglobulin, điểm đẳng điện là pI 5,3. Tại nhiệt độ 72-750C trong môi trường axit yếu lactoglobulin bị đông tụ dưới tác dụng của renin, pepxin lactoglobulin không bị đông tụ, nhưng khi lên men β lactoglobulin bị biến tính và có thể chuyển vào quện sữa. Các immunoglobin trong sữa bình thường hàm lượng globumin miễn dịch rất thấp, ngược lại trong sữa đầu chúng chiếm tới 90% protein lactoserum. Phương pháp sản xuất phomát Sơ đồ chung sản xuất phomat: Thanh trùng. Thu nhận Làm sạch. Tiêu chuẩn hoá. Làm chín sữa. Cấy chủng lactic Bổ sung PDTS Đông tụ sữa Cắt quệt sữa. Tách nước. ép bánh. Bổ sung muối. Ngâm chín. Bao gói. Bảo quản. Thu nhận và xử lý sữa. Sữa dùng để sản xuất phomat không những phải là sữa tốt, đạt các tiêu chuẩn hoá lý, sinh học như để sản xuất các loại sản phẩm sữa lên men khác mà còn có các yêu cầu đặc biệt khác đó là khả năng đông tụ bởi các renin và khả năng tách nước của phomat. Những đặc tính này phụ thuộc vào từng giống bò, thậm chí từng con riêng biệt. Yếu tố về thời tiết các mùa trong năm cũng ảnh hưởng đến tính chất này của sữa. Công việc xử lý sữa trước khi làm phomat bao gồm: + Làm sạch sữa: quá trìng này giúp loại bỏ đa số vi sinhvật có thể làm giảm chất lượng của sữa. + Thanh trùng sữa: mục đích của việc thanh trùng là hnằm tiêu diệt các vi khuẩn có thể làm ảnh hưởng đến quá trình đông tụ sữa cũng như gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng phomat sau này. Sữa được thanh trùng để làm phomat theo phương pháp Pasteur, ở nhiệt độ70-720C, trong 15-20 giây rồi ngay lập tức làm nguội đến nhiệt độ cần thiết cho quá trình động tụ sữa. Đối với sữa để sản xuất 2 loại phomat Emmenthal và Parmesan thì không được đun nóng quá 400C[18]. Thực tế cho thấy phomat làm từ sữa không thanh trùng thì sản phảm có mùi và hương thơm đặc trưng hơn, hấp dẫn hơn phomat làm từ sữa đã qua thanh trùng. Nhưng ít khi sữa nguyên liệu lại có thể là loại sữa tốt và sạch đến mức độ như vậy để có thể không bị nhiễm tạp làm hỏng sữa không theo ý muốn ở giai đoạn sau. + Làm chín sữa: sau khi thanh trùng làm nguội tới 30-32 0C ta tiến hành làm chín sữa (mục đích làm nguội đến nhiệt độ này là ở nhiệt độ này thì vi khuẩn lactic hoạt động tốt nhất) bằng cách cấy chủng vi khuẩn lactic, tuỳ theo phương pháp sản xuất của từng loại phomat mà tỉ lệ vi khuẩn cho vào là khác nhau khoảng 0,02-0,035%[16], thời gian lên men khoảng 1- 2h đến khi thấy độ axit tăng từ 16-180T đến 32-350T thì dừng với độ axit này thuận lợi cho renin hoạt động. Làm chín sữa là quá trình quan trọng ngâm chín, tạo hương sau này. Để tăng khả năng đông tụ của sữa bởi renin người ta bổ sung một lượng CaCl2 tuỳ theo trường hợp từ 0,15-4%[16,18] hay 5-20 g cho 100 kg sữa, theo Lond. Y(1990) nghiên cứu thì khi bổ sung 0,3g CaCl2 /1lit sữa thì giảm được 27% renin[21], sau khi cho al2 để ít nhất 30 phút trước khi đông tụ sữa. Có thể sử dụng một sôa phụ gia như dùng NaNO3, KNO3 với liều lượng được kiểm soát chặt chẽ nếu không sẽ ảnh hưởng đến quá trình phát triển của hệ vi sinh vât và sự chín sinh học của phomat, dùng caroten hoặc orleana để điều chỉnh màu cho thêm hấp dẫn. Trong một số trường hợp lại sử dụng đến chất tẩy màu làm nhạt màu tự nhiên của phomat từ vàng thành trắng làm nổi hạt mốc xanh. Sản xuất phomat. + Đông tụ sữa: là quá trình quan trọng trong sản xuất phomat, người ta thường sử dụng renin làm tác nhân đông tụ, có thể thay thế một phẩn renin bằng các chế phẩm enzym từ thực vật, vi sinh vật.. có khả năng đông tụ sữa. Nhiệt độ tối ưu của renin là 400C[13,16] nhưng trong thực tế người ta thường tiến hành đông tụ ở 30-320C bởi có thể sử dụng một lượng enzym lớn hơn cần thiết , lượng dư này có lợi cho quá trình chín sinh học và cũng như thu được hạt phomat có độ cứng vừa phải, nhệt độ này cũng phù hợp với nhiệt độ phát triển của hỗn hợp vi khuẩn trong sữa. Lượng enzym đông tụ có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng tới kết cấu của quện sữa, ảnh hưởng tới độ tách nước, tới chất lượng của phomat, tới độ mất các chất béo vào trong nước sữa. Nếu lượng enzym quá lớn sẽ làm tách nước mạnh, làm giảm lượng phomat, quện sữa đặc hơn, trong nước sữa chứa nhiều chất béo hơn. Còn nếu không đủ lượng enzym làm cho quện sữa mềm làm giảm độ tách nước, xử lý quệ n sữa phức tạp hơn. Tuỳ phương pháp cho renin vào với tỉ kệ khác nhau thường từ 0,02-0.04%[6]. Trong thực tế, renin rất bị hạn chế do nguồn nguyên liệu nên người ta thường dùng phối hợp với nguồn protease khác nhau như renin bò, pepxin lợn và protease vi sinh vật. Cắt quệt sữa: sữa được đông tụ sau 40-45 phút sau đó ta tiến hành cắt quệt sữa thành nhiều miếng nhỏ, mục đích của việc cắt này là làm tăng nhanh quá trình tách nước sữa, các hạt phomat được tạo thành được đảo trộn nhẹ nhàng để ngăn chặn sự kết dính giữa các hạt. Ngoài yếu tố cơ học người ta còn dùng các yếu tố nhiệt độ để đẩy nhanh quá trình tách, tuỳ từng loại phomat nhiệt độ có thể là 38-420C hoặc 52-580C tốc độ gia nhiệt khoảng 0,3-0,60C/ phút. Tách nước, ép bánh: sau khi thu được những hạt phomat người ta đổ chúng vào khuôn có lỗ nhỏ để thoát nước khi ép, quá trình ép là quá trìng hạt phomat được kết dính lại thành một khối có hình dạng nhất định, đây cũng là quá trình điều chỉnh hàm lượng nước trong phomat. Đối với từng loại phomat thì các thông số như áp suất nén, thời gian nén, nhiệt độ, pH.. là những thông số cụ thể ví dụ như: đối với phomat cứng áp suất nén trong 24-48h loại Cheddar áp suất nén là 1,0-1,5 bar, 24 giờ, lọai phomat mềm áp suất nén là 0,3-0,4bar, 2-3 giờ. Muối phomat: để tạo vị cho phomat và để cho vi sinh vât phát triển, tác động tốt đến trạng thái, chất lượng tốt khi bảo quản thì người ta thường tiến hành muối phomat. Người ta nhận thấy rằng hoạt tính của vi khuẩn lactic mạnh hơn khi hàm lượng muối của phomat khoảng 0,5%. Muối có tác dụng tạo áp suất thẩm thấu, giữ chất lượng khi bảo quản. mặt khác, vi khuẩn tạo chất thơm rất nhạy cảm với muối còn là tác nhân tạo gas đó chính là sự tạo thành lỗ rỗng trong phomat. Thường thì có các cách muối như: muối trong hạt, muối trong nước muối, muối bằng muối khô. Muối trong hạt là bổ sung muối sau khi tháo một phần nước sữa với lượng là 20-30 cho 100kg sữa[19]. Muối bằng muối khô là rắc thẳng muối khô lên bề mặt phomat, muối sẽ được hoà tan nhờ nước chảy ra từ phomat và thấm vào phía trong phomat còn bằng nước muối là người ta dùng nước muối với nồng độ 16-23%, nhiệt độ muối 150C, thời gian muối tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng từng khối hạt phomat. Ngâm chín, bảo quản: ngâm chín ở 7-12 0C. Đây là quá trình chín sinh học xảy ra đồng thời, sự biến đổi của tất cả các thành phần, protein bị renin thuỷ phân không sâu tạo thành polypeptit, peptit các sản phẩm này thúc đẩy sự hoạt động của vi khuẩn lactic tạo thành axit amin tự do và xuất hiện các axit amin mới, chất béo tạo thành các axit béo tự do bay hơi và không bay hơi, đường lactoza tạo thành axit lactic, axit axetic, axit propionic, rượu, aldehyt tất cả các sản phẩm trên tạo cho hương vị phomat thêm hấp dẫn và là thước đo giá trị dinh dưỡng của phomat. Phần II. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Chủng vi sinh vật + Aspergilus awamori có nguồn gốc từ pháp, lấy từ bộ sưu tập giống của Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm thuộc Trường ĐHBK Hà Nội. 2.1.2. Sữa tươi. + Sữa tươi Ba Vì, trước khi sử dụng đã được thanh trùng theo phương pháp pasteur ở nhiệt độ 75-800C trong thời gian 15-30 giây rồi làm nguội ngay và bảo quan ở 4-100C sử dụng trong 48 tiếng. + Sữa gầy. 2.1.3. Chế phẩm renin, lactic. + Renin tinh khiết có nguồn gốc từ Pháp, do trung tâm chăn nuôi dê và thỏ Ba Vì cung cấp. + Các chủng vi khuẩn lactic từ chế phẩm Flora danica MSP-CHR Hansen 2.2. Thiết bị. + Máy so màu quang điện (UV-VIS) hãng Pharmacy + Máy ly tâm lạnh Bekman của Mỹ + Máy sấy hồng ngoại + Máy đo pH + Máy lắc ổn nhiệt Shelab (Mỹ) 2.3. Hoá chất Dung dịch nhuộm: Coomassie brilliant blue 0.1% (w/v), Methanol 3% (v/v), Acetic 10% (v/v). Dung dịch rửa: Methanol 30% (v/v), Acetic 10% (v/v). Đệm mẫu: 0.1 ml Bromophenol blue 10%, 0.3 ml Glycerin 100%, bổ sung nước đến 1 lít. Đệm chạy điện di protein: Tris-HCl 25mM, pH 8.4, Glycerol 0.192M, SDS 0.1% (w/v). 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp vi sinh vật. Phương pháp nuối cấy chìm: Là phương pháp nuôi mà vi sinh vật phát triển trong môI trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục. * Môi trường giữ giống. Môi trường giữ giống là môi trường thạch-malt. * Môi trường hoạt hoá giống bao gồm: Đường sacarose 0.5%, Cao nấm men 0.5%, Pepton 0.5%, KH2PO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.05%. Môi trường được đổ vào các bình tam giác 250ml khoảng 100ml dịch nuôi sau đó thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong vòng 20 phút. Cấy chủng từ ống nghiệm vào canh trường và nuôi lắc ở nhiệt độ 300C trong vòng 18giờ. Ta được môi trường đã hoạt hoá * Môi trường nuôi (M1) + Đường sacharose 0.5% + Cao nấm men 0.3% + Pepton 0.5% + KH2PO4 0.1% + MgSO4.7H2O 0.05% Môi trường được đổ vào các bình tam giác 250ml khoảng 100ml dịch nuôi sau đó đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong vòng 20 phút. Cấy chủng vi sinh vật từ canh trường đã hoạt hoá bằng cách: lấy 5 ml dịnh từ canh trường đã hoạt hoá cho vào môI trường nuôi chế phẩm. Tiến hành nuôI lắc ở 200 vòng/ phút trong vòng 60 giờ ở nhiệt độ 300C ta thu được dịch có chứa enzym protease đông tụ sữa. 2.4.2. Phương pháp hoá sinh 2.4.2.1. Xác định độ ẩm Độ ẩm của nguyên liệu, mẫu nghiên cứu và chế phẩm emzym được xác định bằng phương pháp sấy mẫu tới trọng lượng không đổi. Độ ẩm được xác đinh bằng công thức: X: Độ ẩm. % a: trọng lượng mẫu nghiên cứu và hôp trước khi sấy, g b: trọng lượng mẫu nghiên cứu trước khi sấy ở 100-1050C đến trọng lượng không đổi, g c: Trọng lượng hộp để sấy, g 2.4.2.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến. Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng thuỷ phân cơ chất bởi enzym trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrozin để định lượng sản phẩmtương ứng do enzim xúc tác tạo nên. Hoạt độ protease dặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải protein tới peptit và axit amin của enzym. Được biểu thị bằng số đơn vị trên 1g chế phẩm. Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu thị số đơn vị protease trên 1mg của chế phẩm. Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym trong thời gian 1 phút ở 300C chuyển hoá được một lượng cơ chất tương đương với 1 milimol Tyrozin thành dạng không bị kết tủa bởi axit tricloaxetic (TCA). Hoạt độ protease của dịch emzym được tính bằng đv/g được xác định theo công thức: trong đó D: mật độ quang đo được của mẫu. 4: tỷ lệ giữa thểt tích của hỗn hợp phản ứng và thể tích của dung dịch enzym sau khi bổ sung TCA. TE: Đương lượng tyoyn xác định theo đường chuẩn( đương lượng tyroin là mật độ quang mà 1 mmol tyroin có trong 1ml dụng dịch chuẩn khi phản ứng với thuốc thử Folin có thể được). 10: thời gian thuỷ phân cơ chất, phút. M: lượng chế phẩm enzym( lấy để thuỷ phân cơ chất), tính bằng mg có trong ml dung dich enzym. 1000: hệ số chuyển đổi sang gam chế phẩm. 2.4.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ đông tụ sữa Hoạt độ đông tụ sữa là lượng enzym cần thiết để làm đông tụ dung dịch sữa đã loại mỡ, có nồng độ xác định trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 400C. Để so sánh hoạt độ đông tụ sữa của các chế phẩm khác nhau người ta so sánh thời gian (t) để đông tụ sữa trong cùng một điều kiện phản ứng. Lượng enzym tính bằng miligam, thời gian tính bằng phút hoặc giây. 1(U/ phản ứng) là lượng emzym cần thiết trong 2,5 ml dịch enzym để đông tụ 10 ml sữa gầy hoàn nguyên trong 10 phút ở nhiệt độ 400C. Cách tiến hành: cho 2,5 ml dung dịch enzym vào ống nghiệm thêm 10ml dung dich sữa (12g sữa gầy trong 100 ml dung dịch CaCl2 0,01M) ở 400C. Tất cả các dung dịch phải đạt đến 40 0C trước khi trộn lẫn với nhau. 2.4.2.4. Xác định độ axit của sữa và phomat Độ axit của sữa là số ml dung dịch NaOH hay KOH có nồng độ 0,1M cần thiết để trung hoà lượng axit có trong 100 ml sữa với chất chỉ thị là phenoltalein 1% được tính theo đô Therrner(0T). Ngoài việc xác tính đọ axit theo 0T người ta còn tính lượng axit theo một lượng axit hữu cơ như tính theo số mg axit lactic có trong 100 ml sữa. Độ axit( theo axit lactic) =0T. 0,009( % axit lactic) Đối với phomat cách xác định độ chua như sau: Cho vào bình tam giác có dung tích 250ml 5g phomat đã nghiền với 40 ml nước cất ở nhiệt độ 450C, nhỏ 3-4 giọt chỉ thị phenoltalein 1% và chuẩn bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền không mất trong 30 giây Độ axit được tính: X(0T) = 20.VNaOH Với 20 là hệ số chuyển về 100ml sữa. 2.4.2.5. Phân tách protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamit-SDS (SDS-PAGE). Nguyên lý Khi điện di trên gel polyacrylamide SDS (SDS-PAGE), sự phân tách các protein không phải dựa vào sự tích điện bên trong của các polypepetit mà dựa vào trọng lượng phân tử. SDS (sodium dodecylsulfate) là chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm. SDS làm biến tính protein bằng cách bao phủ quanh mạch polypeptit chính của protein và tạo mạng lưới điện tích âm dọc chiều dài chuỗi polypeptit. Cùng với một yếu tố khử, SDS làm các protein duỗi thẳng mạch và tích điện âm. Dưới tác dụng của dòng điện một chiều khi điện di, các phân tử protein sẽ di chuyển đến cực dương và phân tách thành các băng khác nhau theo trọng lượng phân tử. Các băng protein được xác định bằng nhuộm Coomassie. Thực hiện Qui trình chạy điện di protein thực hiện theo Laemmli. Bản gel sau đó được nhuộm bằng Coomassie trong 1 giờ rồi tẩy màu sẽ xuất hiện các băng protein bắt màu xanh trên bản gel màu trắng. 2.4.2.7. Xác định protein hoà tan bằng phương pháp Lowry(1951) Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa protein và thuốc thử folin, thuốc thử này tạo phức xanh tirozin và triptophan ở dạng tự do và kết hợp. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với hàm lượng protein trong một phạm vi nhất định và từ giá trị mất độ quang tìm được dựa theo đường chuẩn protein ta tìm được hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu. Hàm lượng protein của dung dịch được xác định dựa trên đường chuẩn protein là abumin máu bò. Cách tiến hành như sau: Chuẩn bị 20ml NaOH 0,1N vào cốc Cân chính xác 0,5g mẫu Chuyển vào cối và vho dung dịch NaOH 0,1 N từ cố vào để làm ẩm Chuyển toàn bộ mẫu vào bình tam giác Tráng sạch cối, chày bằng dung dịch NaOH còn lại rồi dặt mầu lên bếp đun cách thuỷ trong thời gian 15 phút. Lấy mẫu ra làm nguội rồi trung hòa bằng HCl 5%. Chuyển mẫu sang bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất tới vạch. Lắc đều, sau đó lọc bã và thu lấy dịch lọc. Lấy và 1 ống nghiệm 0,3 ml dịch lọc protein, 3ml dung dịch C để yên trong 10 phút. Cho tiếp 0,3 nl dung dịch Folin và lắc đều để phản ứng trong 20 phút. Lấy vào ống nghiệm khác 0,6 ml H2O thêm 6ml dung dịch C và lắc đều. Để yên trong 10 phút, cho tiếp vào 0,6 ml dung dịch Folin và để yên trong 20 phút. Đo độ hấp phụ của dung dịch màu của các ống thí nghiệm ở bước sóng 750nm ta thu được giá trị OD từ đó xác định được hàm lượng protein. phần III. Kết quả và thảo luận 3.1 Tuyển Chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa cao Theo nghiên cứu của các nguồn tài liệu khác nhau cho thấy nấm mốc là loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra protease nhất là chúng có thể tổng hợp ra protease đông tụ sữa. Từ bộ sưu tập giống vi sinh vật thuộc nòi Aspergillus của Bộ môn Hoá Sinh Trường Đại học BKHN, ta tiến hành nghiên cứu tuyển chọn ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa cao nhất. Nuôi ở hai chế độ nuôi tĩnh và nuôi lắc, sau mỗi khoảng thời gian nhất định lấy mẫu ra xác định hoạt độ đông tụ sữa. Kết quả thể hiện trong bảng 1. Bảng 1. Khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa của một số chủng nấm mốc Chủng vi sinh vật Hoạt độ protease (U/phản ứng) tính theo ngày 2 3 4 5 6 7 A. niger 5 Nuôi lắc 3.33 4.50 1.42 0.66 0.50 0.33 Nuôi tĩnh 0.00 0.00 0.25 0.40 1.42 3.00 A. awamori Bk18 Nuôi lắc 3.33 5.00 3.33 1.00 0.83 0.50 Nuôi tĩnh 0.00 0.00 0.25 0.83 1.42 6.67 A. niger 40 Nuôi lắc 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Nuôi tĩnh 0.00 0.00 0.00 0.00 0.25 2.00 A. niger 92 Nuôi lắc 0.00 0.00 0.22 0.29 0.66 1.00 Nuôi tĩnh 0.00 0.25 1.00 2.00 1.66 1.66 A. niger PBC Nuôi lắc 0.00 0.25 0.33 0.83 1.00 1.00 Nuôi tĩnh 0.00 0.25 0.50 0.83 1.25 1.25 Kết quả nghiên cứu cho thấy tất cả các chủng đều có khả năng sinh tổng hợp protease đông tụ sữa song chủng A. awamori 18 và chủng A. niger 5 có khả năng sinh ra protease đông tụ sữa cao. Cả hai chủng này ở chế độ nuôi lắc cho hoạt độ cao ngay tại ngày thứ 3, còn chế độ nuôi tĩnh sau 7 ngày hoạt độ đạt 6.67UI. Do ở chế độ nuôi tĩnh thời gian lâu hơn. Vậy nên qua thí nghiệm này chúng tôi chọn chủng A. awamori 18 và phương pháp nuôi lắc cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Tìm môi trường thích hợp để nuôi cấy A. awamori 18 cho hoạt độ đông tụ sữa cao. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym có thể là pH, thành phần môi trường, nhiệt độ, thời gian nuôi, tỉ lệ bào tử cấy truyền và độ ẩm,. . .. Trong nghiên cứu này chúng tôi dựa vào môi trường MT1 ở trên và điều chỉnh các yếu tố và hàm lượng của thành phần môi trường như nguồn cacbon, nguồn nitơ, pH đầu. 3.2.1. ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt độ PĐTS. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật là một trong những yếu tố ảnh hưởng quyết định đến quá trình sinh tổnh hợp ra những enzim cần thiết. Nguồn cacbon là một trong những yếu tố môi trường quan trọng mà chúng ta cần nghiên cứu. Cố định các thành phần nitơ và muối khoáng, pH, tiến hành nuôi trên các nguồn cacbon khác nhau: Glucoza, sacaroza, maltoza, gạo, ngô, milk-whey với lượng tương đương (5g/l), sau 3 ngày nuôi lấy mẫu ra xác định. Kết quả thể hiện ở bảng 2. Bảng 2. ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh PĐTS* Nguồn cacbon Hoạt độ đông tụ(U/phản ứng) Hoạt độ thuỷ phân(U/ml) Glucoza 1.24 1.12 Sacaroza 5.00 0.45 Maltoza 0.00 1.92 Gạo 0.66 2.21 Ngô 1.00 2.40 Milk-whey 4.50 1.25 (*) Protease đông tụ sữa Từ kết quả thu được ở bảng trên ta thấy maltoza không cho hoạt độ đông tụ sau 3 ngày nuôi còn 4 nguồn cacbon khác đều cho hoạt độ đông tụ. Trong đó sacaroza cho hoạt độ cao nhất 5 (U/ml) và hoạt tính thuỷ phân nhỏ nhất 0.45 (U/ml). Điều này phù hợp với nghiên cứu của Amal M. Hashem (1999). 3.2.2. ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt độ PĐTS Cố định nguồn cacbon là sacaroza với nồng độ là 0,5% tiến hành thí nghiệm trên các nguồn nitơ khác nhau: NH4)2SO4, NH4NO3, cao nấm men, pepton, hỗn hợp cao nấm men và (NH4)2SO4, hỗn hợp cao nấm men và pepton với lượng nitơ tương đương. Kết quả thu được ở bảng sau: Bảng 3. ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp PĐTS Nguồn nitơ Hoạt độ PĐTS (U/phản ứng) Hoạt tính thuỷ phân(U/ml) (NH4)2SO4 0,28 1.02 NH4NO3 0,25 0.79 Cao nấm men 2.00 1.35 Cao nấm men, (NH4)2SO4 1,42 1.23 Pepton 3,33 0.97 Cao nấm men + pepton 5.00 0.45 Kết quả bảng 3 cho thấy trong sáu phương án sử dụng nguồn nitơ thì khi sử dụng nguồn nitơ là pepton vi sinh vật tổng hợp protease đông tụ sữa tương đối cao nhưng hoạt độ thuỷ phân lại cũng cao. Hỗn hợp cao nấm men và pepton cho hoạt độ đông tụ cao nhất (5U/phản ứng) và cho hoạt độ thuỷ phân thấp nhất (0.45U/ml). Nên chúng tôi chọn nguồn nitơ thích hợp để sinh tổng hợp protease đông tụ sữa là hỗn hợp cao nấm men và pepton. Điều này cũng phù hợp với nghiên cứu của Amal M. Hashem [8]. 3.2.3. ảnh hưởng của pH môi trường nuôi ban đầu tới quá trình sinh tổng hợp PĐTS. Cố định thành phần muối khoáng, bổ sung szcaroza 0,5%, pepton 0.5%, cao nấm men 0.3% trong môi trường dinh dưỡng gốc. Điều chỉnh pH môi trường ban đầu khác nhau. Sau 3 ngày nuôi lấy ra xác định các thông số pH canh trường, hoạt độ PĐTS. Kết quả được trình bầy trong hình 1. Hình1. ảnh hưởng của đầu pH đến khả năng sinh tổng hợp EĐTS Kết quả hình trên cho thấy dù pH đầu của dịch môi trường đầu được điều chỉnh khác nhau nhưng sau 3 ngày nuôi dịch canh trường có pH nằm trong khoảng từ 4-6. Hoạt độ EĐTS tăng dần từ pH 3,5 đến cực đại là 6 sau đó giảm mạnh ở pH lớn hơn 6. 3.3. Động thái quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp PĐTS Tiến hành nuôi Aspegillus awamori 18 trên môi trường thích hợp đã tìm thấy ở trên trong máy lắc tốc độ 200 vòng/phút ở 300C , cứ 6 giờ ta lấy mẫu một lần để xác định hàm lượng sinh khối, pH và hoạt tính đông tụ sữa. Kết quả thu được ở hình 2. Hình 2. Động thái quá trình phát triển và sinh tổng hợp PDTS của A. awamori Qua hình 2 ta thấy từ 18- 46 giờ nấm mốc sinh trưởng và phát triển và sinh khối đạt cực đại sau 48 giờ nuôi cấy. Sau 48h vi sinh vật ở pha cân bằng và sau 60 giờ sinh khối bắt đầu giảm tại thời điểm này protease đông tụ sữa tiết ra với hoạt tính đông tụ sữa cao nhất (60 giờ nuôi cấy). Từ 60 – 78 giờ hoạt độ protease bắt đầu giảm và giảm mạnh sau 78 giờ, đây có thể do sự tiết ra của các enzim protease tự phân đã phân huỷ luôn cả PĐTS. Điều này phù hợp với một số tài liệu đã nghiên cứu là protease đông tụ sữa được tạo thành nhiều nhất khi nấm mốc bắt đầu hình thành bào tử[18]. 3.4. khảo sát nồng độ ethanol thích hợp kết tủa thu pđts Dịch nuôi sau khi thu được lọc bỏ sinh khối rồi kết tủa bằng cồn 99,7% nồng độ cồn khi tủa lần lượt là 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. Tiến hành kết tủa trong điều kiện nhiệt độ dưới 00C. Sau đó li tâm ở tốc độ 10 000 vòng/phút ở 40C, lọc bỏ dịch trong ta thu được kết tủa. Sau khi kết tủa thì ta đem chế phẩm đi xác định hoạt tính đông tụ sữa. Kết quả thu được ở bảng sau: Bảng 4. Khảo sát nồng độ ethanol kết tủa thu PĐTS Nồng độ ethanol (%) Hiệu suất thu hồi (%) 30 0.00 40 0.00 45 0.00 50 0.00 55 17.14 60 24.00 65 40.00 70 60.00 75 46.15 80 33.33 Kết qủa là với nồng độ cồn Ê50 thì PĐTS chưa bị kết tủa. Nồng độ etanol từ 55% trở PĐTS bắt đầu kết tủa và cho hiệu suất thu hồi lớn nhất ở nồng độ 70%, nồng độ etanol lớn hơn 75% enzym bị vô hoạt dần. Vậy nồng độ etanol thích hợp nhất cho kết tủa thu PĐTS trong nghiên cứu này là 70% (v/v). 3.5. một số đặc tính của pĐTS từ A. awamori 18 . 3.5.1. ảnh hưởng của pH tới hoạt độ PĐTS pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzim, mỗi enzym hoạt động mạnh trong vùng pH khác nhau, ở giá trị pH mà enzym hoạt động mạnh nhất gọi là pH tối ưu, mỗi enzym có vùng pH tối ưu khác nhau. Vì vậy ở đây chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt độ proteasse đông tụ của chủng nẫm mốc Aspergillus awamori 18. Sữa tách bơ được pha trong các dung dịch đệm có pH khác nhau lần lượt là 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7: Kết quả được biểu diễn bằng đồ thị ở hình 3 Hình 3. ảnh hưởng của pH tới hoạt độ PĐTS Từ hình 3 cho thấy trong khoảng pH từ 5,5 đến 6,5 PĐTS cho hoạt độ tương đối cao và cao nhất tại pH =6, đặc tính này của enym rất phù hợp với công nghệ sản xuất phomat vì pH của sữa trứơc khi cho vào đông tụ thường khoảng 6,0-6,5. 3.5.2. ảnh hưởng của pH tới tính bền của PĐTS Protease đông tụ sữa có tính bền trong các pH khác nhau, chúng tôi tiến hành thí nghiệm ở các pH khác nhau: 4; 6; 7. ở nhiệt độ 300C, trong thời gian 8 giờ cứ 2 giờ xác định một lần. Kết quả được thể hiện ở hình 4. Hình 4. ảnh hưởng của pH tới tính bền của protease đông tụ sữa Kết quả cho thấy khi giữ ở pH 4 sau 7 giờ hoạt độ của protease động tụ sữa còn giữ được tới 69,7% và pH 6 hoạt độ giữ được là 62.2%, khi pH tăng lên 7 sau 7 giờ thì hoạt độ chỉ còn 52.2%. Vậy protease này bền vững trong vùng pH từ 4-6. 3.5.3. ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ PĐTS Nhiệt độ cũng là yếu tố tác động mạnh mẽ tới hoạt độ của protease đông tụ sữa. Khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng tăng nhưng chỉ đến một mức nào đó nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì vận tốc phản ứng đông tụ sữa sẽ giảm vì khi nhiệt độ cao sẽ làm biến tính protein gây bất hoạt enzym. Nhiệt độ mà ở đó enzym hoạt động mạnh nhất gọi là nhiệt độ tối ưu. Mỗi protease đông tụ sữa có một nhiệt độ tối ưu khác nhau. Thí nghiệm cho protease đông tụ sữa vào dung dịch sữa gầy và để ở nhiệt độ lần lượt là: 30, 35, 40, 45, 50, 55, 600C. Kết quả khảo sát về tác động của nhiệt độ tới hoạt tính của protease đông tụ sữa được biểu diễn ở hình 5. Hình 5. ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ protease Kết quả cho thấy khi tăng nhiệt độ từ 300C lên thì hoạt độ protease cũng tăng dần và đạt cực đại ở 400C. Khi nhiệt độ lớn hơn 450C thì hoạt độ enzym giảm mạnh. Vậy nhiệt độ thích hợp của enzym này là 400C. 3.5.4 ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của protease đông tụ sữa Nhiệt độ có tác động mạnh mẽ tới tính bền protease, chúng tôi thí nghiệm với giải nhiệt độ: 300C; 400C; 500C, ở pH 2,5; thời gian xác định lúc đầu là 1 tiếng sau đó cứ 2 tiếng lấy mẫu một lần. Kết quả thu được ở hình 6. Hình 6. ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền của protease đông tụ sữa Kết quả hình trên cho thấy tại 400C ở giờ thứ 7 vẫn còn 63,12% hoạt lực, còn ở 500C thì chỉ còn 50% hoạt lực. Như vậy ở nhiệt độ ³ 50oC protease đông tụ sữa mất hoạt độ nhanh. 3.6. Nghiên cứu ứng dụng pđts trong sản xuất phomat 3.6.1. Khảo sát lượng protease làm đông tụ sữa Theo phương pháp sản xuất phomat truyền thống, sữa được làm đông tụ bởi renin. Thời gian từ lúc cho renin đến lúc đông tụ trong 40 phút là tốt nhất, sự đông tụ xảy ra nhanh hơn hay chậm hơn 40 phút đều cho phomat chất lượng không tốt. Vì khi lượng protease đông tụ sữa quá lớn sẽ làm tách nước mạnh, giảm lượng phomat quệt sữa đặc hơn, trong nước sữa chứa nhiều chất béo hơn, còn nếu không đủ lượng protease đông tụ sữa sẽ làm cho quện sữa mềm, khó tách nước, xử lý quện sữa phức tạp hơn và ảnh hưởng tới quá trình chín sau này. Kết quả tìm được qua thực nghiệm là khi cho chế phẩm enzym với tỉ lệ 0,03 % sẽ làm đông tụ sữa trong 40 phút. 3.6.2. Thử nghiệm thay thế renin bằng protease đông tụ sữa trong sản xuất phomat Trong nghiên cứu này chúng tôi thay thế renin bằng protease đông tụ sữa từ A. awamori với tỷ lệ khác nhau và đánh giá một số thông số về chất lượng của phomat, so sánh với phomat làm từ 100 % renin. Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tỉ lệ thay thế renin ở bảng sau. Bảng 5. Tỉ lệ thay thế renin bằng enzim đông tụ sữa các mẫu phomat STT Công thức thay thế rennin Tỉ lệ thay thế enzym Renin chế phẩm PĐTS 1 100% Renin 0.04 0 2 100% protease đông tụ sữa 0 0.3 3 50% Renin 50% protease đông tụ sữa 0.02 0.15 4 75% Renin 25 protease đông tụ sữa 0.03 0.075 5 25% Renin 75 protease đông tụ sữa 0.01 0.225 Chúng tôi lấy sữa bò tươi nguyên bơ từ Ba Vì đã được thanh trùng sau đó bổ sung 0.045% hỗn hợp vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ Pháp vào và cho lên men ở 320C trong vòng 2 giờ. Sữa có độ chua 32-350T sau đó cho chế phẩm PĐTS hoặc renin vào theo tỉ lệ ở bảng trên, để tăng hiệu suất đông tụ chúng tôi bổ sung CaCl2 0.1%. Để 40 phút ở nhiệt độ 400C sữa đông tụ tạo gel, cắt tách nước và bổ sung 0.1% NaCl rồi cho vào ép trong khuôn có lỗ thoát nước trong vòng 2,5 giờ ở nhiệt độ phòng với lực ép là 1,5 bar. Phomat sau khi ép đem bọc giấy đặc biệt và ủ chín ở nhiệt độ 4-100C trong vòng 2-6 tháng. Quy trình sản xuất phomat có bổ sung protease đông tụ sữa Sữa tươi Thanh trùng Làm nguội Cấy chủng vi khuẩn laclic Lên men lactic Bổ sung protease đông tụ Đông tụ sữa Cắt tách nước ép bánh Đóng gói NaCl Phomat tươi ủ chín Phomat chín Bổ sung CaCl2 Hình 7: Mẫu phomat tươi và mẫu 100% protease đông tụ sau 1 tháng ử chín Hình 8: Mẫu phomat làm từ 50% protease đông tụ sữa Hình 9: Mẫu phomat làm từ 100% renin và 100% protease đông tụ sữa Hình 10: Mẫu phomat làm từ 25% protease đông tụ sữa và 75% protease đông tụ sữa 3.7. kiểm tra chất lượng phomat 3.7.1. Thành phần hoá học của phomat tươi. Độ ẩm, độ chua, hàm lượng protein hoà tan là những chỉ tiêu ảnh hưởng đến chất lượng của phomat. Do vậy chúng tôi xác định các chỉ tiêu trên ngay khi ép phomat một ngày. Kết quả thu được ở bảng sau. Bảng 6. Thành phần hoá học của phomat sau một ngày ép STT Loại phomat Độ ẩm (%) Độ chua (0T) Protein hoà tan (%) Tính chất cảm quan: màu sắc, hương 1 100% Renin 38.30 80 26.29 Màu trắng, hương thơm của sữa tươi 2 100% protease đông tụ sữa 38.20 80 27.87 Màu trắng, hương thơm của sữa tươi 3 50% Renin 50% protease đông tụ sữa 38.25 79 26.82 Màu trắng, hương thơm của sữa tươi 4 75% Renin 25% protease đông tụ sữa 38.27 79 26.65 Màu trắng, hương thơm của sữa tươi 5 25% Renin 75% protease đông tụ sữa 38.29 78 27.69 Màu trắng, hương thơm của sữa tươi Qua kết quả ở bảng 7 ta nhận thấy mẫu phomat có hàm lượng protein hoà tan thấp nhất là mẫu làm từ 100% renin, trong khi mẫu làm từ 100% protease đông tụ sữa thì có hàm lượng protein cao nhất. Điều này có thể giải thích được rằng mẫu phomat làm từ dịch chiết protease nên chúng có thể lẫn nhiều protease khác vì thế chúng thuỷ phân sâu sắc protein tức phân cắt nhiều vị trí trên chuỗi polypeptit tạo ra nhiều đoạn peptit hơn renin do renin tinh khiết nên chỉ phân cắt một số vị trí nhất định trên chuỗi polypeptit kết quả là tạo ra ít đoạn peptit vì vậy lượng protein hoà tan thấp. Độ chua của các mẫu phomat ở các công thức khác nhau không chênh nhau nhiều bởi các mẫu đều được cấy cùng một lượng vi khuẩn lactic như nhau. Tính chất cảm quan của các loại phomat đều giống nhau, về màu săc đều có màu trắng sữa, mùi thơm ngậy giống như mùi sữa chua. Để đạt được phomat có hương vị đặc trưng và thơm ngon thì sau khi đông tụ phải ngâm chín ở nhiệt độ 7-120C trong vòng 2 tháng. 3.7.2. Thành phần hoá học của phomat sau 1 tháng ngâm chín Sau khi ép đem ngâm chín ở nhiệt độ 100C (trong ngăn dưới của rủ lạnh) sau 1 tháng ta đem đi xác định các chỉ số như độ ẩm, hàm lượng protein hoà tan, độ chua của phomat để dánh giá chất lượng của phomat trong quá trình chín sinh hoá. Bảng 7. Thành phần hoá học của phomat sau 1 tháng ngâm chín STT Loại phomat Độ ẩm (%) Độ chua (0T) Protein hoà tan (%) Tính chất cảm quan: màu, hương 1 100% Renin 36.33 158 26.48 Màu vàng và có hương thơm đặc trưng của phomat 2 100% protease đông tụ sữa 36.26 157 28.73 Màu vàng và có hương thơm đặc trưng của phomat 3 50% Renin 50% protease đông tụ sữa 36.11 156 28.01 Màu vàng và có hương thơm đặc trưng của phomat 4 75% Renin 25% protease đông tụ sữa 36.00 156 28.11 Màu vàng và có hương thơm đặc trưng của phomat 5 25% Renin 75 protease đông tụ sữa 36.07 157 28.73 Màu vàng và có hương thơm đặc trưng của phomat 6 Cheddar (Hà Lan) 37.26 155 25.86 Màu vàng và có hương thơm đặc trưng của phomat Qua kết quả ở bảng trên ta nhận thấy sự biến đổi sinh hoá rõ ràng trong quá trình ngâm chín phomat. Độ ẩm của các mẫu là gần giống nhau bởi chúng được sản xuất và ngâm chín trong cùng một diều kiện, khi so sánh độ ẩm với mẫu phomat Cheddar (Hà Lan) trên thị trường thì nhận thấy phomat chúng tôi có độ ẩm tương tự. Kết quả ở bảng trên cho thấy protein hoà tan có tăng sau khi để ngâm chín 1 tháng, điều đó chứng tỏ rằng protease đông tụ sữa của Aspergillus awamori đã thuỷ phân protein của sữa tạo ra các axit amin và các peptit nhỏ hoà tan. Mẫu được làm từ 100% chế phẩm protease đông tụ sữa có hàm lượng protein cao nhất. Khi so sánh với phomat cùng loại (mẫu 6) ngoài thị trường ta nhận thấy hàm lượng protein hoà tan của mẫu làm từ protease đông tụ sữa có hàm lượng tương đương. Về cảm quan ta thấy, các mẫu đều có màu vàng, hương thơm đặc trưng, cấu trúc bề mặt min và bên trong có lỗ nhỏ. Từ những kết quả trên cho thấy PĐTS từ A. awamori 18 có thể sử dụng thay thế một phần renin để làm tác nhân đông tụ sữa trong sản xuất phomat, cho chất lượng phomat tương đương phomat làm từ 100% renin. 3.7.3 Phân tích protein của phomat bằng phương pháp điện di trên gel Polyacrylamid Theo các nguồn tài liệu của nước ngoài cho thấy protein của sữa chủ yếu là cazein-k có khối lượng phân tử 19 kDa, cazein-a1 : 23 kDa, cazein-a2 25 kDa, b-cazein: 19 kDa. Do vậy chúng tôi tiến hành điện di 3 loại phomat được làm theo tỉ lệ thay thế protease đông tụ sữa khác nhau cùng với bộ (kit) protein chuẩn: 1’-Phosphorylase b 94 kDa 2’-Abumin (Bovinen Serum Abumin) 67 kDa 3’-Ovalbumin 43 kDa 4’-Cacbonic anhydrase 30 kda 5’-Trypsin inhibitor 20.1 kDa 6’-a-Lactabumin 14.4 kDa Cân chính xác 10 mg mẫu hoà tan trong 50ml dung dịch đệm mẫu để ở 400C trong vòng 2 tiếng. Biến tính ở 100 0C trong 2 phút Ly tâm 1000v/p trong 2 phút. Dịch protein chuẩn 3m, mỗi mẫu đổ hai giếng với thể tích 5m và 10m. Hiệu điện thế chạy 120V. Thời gian chạy trong 60 phút. Kết quả được thể hiện ở điện di đồ hình 11 0 1 2 3 Hình 11 : Điện di đồ phổ protein của các mẫu phomat làm từ 100% renin, 100% protease đông tụ sữa và 75% protease đông tụ sữa. 0: mẫu protein chuẩn 1: Phổ protein của mẫu làm bằng 100% renin 2: Phổ protein của mẫu làm bằng 100% protease đông tụ sữa 3: Phổ protein của mẫu làm bằng 75% protease đông tụ sữa Từ điện di đồ ta thấy các vạch đồng đều xuất hiện ở dưới vạch chuẩn 3’ vào khoảng 25-26 kDa trở xuống. Phomat là protein của sữa được đông tụ, sau ngâm chín hai tháng protease đông tụ sữa đã thuỷ phẩn protein tạo thành các peptit và axit amin có trong lượng phân tử nhỏ, xuất hiện tại những vị trí dưới 5’ và 6’. Kết quả trên phù hợp với kết quả phân tích protein hoà tan. Chính nhờ quá trình ngâm chín thuỷ phân protein này có một ý nghĩa rất lớn để tạo hương vị đặc trưng và chất lượng cho phomat. 3.7.4. Xác định các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh và hàm lượng Aflatoxin. Mẫu phomat được làm bằng 100% prtoease đông tụ sữa được chúng tôi xác định các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh và hàm lượng Aflatoxin. Kết quả thu được ở bảng sau: Bảng 8: Chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh và hàm lượng aflatoxin. STT Các chỉ tiêu Kết quả 1 Xác định chỉ số E. coli nhiễm trong mẫu phomat âm tính 2 Hàm lượng aflatoxin M1 nhiễm trong mẫu phomat Không phát hiện được Kết quả trên cho thấy mẫu phomat được làm từ 100% prtoease đông tụ sữa không có vi sinh vật gây bệnh và chỉ số aflatoxin. điều này chứng phomat được làm bằng cách thay thế protease đông tụ sữa từ Aspergillus awamori rất an toàn về chất lượng thực phẩm. Phần IV Kết luận Từ 5 chủng nấm mốc trong bộ sưu tập giống của Phòng Hoá sinh và Sinh học phân tử Trường Đại Học Bách khoa HN đã chọn được chủng nấm mốc Asperguillus awamori 18 có hoạt độ protease đông tụ sữa cao. Tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp PĐTS cao từ A.awamori 18 là: KH2PO4(1g/l); MgSO4.7H2O(0,5g/l); Saccaroza(5g/l); Pepton (5g/l); Cao nấm men(3g/l), pH moi trường ban đầu = 6 Nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa protease đông tụ sữa là 70%(v/v). Đã xác định được một số đặc tính của protease là: Protease đông tụ sữa có pH tối ưu là 6. Độ bền trong vùng pH=4-6. Nhiệt độ tối ưu là 400C. bền trong vùng nhiệt độ là 30-400C Tìm ra quy trình sản xuất ra phomat bằng chế phẩm protease rừ Asperguillus awamori là: Hỗn hợp vi khuẩn men lactic là 0,03‰, để trong 2 giờ. Canxiclorua 0,1%, để trong 40 phút. Chế phẩm protease đông tụ sữa thô 0,3%, để trong 40 phút ép tách nước trong 3 giờ, ngâm chín ở nhiệt độ 4-100C phomat được hình thành từ chế phẩm protease của Asperguillus awamori và renin đều có chất lượng cũng như giá trị cảm quan gần tương tự nhau, không có độc tố và vi sinh vật gây bệnh. Vậy chế phẩm protease axit từ A. awamori 18 có khả năng thay thế rất tốt renin trong công nghệ sản xuất phomat. TàI liệu tham khảo Lê Ngọc Tú (chủ biên) Hoá sinh công nghiệp –Nhà xuất bản KHKT, 1997. Đặng Thị Thu. Nguyễn Thị Xuân Sâm. Tô Kim Anh Giáo trình thí nghiệm hoá sinh công nghiệp-Đại học BKHN, 1998. Đặng Thị Thu. Đỗ Thu Hà. Lê Sỹ Hồng Lam. Lê Ngọc Tú. Lâm Xuân Thanh. Nghiên cứu protease axit từ Aspergillus niger -92 và ứng dụng trong sản xuất phomat. Nguyễn Quỳnh Anh- Luận án phó tiến sĩ. Thu và ứng dụng của pepxin và protease axit Aspergillus niger-70 trong y học và chăn nuôi, 1985. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến. Vi sinh vật học-Nhà xuất bản Giáo dục, 1997. Trần Thị Vân Trinh. Thương phẩm học hàng thực phẩm-Nhà xuất bản thống kê HN, 1991. Trần Thế Truyền, Lâm Xuân Thanh. Thí nghiệm công nghệ chế biến sữa-Đại học Bách khoa Hà NôI, 1982. Amal M. Hashem. Optimization of milk clotting enzym productivity by Penicillium oxalicum. Bioresource technology 70(1999) 203-207. Abdou S, Ghita I, El-Shibiny S. The use of microbial rennets and pepsin in the manufature of domiati cheese. Egyptian J. Daairy Science 4(2) (1976), p.147-154. Baer A. Influence of casein proteolysis by starter bacteria rennet and plasmin on the growth of propionibacteria in Swwis-type cheese Lait V75(4-5)(1995) P, 391-400. Bhowmilk T. Marth EH. Protease and peptidase activity of Micrococcus species. J. Dairy Science 71(9) (1998) P. 2358-2365. Broome MC Hickey MW Proteinase activity of non-starter lactobacillus. Aust. J. Dairy Technology(1991) P.12-18. Byron H. Webb, Arnojd H, Jonhson, jonh A.Alford. Fundamntals of dairy chemistry –Second Edition, 1976. Foltman B. Milk proteins, Acad. Press New York, 1971. Fan-Chiang Yang. I-Hsing Lin Production of acid protease using thin stillage from a rice-spirit distillery by Aspergillus niger. Enzym and microbiol technology,(1998), vol 23 no 6. 11. JeanA. Hansuck and Jordan Tang. Village milk processing. Dairy Tech. Specialist Meat and Dairy Servise. FAO. 1989. H. G. Osman, A. F. Abdel-fattah, M. Abdel-samie and Souhair S. Mabrouk Milk clotting enzyme preparation by Aspegillus niger and effect of various factors on its activity. J. gen. Microbiol, (1969), 59-625-129. Lond Y. Elsevier. Dairy microbiology, the Microbiology of milk. Applied Science. 1990. Mahir Turhan and Mehmet Mutlu. Enzyme and microbiol technology. Biotech. Research. Vol 22. N06. 1998. P 343-346. Nakanishi, Tand Nakazawa. Y. XVII internationnal Dairy Congress. 1974. E. Renner and M.H ABD El. Salam. Application of ultrafiltrtion in the dairy industry, 1994. Picon, Gaya P, Medina M, Nunez M. The effect of liposome-encapsulated Bacillus subtilis neutral protienase on Manchengo cheese ripening. J. Dairy Science 78(6) 1995, P. 1238-1247. Phụ lục Bảng 1: ảnh hưởng của pH lên hoạt độ prtoease đông tụ sữa pH Hoạt độ prtoease đông tụ sữa 4 1.5 4.5 2 5 3.3 5.5 4.5 6 5 6.5 4 7 2.5 Bảng 2: ảnh hưởng của pH đầu lên hoạt độ protease đông tụ sữa pH đầu Hoạt độ protease đông tụ sữa(U/reaction) pH môi trường nuôi 3.5 0.5 4.53 4 1 4.9 5.4 2.5 4.19 5 3.33 3.77 5.5 3.33 5.47 6 5 4.6 6.5 1.25 4.9 7 0.6 4.38 7.5 0.5 4.31 Bảng 3: ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ protease đông tụ sữa Nhiệt độ Hoạt độ protease đông tụ sữa (u/reaction) 30 3.3 35 4 40 5 45 4.5 50 3 55 1 60 0.8 Bảng 4: ảnh hưởng của pH lên tính bền của protease đông tụ sữa Thời gian Hoạt độ ở nhiệt độ pH 4 Hoạt độ ở nhiệt độ pH 6 Hoạt độ ở nhiệt độ pH 7 0 3.33 4.34 4.25 1 3 4 3.33 3 2.89 3.2 2.5 5 2.5 2.4 2 7 2 2 1.25 Bảng 5: Động thái sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Thời gian lấy mẫu Hàm lượng sinh khối (g/100ml) pH môi trường Hoạt đô protease đông tụ 12 0.089 5.5 0 18 0.167 5.32 0 24 0.208 4.8 0 30 0.31 4.78 0 36 0.356 4.7 0.5 42 0.518 4.7 1 48 0.61 4.89 2 54 0.605 5 4 60 0.534 4.67 5 66 0.484 4.68 4.5 72 0.398 4.87 3.8 78 0.382 4.75 2 Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Đặng Thị Thu Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Trường Đại Học Bách Khoa HN. Người đã hướng dẫn nghiên cứu và dìu dắt tôi trong thời gian làm đồ án tốt nghiệp. Nhân dịp này, tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến KS Phùng Thị Thuỷ Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Trường Đại Học Bách Khoa HN đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp trong phần nội dung, cũng như sự giúp đỡ hết sức quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cám ơn cán bộ phòng Hoá sinh và sinh học phân tử Viện Công nghệ Sinh học- Thực phẩm Trường Đại Học Bách Khoa HN đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình làm đề tài. Cuối cùng tôi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt khoá học và thời gian thực hiện đề tài này. Hà Nội ngày tháng năm 2003 Nguyễn Sỹ Lê Thanh Mục lục kết luận 50