Đề tài Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) tối ưu hoá các điều kiện phân tích một số acid amin trong cá

Bé y tÕ ViÖn dinh d−ìng ===== ===== B¸o c¸o nghiÖm thu ®Ò tµi nghiªn cøu cÊp ViÖn Nghiªn cøu øng dông kü thuËt s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) tèi −u ho¸ c¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch mét sè acid amin trong c¸ C¬ së qu¶n lý: CÊp c¬ së Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Th¹c sü Lª ThÞ Hång H¶o N¬i thùc hiÖn: Khoa Hãa - ATVSTP 5750 05/4/2006 Hµ Néi, th¸ng 12 - 2005 I. §Æt vÊn ®Ò Acid amin lµ mét thµnh phÇn quan träng cña c¬ thÓ. Acid amin t¹o nªn tÕ bµo, phôc håi m«, t¹o nªn c¸c kh¸ng thÓ chèng l¹i vi khuÈn vµ virut. Acid amin lµ mét phÇn cña ezim vµ hÖ thèng hocmon. Nã t¹o nªn ARN (acid ribo nucleic), AND (acid deoxi nucleic) vËn chuyÓn oxi ®i kh¾p c¬ thÓ vµ tham gia vµo ho¹t ®éng cña c¸c c¬. Acid amin ®−îc cung cÊp cho c¬ thÓ tõ thùc phÈm dÇu protein. Protein khi vµo c¬ thÓ ®−îc chuyÓn ho¸ thµnh 22 acid amin, trong ®ã cã 8 acid amin thiÕt yÕu kh«ng ®−îc t¹o ra tõ c¬ thÓ, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyllalanine, threonine, tryptophan vµ valine. Sù thiÕu hôt acid amin dÉn ®Õn c¬ thÓ mÖt mái, h¹ ®−êng huyÕt, dÞ øng [9]. Gi¸ trÞ cña mét lo¹i thøc ¨n kh«ng nh÷ng phô thuéc vµo sè l−îng chÊt ®¹m cã trong thøc ¨n Êy mµ cßn phô thuéc vµo sè l−îng vµ tû lÖ c©n ®èi c¸c acid amin, nghÜa lµ chÊt l−îng cña protein thøc ¨n. Ngoµi ra ®èi víi c¸c n−íc ®ang trªn ®µ ph¸t triÓn, thøc ¨n ®éng vËt mµ protein cã chÊt l−îng tèt cßn ch−a ®ñ, th× viÖc ph©n tÝch c¸c acid amin cÇn thiÕt trong thøc ¨n thùc vËt l¹i cµng cÇn thiÕt. Nã gióp ta ph−¬ng h−íng phèi hîp c¸c thøc ¨n víi nhau ®Ó n©ng cao chÊt l−îng cña protein trong khÈu phÇn. V× vËy x¸c ®Þnh c¸c acid amin trong thùc phÈm lµ rÊt cÇn thiÕt. Sù cÇn thiÕt cña protein víi c¬ thÓ ng−êi ®· ®−îc nghiªn cøu hµng thËp kû qua. Nhu cÇu protein vµ acid amin cÇn thiÕt cho c¬ thÓ ®−îc c«ng bè ®Çu tiªn vµo n¨m 1973 vµ liªn tôc ®−îc bæ sung vµo n¨m 1975 vµ sau ®ã lµ 1977 bëi FAO (Tæ chøc l−¬ng thùc vµ thùc phÈm thÕ giíi), WHO (Tæ chøc Y tÕ thÕ giíi) vµ NRC (Héi ®ång nghiªn cøu quèc tÕ) [5]. §Ó liªn tôc cã ®−îc c¸c c«ng bè vÒ nhu cÇu protein vµ acid amin cho c¬ thÓ tõ l©u trªn thÕ giíi ®· ¸p dông nhiÒu ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch hµm l−îng protein vµ acid amin trong thùc phÈm nh−: s¾c ký giÊy, s¾c ký láng, s¾c ký khÝ, ®Þnh l−îng vi sinh, quy tr×nh ngµy cµng hoµn thiÖn vµ ®−îc ¸p dông nhiÒu kü thuËt míi. 1 II. Môc tiªu nghiªn cøu 2.1. T×m c¸c ®iÒu kiÖn tèi −u ®Ó ph©n tÝch acid amin trong c¸ b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng cao ¸p. 2.2. ¸p dông vµ æn ®Þnh ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch mét sè acid amin trªn 5 lo¹i c¸ n−íc biÓn vµ 5 lo¹i c¸ n−íc ngät th«ng dông trªn thÞ tr−êng phôc vô cho kh¶o s¸t nguån thùc phÈm dÇu acid amin, ®Æc biÖt trong c¸ cña ViÖt Nam. III. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 3.1. Ho¸ chÊt thuèc thö TÊt c¶ c¸c lo¹i ho¸ chÊt sö dông ®Òu thuéc lo¹i ho¸ chÊt tinh khiÕt ph©n tÝch. Acetonitril, natri borat, acid clohydric cña h·ng Merk (§øc), chÊt dÉn suÊt 6-aminoquinoline, hçn hîp chuÈn 17 acid amin cña h·ng Waters (Mü), chÊt chuÈn ®¬n tõng acid amin cña h·ng Prolabo (Ph¸p). 3.2. HÖ thèng s¾c ký láng HÖ thèng s¾c ký láng ®−îc sö dông trong nghiªn cøu cña chóng t«i lµ hÖ thèng acid amin víi c¸c detector PAD 2996, huúnh quang 2475 vµ bé b¬m mÉu tù ®éng cña h·ng Water (Mü). Cét s¾c ký sö dông lµ Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5µm) vµ cét Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5µm) cña h·ng Water. Thµnh phÇn pha ®éng gåm ®Öm borat, acetonitril, n−íc cÊt tinh khiÕt ch¹y theo gradie. Tèc ®é dßng lµ 1ml/phót vµ nhiÖt ®é cét lµ 35oC. C¸c acid amin ®−îc ®Þnh l−îng b»ng detector huúnh quang víi b−íc sãng kÝch thÝch 340nm vµ b−íc sãng ph¸t x¹ 450nm. 3.3. ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn ChuÈn hçn hîp (17 acid amin) ®−îc pha tõ dung dÞch cã chøa 2,5 mmol/µl cho tÊt c¶ c¸c amino acid vµ 1,25 mmol/µl ®èi víi cystine trong HCl 20 mmol ®Ó ®−îc dung dÞch chuÈn lµm viÖc cã chøa 100pmol/µl ®èi víi 17 acid amin vµ 50 pmol/µl ®èi víi cystein. Dung dÞch chuÈn lµm viÖc ®−îc b¶o qu¶n trong lä mµu sÉm b¶o qu¶n b»ng tñ l¹nh ©m s©u -200C dïng ®−îc trong vßng 1 th¸ng. C¸c chuÈn ®¬n ®−îc hoµ tan trong n−íc vµ b¶o qu¶n trong m«i tr−êng acid víi c¸c ®iÒu kiÖn t−¬ng tù nh− chuÈn hçn hîp. 3.4. ChuÈn bÞ mÉu c¸ 2 MÉu nghiªn cøu gåm 10 lo¹i c¸ ®¹i diÖn cho 50 mÉu c¸: 5 lo¹i c¸ n−íc ngät (tr¾m, tr«i, c¸ qu¶, rofi, chÐp); 5 lo¹i c¸ n−íc mÆn (thu, nôc, c¸ chim tr¾ng, c¸ hång, c¸ cam). MÉu ®−îc lÊy ngÉu nhiªn b»ng c¸ch mua t¹i 5 chî lín t¹i Hµ Néi, mçi mÉu mua Ýt nhÊt 3 con, ®−a vÒ phßng thÝ nghiÖm trong thêi gian kh«ng qu¸ hai giê. ë phßng thÝ nghiÖm mÉu ®−îc ph©n lo¹i, läc lÊy phÇn ¨n ®−îc (lo¹i bá phñ t¹ng, vÈy, v©y, x−¬ng), sau ®ã mÉu ®−îc xay nhiÔn, lµm ®ång nhÊt vµ tiÕn hµnh thuû ph©n ngay trong ngµy lÊy mÉu, phÇn mÉu l−u cho vµo hép s¹ch b¶o qu¶n trong tñ l¹nh ©m s©u -20oC. 3.5. Thuû ph©n mÉu Theo mét sè t¸c gi¶ [3, 4, 7] ph−¬ng ph¸p chñ yÕu dïng ®Ó thuû ph©n t¸ch c¸c acid min ra khái thùc phÈm lµ thuû ph©n trong m«i tr−êng acid clohydric cã nång ®é cao. Quy tr×nh thuû ph©n vµ ph©n tÝch mÉu nh− sau: Lo¹i kh«ng khÝ b»ng nit¬, hµn kÝn èng T¹o dÉn suÊt X¸c ®Þnh b»ng s¾c ký láng pha ng−îc, Detector huúnh quang vµ PDA §Þnh møc b»ng HCl 20 mmol §Ó nguéi, ®uæi HCl d− trong m«i tr−êng ch©n kh«ng ñ ë nhiÖt ®é thÝch hîp 125oC Cho vµo èng nghiÖm thµnh dµy + HCL 15% C©n chÝnh x¸c 1g mÉu ®· xö lý 3 IV. KÕt qu¶ vµ bµn luËn 4.1. Kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch 4.1.1. Kh¶o s¸t c¸c lo¹i dÉn suÊt acid amin §Ó x¸c ®Þnh ®−îc mét sè acid amin trong thùc phÈm dùa trªn nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm s½n cã cña phßng thÝ nghiÖm ViÖn Dinh d−ìng, chóng t«i ®· tiÕn hµnh dÉn suÊt c¸c acid amin chuÈn b»ng OPA (ortho-phtalaldehyt) [h×nh 1] vµ dÉn suÊt b»ng AMQ (6-aminoquinolin) [h×nh 2], qua kh¶o s¸t chóng t«i thÊy dÉn suÊt b»ng OPA chØ t¸ch ®−îc 15 acid amin, cßn dÉn suÊt b»ng AMQ t¸ch ®−îc 17 acid amin vµ NH3 víi ®é æn ®Þnh cao, nªn trong nghiªn cøu chóng t«i chØ tiÕn hµnh dÉn suÊt b»ng AMQ. H×nh 1: T¸ch 15 acid amin b»ng dÉn suÊt OPA H×nh 2: T¸ch 17 acid amin b»ng dÉn suÊt AMQ 4.1.2. Kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn trªn s¾c ký láng §Ó thùc hiÖn mét trong nh÷ng nhiÖm vô quan träng nhÊt cña ®Ò tµi lµ t¸ch vµ x¸c ®Þnh ®−îc acid amin, kü thuËt ®−îc lùa chän lµ HPLC. Kü thuËt 4 nµy ®ang lµ nh÷ng kü thuËt ®−îc ph¸t triÓn nhÊt hiÖn nay trªn thÕ giíi cã hiÖu qu¶ t¸ch cao, ®é chÝnh x¸c cao còng nh− cã thÓ tù ®éng ho¸ ®−îc trong tr−êng hîp ph©n tÝch hµng lo¹t. Trong kü thuËt HPLC ba vÊn ®Ò lín cÇn tèi −u ho¸ lµ: • Chän cét t¸ch: sö dông cét pha ng−îc. Cét s¾c ký sö dông lµ Symmetry acid amin RP18 (150mm x 4,6mm x 3,5µm) vµ cét Symmetry Shield RP18 (150mm x 4,6mm x 5µm) cña h·ng Water. Qua kÕt qu¶ ch¹y thö mÉu chuÈn cho thÊy pic ch¹y ra víi cét Symmetry Shield RP18 kh«ng t¸ch ®−îc c¸c acid amin nªn chóng t«i chän cét Symmetry acid amin RP18 ®Ó tiÕn hµnh ph©n tÝch mÉu. • Nghiªn cøu tèi −u ho¸ pha ®éng. Sau khi ®· tham kh¶o c¸c tµi liÖu vµ ch¹y thö, pha ®éng chóng t«i lùa chän lµ ®Öm borat, acetonitril, n−íc víi tØ lÖ ch¹y theo b¶ng gradien nh− sau: B¶ng 1: Tû lÖ thµnh phÇn pha ®éng Thêi gian (Phót) Tèc ®é dßng (ml/phót) % Borat % Acetonitril % H2O NÒn 1,0 100 0 0 0,5 1,0 99 1 0 18,0 1,0 95 5 0 19,0 1,0 91 9 0 29,5 1,0 83 17 0 33,0 1,0 0 60 40 36,0 1,0 100 0 0 65,0 1,0 0 60 40 100,0 1,0 0 60 40 • Detector: Sö dông detector PDA vµ huúnh quang lµ hai lo¹i detector phæ biÕn, cã ®é nh¹y cao. Qua kh¶o s¸t ®é ph¸t hiÖn cña c¸c acid amin b»ng detecto huúnh quang nh¹y h¬n nhiÒu so víi detector PAD, nªn chóng t«i chän sö dông detector PAD ®Ó ®Þnh tÝnh (kiÓm tra l¹i tõng d¹ng phæ cña tõng pic acid amin ®¬n lÎ) cßn ®Ó ®Þnh l−îng chóng t«i sö dông detector huúnh quang víi b−íc sãng kÝch thÝch 340nm vµ b−íc sãng ph¸t x¹ 450nm. 4.1.3. C¸c ®iÒu kiÖn thuû ph©n mÉu §Ó thuû ph©n c¸c s¶n phÈm chøa acid amin cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p, tuú theo ®Æc tÝnh cña tõng mÉu thö, tuú theo môc ®Ých ®Þnh tÝnh hay ®Þnh l−îng. 5 + Thuû ph©n b»ng acid + Thuû ph©n b»ng kiÒm + Thuû ph©n b»ng acid m¹nh cã mÆt chÊt trao ®æi ion + Thuû ph©n b»ng men. Trong ®Ò tµi nghiªn cøu nµy, cña chóng t«i sö dông ph−¬ng ph¸p thuû ph©n b»ng acid. Trong qu¸ tr×nh thuû ph©n, yÕu tè ¶nh h−ëng nhiÒu nhÊt ®Õn kÕt qu¶ cña mÉu ph©n tÝch lµ nhiÖt ®é thuû ph©n vµ thêi gian thuû ph©n. * Kh¶o s¸t nhiÖt ®é ¶nh h−ëng ®Õn qu¸ tr×nh thuû ph©n: + ChuÈn bÞ dung dÞch ®Ó kh¶o s¸t: ChuÈn bÞ mét hçn hîp chuÈn c¸c acid amin (gåm 17 lo¹i acid amin) bao gåm b¶y dung dÞch chuÈn cã cïng nång ®é; víi nÒn lµ mét lo¹i c¸: 7 mÉu c¸ kh«ng thªm chuÈn vµ 7 mÉu c¸ thªm chuÈn. + TiÕn hµnh kh¶o s¸t: §Ó kh¶o s¸t nhiÖt ®é ®Õn kh¶ n¨ng thuû ph©n acid amin chóng t«i kh¶o s¸t trªn mét d·y mÉu víi nång ®é hçn hîp chuÈn acid amin vµ mÉu c¸ ®−îc thªm chuÈn nh− nhau, m«i tr−êng HCl 6N, nh−ng nhiÖt ®é thuû ph©n kh¸c nhau (110, 115, 120, 125, 130, 135, 140oC) sau mçi ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é kh¸c nhau mÉu ®−îc ®em ®o. Theo kh¶o s¸t cña chóng t«i, nhiÖt ®é cã ¶nh h−ëng râ rÖt ®Õn qu¸ tr×nh thuû ph©n mÉu. Kh«ng chØ ¶nh h−ëng ®Õn hiÖu suÊt thu håi (KÕt qu¶ kh¶o s¸t yÕu tè nµy ®−îc tr×nh bÇy ë b¶ng 2). Víi ®iÒu kiÖn nhiÖt ®é ch−a ®ñ ®Ó ph¸ vì c¸c chuçi peptit th× chóng ta cßn kh«ng thÓ t¸ch ®−îc riªng biÖt tõng acid amin (vÝ dô h×nh 3). H×nh 3: ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é thuû ph©n ®Õn t¸ch c¸c acid amin 6 B¶ng 2: ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é ®Õn hiÖu suÊt thuû ph©n cña acid amin (Lysine) trong c¸ C¸c ®iÒu kiÖn 1 2 3 4 5 6 7 NhiÖt ®é (oC) 110 115 120 125 130 135 140 Hµm l−îng biÕt tr−íc (µg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 Hµm l−îng tÝnh ®−îc (µg/ml) 4,0946 4,532 5,3170 5,3008 5,2799 5,2997 5,3093 HiÖu suÊt 76,58 84,76 99,45 99,14 98,75 99,12 99,32 KÕt qu¶ b¶ng 2 cho thÊy nhiÖt ®é tõ 120OC hiÖu suÊt ph¶n øng ®· ®¹t ®−îc lµ cao nhÊt. Nªn chóng t«i chän 125OC ®Ó lµm nhiÖt ®é thuû ph©n mÉu. * Kh¶o s¸t thêi gian ¶nh h−ëng ®Õn qu¸ tr×nh thuû ph©n: §Ó kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña thêi gian ®Õn kh¶ n¨ng thuû ph©n acid amin, chóng t«i kh¶o s¸t trªn mét d·y chuÈn acid amin vµ mÉu c¸ ®−îc thªm chuÈn nh− nhau, m«i tr−êng HCl 6N, nhiÖt ®é thuû ph©n nh− nhau 125oC, nh−ng thêi gian thuû ph©n kh¸c nhau (16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 giê). KÕt qu¶ kh¶o s¸t chØ ra ë b¶ng 3. B¶ng 3: ¶nh h−ëng cña thêi gian thuû ph©n ®Õn hiÖu suÊt thuû ph©n cña acid amin (Lysine) trong c¸. 7 C¸c ®iÒu kiÖn 1 2 3 4 5 6 7 Thêi gian (giê) 16 18 20 22 24 26 28 Hµm l−îng biÕt tr−íc (µg/ml) 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 5,3468 Hµm l−îng tÝnh ®−îc (µg/ml) 5,859 4,365 4,685 5,312 5,3083 5,3152 5,2938 HiÖu suÊt 109,58 81,64 87,63 99,35 99,28 99,41 99,01 KÕt qu¶ b¶ng 3 cho thÊy thêi gian thuû ph©n 22 giê trë lªn hiÖu suÊt ph¶n øng thu ®−îc lµ tèt nhÊt. Chóng t«i ®· chän 24 giê ®Ó tiÕn hµnh thuû ph©n mÉu. Khi thêi gian thuû ph©n ch−a ®ñ, c¸c acid amin trong mÉu còng kh«ng t¸ch ®−îc ra khái nhau (vÝ dô h×nh 4). H×nh 4: ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é thuû ph©n ®Õn t¸ch c¸c acid amin 4.2. §¸nh gi¸ ph−¬ng ph¸p 4.2.1. X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh §Ó tiÕn hµnh x¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh cña ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch, chóng t«i pha mét d·y chuÈn cã nång ®é tõ 0,1 ®Õn 100(µg/ml) cho 17 acid amin, tõ 0,05 ®Õn 50(µg/ml) ®èi cystine vµ tiÕn hµnh ®o cho tÊt c¶ c¸c acid amin. KÕt qu¶ cho thÊy ®å thÞ tuyÕn tÝnh trong kho¶ng 0,5 ®Õn 100 (µg/ml) cho 17 acid amin, cßn 0,1 ®Õn 50(µg/ml) ®èi cystine víi hÖ sè t−¬ng quan ®¹t ®−îc tõ 0,997 ®Õn 0,9998 cho tÊt c¶ c¸c acid amin. 4.2.2. §é lÆp l¹i cña ph−¬ng ph¸p 8 §Ó kh¶o s¸t ®é lÆp l¹i cña ph−¬ng ph¸p, chóng t«i tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm trªn 2 lo¹i c¸. Mçi lo¹i c¸ tiÕn hµnh ph©n tÝch trªn 6 mÉu. 1 )( 1 2 2 − − = ∑ = n mtbmi S n i §é lÖch chuÈn ®−îc tÝnh theo c«ng thøc sau: §é lÖch chuÈn t−¬ng ®èi ®−îc tÝnh theo c«ng thøc sau: RSD = s*100/XTB 9 B¶ng 4: KÕt qu¶ vÒ ®é lÆp l¹i hµm l−îng trong mÉu c¸ qu¶ C¸c th«ng sè 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD C¸c acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 0,721 0,693 0,724 0,695 0,737 0,742 6 0,719 0,021 2,878 Serine 0,795 0,774 0,786 0,772 0,783 0,799 6 0,785 0,011 1,387 Glutamic acid 1,234 1,425 1,243 1,229 1,354 1,343 6 1,305 0,081 6,219 Glycine 1,860 1,778 1,693 1,689 1,723 1,892 6 1,772 0,087 4,892 Histidine 0,656 0,697 0,621 0,637 0,656 0,672 6 0,657 0,027 4,042 NH3 0,865 0,835 0,856 0,821 0,862 0,821 6 0,843 0,020 2,398 Arginine 1,870 1,875 1,912 1,923 1,869 1,924 6 1,896 0,027 1,418 Threonine 0,873 0,829 0,859 0,875 0,864 0,862 6 0,860 0,017 1,928 Alanine 0,628 0,597 0,625 0,598 0,635 0,673 6 0,626 0,028 4,473 Proline 0,734 0,742 0,753 0,768 0,759 0,762 6 0,753 0,013 1,705 Cysteine 0,239 0,251 0,245 0,249 0,251 0,246 6 0,247 0,005 1,855 Tyrosine 0,939 0,927 0,896 0,917 0,879 0,953 6 0,919 0,027 2,982 Valine 0,453 0,397 0,512 0,437 0,456 0,473 6 0,455 0,038 8,384 Methionine 0,672 0,712 0,689 0,702 0,705 0,691 6 0,695 0,014 2,053 Lysine 0,298 0,321 0,297 0,352 0,319 0,327 6 0,319 0,020 6,375 Isoleucine 0,421 0,398 0,425 0,396 0,431 0,433 6 0,417 0,016 3,913 Leucine 0,842 0,839 0,843 0,851 0,799 0,798 6 0,829 0,024 2,860 Phenylalanine 1,256 1,227 1,123 1,214 1,125 1,121 6 1,178 0,061 5,216 B¶ng 5: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i thêi gian l−u trong mÉu c¸ qu¶ C¸c th«ng sè 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD C¸c acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 13,819 13,691 13,634 13,747 13,661 13,652 6 13,70 0,070 0,510 Serine 15,336 15,144 15,109 15,262 15,12 15,123 6 15,18 0,094 0,621 Glutamic acid 16,177 16,356 15,931 16,111 15,935 15,942 6 16,07 0,173 1,078 Glycine 17,470 17,219 17,199 17,395 17,194 17,221 6 17,28 0,121 0,700 Histidine 18,119 17,837 17,800 18,020 18,294 17,821 6 17,98 0,199 1,107 NH3 19,821 19,571 19,521 19,709 19,533 19,553 6 19,62 0,120 0,613 Arginine 21,184 21,09 21,08 21,153 21,085 21,092 6 21,11 0,044 0,209 Threonine 21,395 21,312 21,314 21,387 21,308 21,311 6 21,34 0,041 0,194 Alanine 22,022 21,932 21,923 21,982 21,928 21,931 6 21,95 0,040 0,182 Proline 23,346 23,253 23,229 23,275 23,250 23,263 6 23,27 0,041 0,175 Cysteine 26,467 26,634 26,600 26,467 26,647 26,652 6 26,58 0,088 0,330 Tyrosine 26,743 27,117 27,087 26,632 27,132 27,133 6 26,97 0,225 0,836 Valine 27,916 27,891 27,783 27,816 27,816 27,822 6 27,84 0,051 0,184 Methionine 28,466 28,351 28,333 28,366 28,368 28,372 6 28,38 0,046 0,164 Lysine 31,124 30,999 30,991 31,024 31,018 31,023 6 31,03 0,048 0,155 Isoleucine 31,951 31,82 31,818 31,854 31,842 31,845 6 31,86 0,049 0,154 Leucine 32,561 32,416 32,414 32,454 32,439 32,450 6 32,45 0,054 0,168 Phenylalanine 34,026 33,845 33,836 33,886 33,872 33,891 6 33,89 0,069 0,203 10 B¶ng 6: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i hµm l−îng ®èi víi mÉu c¸ thu C¸c th«ng sè 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD C¸c acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 0,926 0,918 0,897 0,889 0,918 0,931 6 0,913 0,017 1,816 Serine 0,865 0,859 0,837 0,871 0,902 0,856 6 0,865 0,021 2,483 Glutamic acid 1,652 1,598 1,701 1,689 1,634 1,657 6 1,655 0,037 2,257 Glycine 1,298 1,386 1,357 1,403 1,387 1,279 6 1,352 0,051 3,809 Histidine 1,125 0,987 1,131 0,989 0,984 1,024 6 1,040 0,070 6,704 NH3 0,122 0,109 0,123 0,115 0,128 0,132 6 0,122 0,008 6,920 Arginine 1,787 1,902 1,783 1,856 1,798 1,905 6 1,839 0,057 3,090 Threonine 1,105 1,231 1,304 1,098 1,159 1,236 6 1,189 0,082 6,878 Alanine 0,762 0,756 0,802 0,812 0,789 0,745 6 0,778 0,027 3,489 Proline 0,598 0,612 0,631 0,597 0,689 0,587 6 0,619 0,038 6,063 Cysteine 2,639 2,574 2,702 2,564 2,316 2,655 6 2,575 0,137 5,320 Tyrosine 0,112 0,131 0,135 0,132 0,121 0,121 6 0,125 0,009 7,004 Valine 0,658 0,678 0,598 0,654 0,702 0,579 6 0,645 0,047 7,324 Methionine 0,823 0,798 0,857 0,779 0,802 0,812 6 0,812 0,027 3,273 Lysine 0,546 0,498 0,578 0,581 0,605 0,535 6 0,557 0,038 6,908 Isoleucine 0,623 0,587 0,621 0,606 0,613 0,600 6 0,608 0,014 2,239 Leucine 1,116 1,206 1,215 1,033 1,234 1,158 6 1,160 0,076 6,528 Phenylalanine 1,322 1,302 1,401 1,189 1,298 1,325 6 1,306 0,068 5,239 B¶ng 7: KÕt qu¶ ®é lÆp l¹i thêi gian l−u ®èi víi mÉu c¸ thu C¸c th«ng sè 1 2 3 4 5 6 N xTB S RSD C¸c acid amin % % % % % % % (%) Aspartic acid 13,717 13,626 13,793 13,76 13,768 13,692 6 13,73 0,061 0,445 Serine 15,184 15,089 15,275 15,212 15,241 15,345 6 15,22 0,087 0,569 Glutamic acid 16,012 15,902 16,116 16,074 16,076 15,937 6 16,02 0,085 0,531 Glycine 17,280 17,171 17,385 17,324 17,346 17,202 6 17,28 0,288 1,796 Histidine 17,904 17,79 18,026 17,954 17,979 17,820 6 17,91 0,732 4,448 NH3 19,622 19,52 19,73 19,682 19,688 19,554 6 19,63 0,622 3,446 Arginine 21,113 21,066 21,156 21,135 21,149 21,087 6 21,12 0,102 0,515 Threonine 21,336 21,288 21,379 21,348 21,368 21,311 6 21,34 0,263 1,344 Alanine 21,955 21,907 22,001 21,975 21,988 21,933 6 21,96 0,549 2,732 Proline 23,277 23,225 23,327 23,299 23,306 23,258 6 23,28 1,289 6,058 Cysteine 26,671 26,608 26,467 26,435 26,705 26,651 6 26,59 0,090 0,386 Tyrosine 27,156 27,094 26,735 26,706 27,191 27,134 6 27,00 0,374 1,598 Valine 27,849 27,78 27,914 27,883 27,882 27,821 6 27,85 0,243 0,943 Methionine 28,398 28,331 28,466 28,433 28,431 28,371 6 28,41 1,321 5,085 Lysine 31,05 30,98 31,129 31,633 31,089 31,021 6 31,15 0,362 1,175 Isoleucine 31,873 31,805 31,954 31,931 31,913 31,845 6 31,89 0,259 0,876 Leucine 32,475 32,401 32,563 32,500 32,519 32,445 6 32,48 0,481 1,615 Phenylalanine 33,920 33,828 34,025 33,650 33,970 33,842 6 33,87 0,847 0,257 11 4.2.3. X¸c ®Þnh ®é thu håi cña ph−¬ng ph¸p Dùa vµo viÖc thªm mÉu chuÈn vµo mÉu thùc, cïng víi viÖc tiÕn hµnh lµm mÉu thùc kh«ng cã mÉu chuÈn song song chóng t«i tiÕn hµnh tÝnh ®é thu håi nh− sau. M2 §é thu håi = ----------- x 100% M1 M1: acid amin (µg) biÕt tr−íc (thªm vµo). M2: acid amin (µg) x¸c ®Þnh ®−îc. Dùa vµo ®−êng chuÈn lµm song song víi mÉu thùc chóng t«i thu ®−îc kÕt qu¶ cña mÉu thªm chuÈn vµ ®em so víi gi¸ trÞ cho vµo, mçi nång ®é lµm 3 mÉu vµ lÊy kÕt qu¶ trung b×nh. Ta cã kÕt qu¶ ë b¶ng 8. B¶ng 8: §é thu håi cña Lysine trong mÉu c¸ qu¶ MÉu sè 1 2 3 4 5 6 7 M1 ((µg) 0,2035 0,407 0,168 0,337 1,687 2,361 3,036 M2 (µg) 0,2084 0,4121 0,1695 0,3396 1,6953 2,3752 3,0574 §é thu håi (%) 97,63 98,76 99,12 99,23 99,51 99,4 99,3 Qua kÕt qu¶ trªn víi hµm l−îng Lysinee < 0,407mg/ml chóng t«i thu ®−îc hiÖu suÊt thu håi thÊp. Do ®ã cã thÓ kÕt luËn, ph−¬ng ph¸p nµy cho phÐp x¸c ®Þnh hµm l−îng Lysinee tõ 0,5(µg) trë lªn. Nªn khi tiÕn hµnh ph©n tÝch nªn lÊy l−îng mÉu sao cho hµm l−îng acid amin lín h¬n 0,5(µg) ®Ó cã sai sè thÊp. 4.3. KÕt qu¶ ph©n tÝch 18 acid amin trªn c¸c lo¹i c¸ B¶ng 9 vµ b¶ng 10 thÓ hiÖn hµm l−îng trung b×nh c¸c acid amin trong mÉu c¸ n−íc ngät vµ c¸ n−íc mÆn n=5. H×nh 5: S¾c ®å c¸c acid amin trong mÉu c¸ qu¶ 12 B¶ng 9: KÕt qu¶ ph©n tÝch acid amin trong c¸ n−íc ngät (g/100g) TT Tªn ®Çy ®ñ ViÕt t¾t C¸ tr«i C¸ tr¾m C¸ qu¶ C¸ rofi C¸ chÐp 1 Aspartic acid ASP 0,00 0,28 0,72 1,05 0,75 2 Serine Ser 0,00 0,34 0,79 1,00 0,57 3 Glutamic acid Glu 0,38 0,52 1,30 1,85 1,30 4 Glycine Gly 0,00 0,58 1,77 1,83 1,07 5 Histidine His 0,24 0,36 0,66 0,86 0,52 6 NH3 NH3 0,07 0,04 0,84 0,12 0,10 7 Arginine Arg 1,31 0,83 1,90 2,09 1,20 8 Threonine Thr 0,70 0,43 0,86 1,12 0,66 9 Alanine Ala 0,26 0,25 0,63 0,84 0.59 10 Proline Pro 1,03 0,23 0,75 0,75 0,51 11 Cysteine Cys 1,69 0,00 0,25 2,50 1,40 12 Tyrosine Tyr 0,08 0,46 0,92 0,11 0,05 13 Valine Val 0,30 0,22 0,45 0,68 0,46 14 Methionine Met 0,44 0,29 0,70 0,83 0,50 15 Lysine Lys 0,11 0,16 0,32 0,58 0,52 16 Isoleucine lle 0,25 0,20 0,42 0,62 0,40 17 Leucine Leu 0,49 0,39 0,83 1,27 0,81 18 Phenylalanine Phe 0,84 0,52 1,18 1,42 0,77 Tæng 8,20 6,12 14,61 19,52 12,18 KÕt qu¶ t¹i B¶ng 9 cho thÊy, trong thµnh phÇn cña c¸ cã ®ñ c¸c acid amin cÇn thiÕt cho c¬ thÓ. Trong 5 lo¹i c¸ n−íc ngät c¸ R«fi cho thÊy cã tæng hµm l−îng c¸c acid amin cao nhÊt 19,52 g%, thÊp nhÊt lµ c¸ tr¾m 6,12 g%. Trong c¸ tr«i acid aspartic, Serine, Glycine, hµm l−îng qu¸ nhá kh«ng x¸c ®Þnh ®−îc. H×nh 6: S¾c ®å c¸c acid amin trong mÉu c¸ thu 13 B¶ng 10: KÕt qu¶ ph©n tÝch acid amin trong c¸ n−íc mÆn (g/100g) TT Tªn ®Çy ®ñ ViÕt t¾t C¸ thu C¸ nôc C¸ chim tr¾ng C¸ hång C¸ cam 1 Aspartic acid ASP 0,91 1,00 0,77 0,97 0,81 2 Serine Ser 0,87 0,94 0,75 0,82 0,76 3 Glutamic acid Glu 1,66 1,71 1,40 1,67 1,35 4 Glycine Gly 1,35 1,40 1,40 1,08 1,36 5 Histidine His 1,04 2,18 0,65 0,05 1,05 6 NH3 NH3 0,12 0,13 0,09 0,12 0,11 7 Arginine Arg 1,84 1,99 1,72 1,62 1,63 8 Threonine Thr 1,19 1,14 0,88 0,89 0,90 9 Alanine Ala 0,78 0,78 0,65 0,68 0,68 10 Proline Pro 0,62 0,63 0,57 0,53 0,60 11 Cysteine Cys 2,58 3,03 0,17 2,22 2,19 12 Tyrosine Tyr 0,13 0,12 0,87 0,09 0,11 13 Valine Val 0,64 0,76 0,51 0,60 0,57 14 Methionine Met 0,81 0,92 0,62 0,70 0,72 15 Lysine Lys 0,56 0,54 0,44 0,60 0,46 16 Isoleucine Lle 0,61 0,66 0,46 0,54 0,50 17 Leucine Leu 1,16 1,27 0,94 1,10 0,99 18 Phenylalanine Phe 1,31 1,52 1,04 1,10 1,11 Tæng 18,20 20,74 13,94 15,40 15,89 KÕt qu¶ t¹i B¶ng 10 cho thÊy, hµm l−îng tæng c¸c acid amin trong c¸ 14 n−íc mÆn n»m trong kho¶ng 13-21g%, kh«ng cã lo¹i acid amin nµo kh«ng x¸c ®Þnh thÊy. Trong 5 lo¹i c¸ n−íc mÆn ®−îc nghiªn cøu, c¸ nôc cho hµm l−îng amino acid cao nhÊt 20,74 g%, sau ®ã lµ c¸ thu 18,20 g%, thÊp nhÊt lµ c¸ chim tr¾ng 13,94 g%. So s¸nh b¶ng 2 víi b¶ng 1 cho thÊy hµm l−îng amino acid trong c¸ n−íc mÆn cao h¬n trong c¸ n−íc ngät. 15 V. KÕt luËn 5.1. KÕt qu¶ nghiªn cøu ®· lùa chän ®−îc c¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch phï hîp ®Ó ®Þnh l−îng c¸c acid amin trong c¸ nh− sau: • Quy tr×nh thuû ph©n sö dông ph−¬ng ph¸p thuû ph©n trong m«i tr−êng acid. • Ch¹y gradien víi hçn hîp dung m«i lµ ®Öm borat:acetonitril:n−íc. • Tèc ®é dßng: 1ml/phót; nhiÖt ®é buång cét 35OC. • Detector huúnh quang víi b−íc sãng kÝch thÝch 340nm vµ b−íc sãng ph¸t x¹ 450nm. 5.2. Hµm l−îng c¸c acid amin trong c¸ Qua kÕt qu¶ ph©n tÝch acid amin trong 10 lo¹i c¸ (5 lo¹i n−íc ngät, 5 lo¹i n−íc mÆn) cho thÊy: Trong c¸ n−íc ngät hµm l−îng tæng acid amin tõ 6,12- 19,52 g/100g, c¸ R«fi cã tæng hµm l−îng c¸c acid amin cao nhÊt (19,52 g%), thÊp nhÊt lµ c¸ tr«i 8,2 g%. Hµm l−îng tæng c¸c acid amin trong c¸ n−íc mÆn n»m trong kho¶ng 13- 21g%, kh«ng cã lo¹i acid amin nµo kh«ng x¸c ®Þnh thÊy. C¸ nôc cho hµm l−îng acid amin cao nhÊt 20,74 g%, sau ®ã lµ c¸ thu 18,20 g%, thÊp nhÊt lµ c¸ chim tr¾ng 13,94 g%. Nh×n chung hµm l−îng acid amin trong c¸ n−íc mÆn cao h¬n trong c¸ n−íc ngät. Nh− vËy ¨n c¸ lµ rÊt tèt cho c¬ thÓ, kh«ng chØ lµ mét nguån thùc phÈm cung cÊp hµm l−îng protein cao mµ chÊt l−îng cña protit trong thÞt c¸ lµ rÊt tèt. §Æc biÖt hµm l−îng cholesterol trong c¸ lµ kh«ng ®¸ng kÓ, mì c¸ gióp ng¨n ngõa ®−îc rÊt nhiÒu bÖnh tËt. VI. khuyÕn nghÞ Nh»m n©ng cao chÊt l−îng dinh d−ìng cña cuéc sèng gãp phÇn ®¶m b¶o søc khoÎ ng−êi tiªu dïng chóng t«i cã mét vµi kiÕn nghÞ sau: • TiÕp tôc ph©n tÝch x¸c ®Þnh hµm l−îng c¸c acid amin trong c¸c ®èi t−îng thùc phÈm kh¸c ®Ó cung cÊp sè liÖu hoµn thiÖn B¶ng thµnh phÇn ViÖt Nam. • Gióp tuyªn truyÒn c¸c lo¹i thùc phÈm chÊt l−îng cho ng−êi tiªu dïng. Khoa Ho¸ - ATVSTP TS. Hµ ThÞ Anh §µo Hµ néi, ngµy 26 th¸ng 12 n¨m 2005 Chñ nhiÖm ®Ò tµi Lª ThÞ Hång H¶o 16 Tµi liÖu tham kh¶o 1. Gi¸o tr×nh Sinh ho¸ - §¹i häc y Hµ Néi (1990) tr. 294-303. 2. Ph¹m V¨n Sæ, Bïi ThÞ Nh− ThuËn (1978) KiÓm nghiÖm L−¬ng thùc Thùc phÈm, Nhµ suÊt b¶n Khoa Häc vµ Kü ThuËt - Hµ Néi. 3. AOAC. Sixteenth edition,3rd revision, (1997). 4. Dany Heems, Genevieve Luck, Christophe Fraudeau, Eric Verette (1998), Fully automated precolumn derivatization, on-line dialysis and high-performance liquid chromatographic analysis of acid amins in food, beverages and feedstuff, Journal of Chromatography A, 798, p. 9-17. 5. H. L. A. Tarr, (1958), Biochemistry of Fishes, Ann. Rev. Biochem., 27: 223-244 . 6. I. Molnar-Per (2000) Role of chromatography in the analysis of sugars, carboxylic acids and acid amins in food, Journal of Chromatography A, 891, p. 1-32. 7. Kang-Lyung Woo, Que-Chung Hwang, Hyung-Su Kim (1996), Determination of acid amins in the foods by reversed-phase high- performance liquid chromatography with a new precolumn derivative, butylthiocarbamyl acid amin, compare to the convention phenylthiocarbamyl derivatives and ion-exchange chromatography, Journal of Chromatography A, 740, p. 31-40. 8. R. Draisci, L. Giannetti, P. Boria, L. Lucentini, L. Palleschi, S. Cavalli (1998), Improved ion chromatography-integrated pulsed amperometric detection method for the evaluation of biogenic in food of vegetable or animal origin and in fermented foods, Journal of Chromatography A, 798, p. 109-116 9. Tyson, Don (1999), Metabolism and Analysis acid amins, Interpretation Guide.